不同基因型箭筈豌豆裂莢特性研究

楊 豐, 張明均, 陳 超, 郝云飛, 陸忠杰, 董 瑞

(1.貴州省草地技術試驗推廣站, 貴陽 550025; 2.貴州省畜禽遺傳資源管理站, 貴陽 550001;3.貴州大學動物科學學院, 貴陽 550025)

裂莢是指莢果在成熟期時,沿著莢皮背縫線和腹縫線開裂使種子撒播的現象[1-4]。裂莢特性廣泛存在于豆科(Leguminosae)、禾本科(Poaceae)和十字花科(Brassicaceae)等植物中[5-7],這是植物在長期進化、演變過程中形成的重要生理特性。裂莢對植物的繁衍生息、種子的傳播以及保持物種的多樣性具有十分重要的意義[8],但對種子的收獲和生產卻造成了嚴重的障礙和損失[9]。吳建禹等[10]研究發現,扁蓿豆(Melissilusruthenicus)單株在自然條件下的平均裂莢率為76.50%。胡立成[11]研究了大豆品種北娘和豐鈴,發現其裂莢率分別為95%和81%。孫東鳳和康玉凡[2]研究表明,中度裂莢的大豆品種產量減少約112.5 kg/hm2。由高裂莢率造成的“種子收獲難、買不到、用不起”的現象十分嚴重[12]。因此,對裂莢果的研究具有重大意義。

箭筈豌豆(Viciasativa)是一年生、自花授粉豆科植物[13],具有生育周期短、適應性強等特點、固氮及改善土壤結構的能力,主要用作飼草和綠肥[14]。現有的箭筈豌豆品種大部分都具有裂莢的生理特性,造成種子在收獲期前大量脫落,并在下一個生長季作為雜草出現,對種子生產及下一季作物的種植造成了嚴重影響,成為限制箭筈豌豆進一步大面積推廣使用的重要因素[15-16]。目前豆科植物裂莢的生理機制主要有兩種[17],一是裂莢與莢果內部的組織結構存在密切聯系,在自然或外部機械壓力下,造成了莢果背或腹縫線上的某一位點開裂,且腹縫線是莢果開裂的首要部位[18];二是酶調控裂莢,即通過細胞壁修飾酶對莢果離區細胞進行降解,如多聚半乳糖醛酸酶,纖維素酶等,導致離區細胞分離,產生裂莢。以上兩種機制相互聯系,共同作用導致莢果開裂。

多聚半乳糖醛酸酶(Polygalacturonase,PGs)是一種細胞壁結構蛋白[19],通過水解反應切斷果膠分子主鏈糖苷鍵的解聚酶[20],也稱為果膠酶(Pectic enzyme)、果膠解聚酶(Pectin depolymerase)[21]。在目前已明確的10個多聚半乳糖醛酸酶的晶體結構中,有8個是內切多聚半乳糖醛酸酶,只有2個屬于外切多聚半乳糖醛酸酶[22]。內切多聚半乳糖醛酸酶可隨機水解豆科植物莢果離區組織內果膠分子中的α-1,4-糖苷鍵,促進胞間層分解及細胞壁破裂,是調控裂莢的必要因子[21]。

本研究在前期工作的基礎上,篩選出了5份抗裂莢種質和5份易裂莢種質作為材料,對箭筈豌豆莢果含水量、莢果裂莢機械力和內切多聚半乳糖醛酸酶(PG)基因(VSPG1)表達量與莢果裂莢率的關系進行探討,以期了解其裂莢特性,為抗裂莢與高種子產量品種選育提供材料和數據支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本實驗所用的箭筈豌豆材料是通過前期實驗從75份種質中篩選出來的5份抗裂莢種質和5份易裂莢種質,種質詳細信息見表1。

表1 10份箭筈豌豆種質信息

1.2 試驗地概況

試驗地點位于貴州省貴陽市花溪區貴州大學實驗田(106°07′E,26°11′N,海拔1 100 m),地處貴州高原中部。該區具有明顯的高原氣候特點,屬于亞熱帶濕潤溫和型氣候。年平均氣溫14.8 ℃,年均降雨量1 347.3 mm。試驗期間貴陽市花溪區月平均降水量與月平均氣溫見圖1。

圖1 2020年10月—2021年5月試驗地氣象變化

1.3 試驗設計

試驗共進行8個月,從2020年10月到2021年5月,每個種質設3個重復。每個重復種植10個單株且種植在同一個花盆內。施肥灌水等條件相同,莢果在黃熟期進行取樣。取貴州大學西校區試驗點黃壤土過篩(2 mm)后作為種植土壤,每盆裝土約5 kg。土壤pH值為5.84,全氮655 mg/kg、全鉀26.13 g/kg、全磷0.76 g/kg、速效鉀293.33 mg/kg、有效磷4.74 mg/kg、有機碳5.68 g/kg。

1.4 莢果含水量測定

將采集到的莢果稱取30 g放入鋁盒中,3個重復。先置于干燥器中自然風干7 d,之后將盛有樣品的鋁盒置于35 ℃ 熱風干燥烘箱持續烘干6 h后稱重,計算莢果含水量[11,23]。

1.5 莢果裂莢率測定

莢果干燥方式與測定莢果含水量的干燥方法相同,將干燥后的莢果置于2 m高處,使莢果自由掉落。清點摔裂的箭筈豌豆莢果數。摔裂的莢果數除以測量的莢果總數乘以百分之百為種質裂莢率,每份種質每個重復測量50個莢果,3次重復。詳細方法請見董瑞等[24]專利。

1.6 莢果裂莢機械力測定

利用艾德堡HP-50數顯推拉力計(樂清市艾德堡儀器有限公司)測定莢果開裂時所受機械力大小。測定莢果垂直裂莢機械力時,用夾子夾住莢果中部將莢果垂直固定于推拉力計,后緩慢轉動數顯推拉力計直至莢果開裂,當莢果開裂時推拉力計可瞬時自動記錄受力的最大值。測定莢果水平裂莢機械力時將莢果水平固定于推拉力測定儀,其余操作步驟相同。每份種質每個重復測量50個莢果,3次重復。

1.7 PG酶含量動態變化分析

利用多聚半乳糖醛酸酶檢測試劑盒(北京索萊寶科技有限公司,BC2665)對各種質開花后10 d,14 d,18 d,22 d,26 d的莢果離區組織中的PG酶含量進行檢測。

1.8 VSPG1基因表達模式分析

采集開花后10 d,14 d,18 d,22 d,26 d的莢果離區組織,采用Trizol法提取總RNA 并反轉錄成cDNA備用。利用課題組前期對箭筈豌豆轉錄組測序數據中篩選出與裂莢相關的VSPG1基因,并將在箭筈豌豆轉錄組表達譜中表現相對穩定且功能尚未明確的Unigene68614作為內參基因[13]。使用Primer Premier6軟件設計基因的特異引物,引物信息見表2。qRT-PCR反應程序為:95 ℃ 3 min,95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s,45個循環。內參基因與目標基因在每個樣品中進行3次qRT-PCR,最后使用2-ΔΔCt方法計算相對基因表達水平。

表2 qRT-PCR分析的引物信息

1.9 數據分析

通過SPSS23.0統計軟件對各種質之間的機械裂莢力以及單個種質不同時間點莢果離區組織中的PG酶含量進行方差分析,對各種質的裂莢機械力和裂莢率進行相關性分析,并使用Excel2019軟件對數據進行統計和作圖。

2 結果與分析

2.1 莢果含水量

通過烘干法對10份箭筈豌豆種質的莢果含水量進行研究發現,不同種質之間的莢果含水量差異不顯著,其中,L461的莢果含水量最高,為5.170%,L29的莢果含水量最低,為4.944%(表3)。10份種質的平均莢果含水量為5.116%。同時,對不同類型箭筈豌豆的莢果裂莢率進行方差分析,發現10份種質之間的莢果裂莢率存在極顯著差異,其中L92和L29的莢果裂莢率最高,為100%,B17和B62的莢果裂莢率最低,為0(表3)。

表3 10種箭筈豌豆種質莢果含水量和莢果裂莢率

2.2 莢果裂莢機械力

莢果在水平放置狀態下莢果裂莢機械力測試方法如圖2A～圖2D所示。在抗裂莢種質中,B62這一種質的莢果裂莢機械力最大,為11.298 N,B302種質的莢果裂莢機械力最小,為7.046 N(表4)。在易裂莢種質中,L461這一種質的莢果裂莢機械力最大,為2.545 N,L92種質的莢果裂莢機械力最小,為1.708 N。值得注意的是,在水平放置狀態下莢果裂莢機械力最小的抗裂莢種質(B302)與莢果裂莢機械力最大的易裂莢種質之間(L461)裂莢機械力仍然存在極顯著差異。莢果在垂直放置狀態下莢果裂莢機械力測試方法如圖2E、F所示。在抗裂莢種質中,B302的莢果裂莢機械力最大,為26.137 N,B62的莢果裂莢機械力最小,為21.282 N。在易裂莢種質中,L461的莢果裂莢機械力最大,為8.888 N,L92種質的莢果裂莢機械力最小,為5.201 N。另外,在垂直放置狀態下莢果裂莢機械力最小的抗裂莢種質(B62)與莢果裂莢機械力最大的易裂莢種質(L461)之間裂莢機械力也存在極顯著差異。

注:A和B為垂直裂莢機械力測量時莢果放置方式;C和D為垂直放置時莢果受力開裂直到完全裂開;E為水平裂莢機械力測量時莢果放置方式;F和G為水平放置時莢果受力開裂直到完全裂開;H為推拉力計操作界面;圖中莢果開裂位置均為腹縫線部位。

表4 箭筈豌豆種質莢果水平和垂直狀態下裂莢機械力

由圖3也可以看出,無論是易裂莢還是抗裂莢種質,垂直放置時莢果裂莢機械力都顯著大于水平放置狀態時的莢果裂莢機械力,且隨著莢果裂莢率的逐漸升高,莢果裂莢機械力則呈逐漸降低的趨勢。

注;柱形上方的不同小寫字母表示存在顯著差異(p<0.05)。下同。

2.3 莢果裂莢率和莢果裂莢機械力的相關分析

進一步研究發現,箭筈豌豆的莢果水平裂莢機械力和垂直裂莢機械力都與箭筈豌豆的莢果裂莢率呈極顯著負相關。其中,垂直裂莢機械力與裂莢率之間的相關性系數為-0.986,水平裂莢機械力與裂莢率之間的相關性系數為-0.960(表5)。

表5 箭筈豌豆裂莢機械力與裂莢率之間的相關性分析

2.4 PG含量動態變化分析

在5種易裂莢種質中,莢果離區組織中的PG酶含量隨著莢果成熟天數的增加而顯著上升,且都在22 d左右時PG酶含量達到最大,在26 d左右時略微下降,但下降差異均不顯著(圖4)。在5種抗裂莢種質中,莢果離區組織中的PG酶含量同樣隨著莢果成熟天數的增加而顯著上升,且除了B17在26 d左右時PG酶含量達到最大外,其余種質均在22 d左右時PG酶含量達到最大,之后在26 d左右時略微下降,但除了B302下降差異顯著外,其余種質下降差異均不顯著(圖5)。雖然大部分抗裂莢種質和易裂莢種質莢果離區組織中的PG酶含量均是在22 d左右時達到最大,但5種抗裂莢種質莢果離區組織中最大水平時的PG酶含量顯著小于5種易裂莢種質最大水平時的PG酶含量(圖6),且僅相當于5種易裂莢種質莢果發育10～14 d時離區組織中的PG酶含量(圖4,圖5)。

圖4 5種易裂莢箭筈豌豆種質莢果發育過程中PG酶含量動態變化

圖5 5種抗裂莢箭筈豌豆種質莢果發育過程中PG酶含量動態變化

圖6 10份箭筈豌豆種質莢果發育第22天時PG酶含量對比

2.5 VSPG1基因表達模式分析

利用qRT-PCR技術分別檢測箭筈豌豆種質莢果發育10 d,14 d,18 d,22 d,26 d的調控多聚半乳糖醛酸酶表達的VSPG1基因表達量。如圖7所示,10種種質莢果離區組織中VSPG1基因表達量均在22 d左右時達到最大,在26 d左右時略微下降。這與箭筈豌豆莢果發育過程中離區組織中PG酶含量的變化趨勢一致。

圖7 10份箭筈豌豆種質莢果發育過程中VSPG1基因表達量動態變化

3 討 論

胡立成[11]研究發現,大豆的莢果含水量與裂莢率呈顯著負相關,莢果的含水量越低裂莢率越高,且當莢果的含水量小于5.00%時,莢果的裂莢率達到最大。楊德旭等[25]對國內的大豆品種進行研究發現,只有當大豆的含水量低于25.00%且豆殼的含水量在15.00%以下時,大豆才能發生裂莢。在其他科植物中,莢果的含水量對裂莢也有一定的影響,如在花生品種中花生莢果含水量為12.0%～13.5%范圍時,脫殼率最高[26]。綜上所述,在準確評估箭筈豌豆以及其他相關植物的裂莢特性之前,應先去除莢果含水量對其產生的影響。在本試驗中,對10種所試箭筈豌豆莢果材料進行自然風干和烘箱烘干共同處理,莢果的含水量都降至5.12%左右,且各種質之間的莢果含水量差異不顯著(表3),表明此時的莢果含水量已趨于穩定,可以忽略其對裂莢率以及裂莢機械力的測量所產生的影響。

莢果的裂莢機械力也常作為相關物種品種改良的目的指標之一。Davies等[27]對6個品種的油菜角果進行裂莢測試,測得A品種與E品種角果的最大機械裂莢力分別為0.58 N和5.90 N,差異極顯著。因此,認為通過育種的手段來改良油菜的裂莢特性是可行的。本實驗中,利用數顯推拉力計對10種箭筈豌豆的垂直和水平方向的裂莢機械力進行了測量。其中,當莢果垂直放置時,易裂莢種質和抗裂莢種質的平均裂莢機械力為6.79 N和24.04 N,差異顯著(表4)。當莢果水平放置時,易裂莢種質和抗裂莢種質的平均裂莢機械力為2.23 N和9.16 N,差異顯著(表4)。且通過相關性分析發現,箭筈豌豆的莢果裂莢率與垂直裂莢機械力和水平裂莢機械力都呈極顯著負相關(表5)。本研究認為,通過箭筈豌豆莢果的水平裂莢機械力以及垂直裂莢機械力的大小,可以準確地反映出箭筈豌豆裂莢率的變化。因此,可以將箭筈豌豆裂莢機械力的大小作為評價其裂莢特性的方法之一,這也與Davies等[27]的研究結果相符。本研究表明,測量箭筈豌豆莢果的裂莢機械力時,莢果的裂莢機械力大于抗裂莢種質平均裂莢機械力的種質應定義為不易裂莢種質。相反,裂莢機械力小于易裂莢種質平均裂莢機械力的種質則定義為易裂莢種質。

Agrawal等[28]對大豆莢果中的纖維素酶和多聚半乳糖醛酸酶的活性進行了檢測,發現多聚半乳糖醛酸酶主要存于莢果離區中間層。Sander等[29]在十字花科植物油菜(Brassicanapus)中鑒定到了一個PG基因(RDPG1),其啟動子活性分析結果表明,該基因主要在莢果和花藥的離區表達。Dong等[30]對大豆莢果的微觀結構進行對比發現,抗裂莢種質莢果離區組織中的纖維帽細胞數量以及細胞壁厚度遠大于易裂莢種質,因此認為莢果開裂與纖維帽細胞的發育有密切聯系。以上研究結果均表明,莢果的裂莢特性受莢果的離區組織結構影響。由于莢果的水平裂莢機械力測量時的受力部位為莢果離區組織附近,而垂直裂莢機械力測量時的受力部位則為莢果表皮。因此,本研究認為莢果的水平裂莢機械力比垂直裂莢機械力更為科學、精確。且抗裂莢種質的平均水平裂莢機械力是易裂莢種質的4.1倍,而平均垂直裂莢機械力是易裂莢種質的3.5倍(表4),可見用水平裂莢機械力來評定裂莢等級更為準確。

本研究對10份箭筈豌豆種質莢果成熟過程中離區組織中的PG酶含量的動態變化進行檢測發現,大部分種質腹縫線離區組織中的PG酶含量在22 d左右時達到最大,之后略微下降(圖4,圖5)。原因可能是莢果逐漸接近完全成熟狀態時,水分和干物質含量急劇下降導致部分PG酶發生降解。5種抗裂莢種質腹縫線離區組織中最大水平時的PG酶含量僅為5種抗裂莢種質最大水平時PG酶含量的三分之一,差異顯著(圖6)。因此,莢果接近成熟狀態時,腹縫線離區組織中的PG酶含量是決定其是否裂莢的重要因素,這也與Agrawal等[27]的研究結果一致。VSPG1通過在莢果離區細胞胞間層不斷積累致使其逐漸溶解,并最終導致胞間層的消失,其對細胞壁的修飾十分明顯[31]。除此之外,VSPG1還有葡萄糖酶協同作用來削弱莢果離區細胞的初生壁[31]。本研究中,10種種質的VSPG1基因的表達模式基本相同(圖7),且分別與各自種質莢果離區組織中的PG酶含量動態變化一致。因此,本研究認為VSPG1基因通過調控莢果離區組織中的PG酶表達從而導致裂莢。這為從基因水平出發改良和選育抗裂莢和高種子產量品種提供了新的思路。