蓖麻RcSRS家族鑒定及表達模式分析

徐興源, 李艷肖, 朱夢洋, 向殿軍, 劉 鵬

(內蒙古民族大學農學院/內蒙古民族大學科爾沁沙地生態農業國家民委重點實驗室, 內蒙古 通遼 028000)

SRS(SHI-related sequence)基因,也被稱為短節間(STY)基因,編碼植物特有的一類轉錄因子,在應對各種刺激信號的特異性反應中有著至關重要的作用。第1個SRS基因是在擬南芥(Arabidopsisthaliana)中發現的,被命名為LRP1基因[1]。SRS基因擁有2個特殊的結構域:環形鋅指結構域(C-X2-C-X7-C-X-H-X2-C-X2-C-X7-C-X2-H)[2-3]和IGGH結構域[4]。其中,環形鋅指結構域是RING結構域(C3H2C3或C3HC4)的一種,保守的RING結構域最早在動物非洲爪蟾(Xenopuslaevis)中被發現,其中有1個DNA結合基序[5],該結構域能與RNA、蛋白質等互作,參與細胞的生理和生化過程[6];而IXGH結構域是同源異構化所必需的[7]。除了這兩個保守結構域之外,其余的蛋白質是高度分化的[8]。

SRS基因在植物器官的生長[9]、心皮發育[10]和信號轉導[11]等方面均有重要作用。目前,SRS家族已在擬南芥、水稻(OryzasativaL.)、棉花(Gossypiumspp.)和大麥(HordeumvulgareL.)等不同植物中被鑒定和表征。擬南芥中有11個SRS家族成員被報道,其11個成員均擁有環形鋅指結構域和IGGH結構域,其中側根原基1(LRP1)會與SHI、SRS3和SRS6等形成復合體[4,12-14],從而影響側根和不定根原基的發育,還能影響染色質的修飾和生長素信號傳導[15]。據報道,擬南芥SRS5基因是光形態建成的正調控因子,可直接與光形態建成基因(如HY5、BBX21和BBX22)的啟動子結合,激活其表達,促進光形態建成[15-19]。

SRS家族可參與并影響植物的生物合成。如:擬南芥的STY1和STY2基因可以調節生長素的生物合成,并以劑量依賴的方式協同調控擬南芥雌蕊、雄蕊和葉片的發育[8],其中STY1基因主要在發育的雌蕊中表達[20-21]。另外,STY1基因突變后會造成雌蕊發育不良,葉片的發育也會受到影響[8,22]。

SRS家族還參與多種非生物脅迫誘導[23-24]。例如,在紫花苜蓿(Medicagosativa)的莖組織中,有27個MsSRS基因的表達受到冷脅迫和鹽脅迫的誘導,呈現出不同的表達模式,表明MsSRSs可能在冷脅迫和鹽環境下在苜蓿的莖組織中發揮作用[23]。大豆(Glycinemax)SRS家族的21個成員在干旱、鹽和外源ABA誘導下也表現出不同的表達模式,其中GmSRS18在鹽脅迫下顯著表達[24]。然而,蓖麻(Ricinuscommunis)的SRS家族成員的鑒定和相關的研究卻鮮有報道。

蓖麻是大戟科蓖麻屬植物,在工業[25]、醫藥[26]和航天[27]等諸多領域都有應用,在環境保護和修復等方面也發揮著積極作用。蓖麻適應環境能力強,在鹽堿、貧瘠和污染嚴重的環境下依然能正常生長[28-30],而SRS家族在應對低溫、鹽和干旱脅迫的過程中起著重要的作用[23-24]。本研究從蓖麻全基因組數據中檢索出蓖麻的SRS基因,并對篩選出的蓖麻SRS基因進行系統的生物信息學分析。根據課題組在蓖麻轉錄組數據中檢索出的RcSRS基因FPKM表達值,分析其在不同環境脅迫下的表達模式,為后續深入研究RcSRS基因在蓖麻中的功能提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 蓖麻SRS家族成員篩選與理化性質分析

從油料作物數據庫(http://oilplants.iflora.cn/)獲取蓖麻的基因組序列文件、蛋白質序列文件和基因組注釋文件。在Rice Geneme Annotation Project 數據庫(http://rice.uga.edu/)中獲得的日本晴水稻SRS基因家族蛋白質序列作為靶標序列進行本地Blastp比對;并使用hmmer軟件,以PF05142模型檢索出含有該結構域的蛋白質序列。結合BLASTP和hmmer的結果,刪除冗余序列后將獲取的蛋白序列上傳到NCBI-CD SEARCH 和SMART(https://smart.embl-heide-lberg.de/)網站,確保所篩選的蓖麻SRS蛋白質序列準確,最終得到5個蓖麻RcSRS家族成員。蓖麻RcSRS家族成員的理化性質分析在ExPASy網站 (https://web.expasy.org/)完成。用WoLF PSORT(https://wolfpsort.hgc.jp/)來預測RcSRS的亞細胞位置。RcSRS蛋白質的磷酸化位點預測在NetPhos3.1 (https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetPhos-3.1)網站完成。

1.2 蓖麻RcSRS家族成員的高級結構分析

RcSRS蛋白質的二級和三級結構預測分別使用SOPMA (https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgibin/npsa_automat.pl? page=npsa_sopma.html)和SWISS-MODEL(https://www.swissmodel.expasy.org/)在線網站完成,再由SAVES v6.0(https://saves.mbi.ucla.edu/)在線工具對三級結構模型進行打分。

1.3 蓖麻RcSRS家族成員系統進化和基因結構分析

使用MEGA11.0軟件對RcSRS蛋白質進行進化樹的構建。使用MEME(https://meme-suite.org/meme/doc/meme.html)在線軟件預測RcSRS蛋白質的保守基序,最大Motif數量設置為10,其他參數默認。使用TBtools軟件完成基因結構和保守基序的可視化。

1.4 蓖麻RcSRS家族在染色體上的定位和共線性分析

利用TBtools軟件提取出RcSRS家族成員在染色體上的位置信息和共線性關系信息,最終使用Advanced Circos程序可視化結果。

1.5 蓖麻RcSRS啟動子的順式作用元件分析

先從蓖麻的基因組中獲取RcSRS基因轉錄起始上游1 500 bp的序列,提交至PlantCare(https://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)預測RcSRS啟動子順式作用元件的組成。

1.6 蓖麻與日本晴水稻物種間SRS蛋白質的聚類分析

把日本晴水稻的OsSRS蛋白質序列和蓖麻的RcSRS蛋白質序列整合到同一個文件中,然后用MEGA11.0軟件構建進化樹,將結果提交到iTol(https://itol.embl.de)工具中進行美化處理。

1.7 蓖麻RcSRS家族成員的表達模式分析

以蓖麻品種“通篦5號”為試驗材料,選取籽粒飽滿,大小、光澤和斑紋一致的蓖麻籽種子。后續種子的培養,植株的脅迫處理,總RNA的提取,cDNA文庫的構建等參照李艷肖等[31]的方法。從RNA-Seq數據中篩選出RcSRS基因的脅迫表達量數據;并下載Brown等[32]蓖麻的RNA-Seq原始數據,經質控后篩選出RcSRS基因的組織表達量數據。將上述最終得到的脅迫表達量數據和組織表達量數據提交到TBtools軟件進行熱圖可視化處理。

2 結果與分析

2.1 蓖麻RcSRS家族成員信息和理化性質分析

根據基因在染色體上的位置,把從蓖麻中篩選到的5個RcSRS家族成員依次命名為RcSRS1、RcSRS2、RcSRS3、RcSRS4、RcSRS5,并對其蛋白質進行基本理化性質分析(表1)。RcSRS蛋白質的氨基酸數量為199～350個;分子質量為22.11～37.87 kD;理論等電點在6.65～9.20之間,除了RcSRS3外均是堿性蛋白質(pI>7);脂肪酸介于47.97～61.54之間;除RcSRS1之外,其余均是不穩定性蛋白質;RcSRS蛋白質為親水性蛋白質;RcSRS蛋白質的亞細胞預測結果顯示,定位于細胞核的有4個(RcSRS2、RcSRS3、RcSRS4、RcSRS5)、定位于細胞膜的有1個(RcSRS1)。

表1 蓖麻RcSRS家族成員的基本信息

RcSRS蛋白質的磷酸化位點預測結果(圖1)表明,潛在的絲氨酸磷酸化位點數為12～30個,蘇氨酸磷酸化位點數目為8～17個,酪氨酸磷酸化位點數為2～5個。

圖1 蓖麻RcSRS蛋白質的磷酸化位點

2.2 蓖麻RcSRS家族成員的高級結構分析

RcSRS蛋白質的二級和三級結構預測結果(表2,圖2)顯示,RcSRS蛋白質主要以不規則卷曲為主,除RcSRS1外,其余RcSRS蛋白質均無β折疊結構;SAVES v6.0 模型檢測結果(圖2右)顯示,RcSRS1、RcSRS2和RcSRS3蛋白質的氨基酸殘基中有66.7%位于core區域,22.2%位于次允許區域;編碼RcSRS4和RcSRS5蛋白的氨基酸殘基中有57.1%位于core區域,28.6%位于次允許區域,表明RcSRS蛋白質的三級結構模型構建結果合理。

注:左為蛋白質的三級結構預測;右為蛋白質的三級結構檢測。

表2 蓖麻RcSRS蛋白質的二級結構

2.3 蓖麻RcSRS家族成員系統進化、保守基序和基因結構分析

進化樹結果(圖3)表明,5個蓖麻RcSRS蛋白被聚為3組。其中RcSRS2和RcSRS3在類群Ⅰ中,RcSRS4在類群Ⅱ中,RcSRS1和RcSRS5則在類群Ⅲ中。保守基序預測結果顯示,RcSRS蛋白質的保守基序的種類和數目均不相同,其中RcSRS1和RcSRS5基序數目最少,均有4個;RcSRS2和RcSRS3的保守基序數目最多,均有8個。基因結構預測結果顯示,RcSRS基因結構較為簡單,僅RcSRS5含有3個外顯子,RcSRS1、RcSRS2、RcSRS3、RcSRS4均僅有2個外顯子,說明RcSRS基因在結構上具有保守性。

圖3 蓖麻RcSRS家族成員系統進化和基因結構分析

2.4 蓖麻RcSRS家族在染色體上的定位和共線性分析

圖4結果表明,蓖麻RcSRS基因分布在4條染色體上,其中Chr7上擁有兩個RcSRS基因。RcSRS家族成員存有3對共線性關系,分別是RcSRS2～RcSRS3、RcSRS2～RcSRS5和RcSRS3～RcSRS5,說明RcSRS基因在進化過程中存在基因間的復制現象。

圖4 蓖麻RcSRS家族在染色體上的定位和共線性分析

2.5 蓖麻RcSRS家族順式作用元件分析

對RcSRS啟動子區域的順式作用元件進行預測,結果(圖5)表明,RcSRS擁有多個與逆境脅迫響應、防御反應和應激反應等相關的順式作用元件。其中RcSRS2的順式作用元件數量和種類都是最多的;光響應元件在RcSRS啟動子中數量最多,說明光在RcSRS基因表達調控的過程中發揮著重要作用;RcSRS4除了光響應元件外僅有1個厭氧誘導相關元件,說明不同的RcSRS基因對逆境脅迫和激素處理的應答模式存有差異;另外,RcSRS2、RcSRS3、RcSRS5啟動子中都含有干旱脅迫響應元件,說明它們可能均響應干旱脅迫。RcSRS的順式作用元件分析說明,RcSRS家族基因在調控蓖麻的生長和發育以及在脅迫響應等方面均起著重要的調控作用。

圖5 蓖麻RcSRS家族順式作用元件分析

2.6 蓖麻與日本晴水稻SRS家族成員間的聚類分析

蓖麻(5個)與日本晴水稻SRS(5個)家族成員的聚類結果(圖6)表明,10個SRS蛋白質被聚為三類(類群Ⅰ～類群Ⅲ)。每個亞家族的SRS成員數不等,RcSRS蛋白質只分布于類群Ⅰ和類群Ⅲ中,在類群Ⅲ中分布最多(有3個),分別是RcSRS2、RcSRS3、RcSRS5,在類群Ⅰ中分布最少(只有2個),分別是RcSRS1和RcSRS5。以上結果表明,RcSRS和OsSRS在進化關系上比較近,有較高的同源性。

圖6 蓖麻與日本晴水稻SRS家族成員間的聚類分析

2.7 蓖麻RcSRS家族成員的表達模式分析

2.7.1蓖麻RcSRS家族成員在不同組織中的表達模式分析

蓖麻RcSRS基因的表達模式分析(圖7)表明,RcSRS1基因在胚乳、萌芽的種子、葉片中都表達;RcSRS5基因在雄花中表達水平最高,表明RcSRS5基因可能參與并影響雄花的發育;RcSRS2、RcSRS3、RcSRS4基因在不同組織的表達量都很低或不表達。綜上,RcSRS基因擁有組織表達的特異性。

圖7 蓖麻RcSRS基因在不同組織器官中的表達分析

2.7.2蓖麻RcSRS家族成員在非生物脅迫下的表達分析

蓖麻RcSRS家族成員的非生物脅迫表達分析(圖8)顯示,在干旱脅迫和鹽脅迫處理下只有4個基因表達,分別是RcSRS1、RcSRS2、RcSRS4、RcSRS5,其中RcSRS5在干旱脅迫和鹽脅迫處理下12 h和24 h的表達量較0 h處理下呈上調表達模式。在低溫脅迫處理下只有3個基因表達,分別是RcSRS1、RcSRS2、RcSRS3,他們在低溫脅迫處理下12 h和24 h的表達量較0 h處理下均呈下調表達模式。綜上,RcSRS基因在蓖麻抵御非生物脅迫過程中具有重要作用。

注:0,12和24代表非生物脅迫時長,灰色表示未檢測到。

3 討 論

SRS基因在進化的過程中發生了變化,不同物種中SRS基因的數量不盡相同,在擬南芥[2]、蘋果[30]和陸地棉[34-35]中分別含有11,11,27 個成員。本研究在蓖麻中共鑒定到5個RcSRS成員,除RcSRS1之外,其余編碼的蛋白質均是不穩定性蛋白;不同的RcSRS家族成員所編碼的蛋白質理化性質均存在差異,可以推測出他們在植物體內的功能也不盡相同;對基因結構分析表明,位于同一亞家族的基因家族成員具有相似的基因結構,說明同一類群的成員具有相近的進化關系或功能;對水稻和蓖麻的SRS蛋白質進行發育樹分析,結果顯示,RcSRS蛋白質成員只在類群Ⅰ和類群Ⅱ,表明該家族在進化過程中較為保守,同一聚類中的成員在進化上同源,在結構上表現出相似性。

He等[36]研究發現,SRS家族在葉和花的生長和發育過程中起著重要的作用。在藜麥(Chenopodiumquinoa)中,除CqSRS08外所有的CqSRSs基因在花中都高表達,CqSRS08則只在葉片中高表達[19]。在擬南芥中,STY1和STY2在花的發育階段高表達,可以通過調節生長素合成的方式來影響雌蕊的發育,并影響柱頭的形成[8,15]。蓖麻RcSRS家族的不同組織和器官中的表達分析發現,RcSRS家族成員主要在葉和花中高表達,這與張雪等[34]和趙坤宇,陳甜甜[35]在棉花中的研究結果相一致。在擬南芥中,SRSs已經被證明在葉和花的生長發育中起到了關鍵的調控作用[8]。RcSRSs在葉和花中的表達遠高于其他組織,表明RcSRS主要參與了葉和花的生長和發育。

Ma等[37]研究表明,在植物抵御非生物脅迫的過程中,SRS家族基因同樣起著重要的作用。在蘋果中,11個SRS成員在鹽脅迫、ABA脅迫下均有明顯響應[34]。在白香草木樨(Melilotusalbus)中有39個MaSRS基因含有ABRE作用元件,其與植物耐鹽脅迫密切相關,其中MaSRS4和MaSRS32在鹽脅迫下相對表達量均高于未處理的植株,在低溫脅迫下表達量較低,而MaSRS48在低溫下則顯著表達[38]。在蓖麻研究中發現,RcSRS1在低溫脅迫下下調表達,表明該基因可能在蓖麻抵御低溫脅迫的過程中發揮作用,可作為后續研究RcSRS家族基因在蓖麻抵御低溫脅迫作用中的候選基因。分析發現RcSRS1在啟動子順式作用元件中含有較多的光響應元件,其在低溫脅迫下的下調表達情況可能與之相關,這與李艷肖等[31]的研究結果相一致。綜上可以看出,RcSRSs基因能響應非生物脅迫,但其作用機理尚不明確,還待進一步研究。