六味地黃湯對PMOP模型大鼠股骨MAPK通路動態干預研究

譚佳穎 王璐 黃雍 龍瓊 黃莉 肖望重 龍群賡 朱茜茜 戴冰

湖南中醫藥大學第一附屬醫院,湖南 長沙 410007

絕經后骨質疏松癥( postmenopausal osteoporosis,PMOP ) 是由于絕經后婦女卵巢功能衰退,體內雌激素波動性下降,成骨細胞(osteoblast,OB)增殖分化能力降低,使骨代謝紊亂、骨量丟失、骨密度(bone mineral density,BMD)下降、骨骼脆性增加所致[1]。中醫將PMOP歸屬“骨痿”范疇,中醫藥治療以補腎為主[2],經典補腎名方六味地黃湯臨床防治PMOP取得較好療效[3],這可能與升高絕經女性E2水平[4],或抑制骨吸收[5],提升骨密度[6]相關。本課題組前期發現該湯能升高血清雌二酮(E2)水平[7-9],調控MAPK通路中 p38 及 ERK1/2 兩個蛋白,進而升高BMD,干預PMOP,但二者是否通過蛋白磷酸化發揮信號傳遞作用尚不明確。

因此,本研究通過研究山茱萸酒制前后配方入六味地黃湯對PMOP模型大鼠術后30、60、90 d股骨MAPK信號通路中p38及ERK1/2磷酸化蛋白(p-p38及p-ERK1/2)及mRNA表達的影響,探討山茱萸酒制前后配方入該湯對MAPK通路的動態干預作用,旨在了解MAPK通路中p38及ERK1/2蛋白發生磷酸化后干預PMOP的生物學功能和機理,以及六味地黃湯干預前后對其磷酸化水平變化規律的影響;以期進一步從分子水平上解析PMOP的發生發展規律,為臨床上應用明確六味地黃湯防治PMOP提供一定的實驗依據。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1動物:6～8 月齡未孕雌性 SD 大鼠(SPF 級)90只,購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司,許可證號:SCXK(湘)2019-004,分籠飼養于湖南中醫藥大學實驗動物中心。本實驗經過湖南中醫藥大學實驗動物倫理委員會批準且符合指導原則,倫理編號LLBH-202110290002。

1.1.2試藥:熟地黃、山藥、山茱萸、丹皮、澤瀉、茯苓均購于湖南春可回中藥飲片有限公司,由湖南中醫藥大學第一附屬醫院張裕民教授鑒定,阿侖膦酸鈉片購于云南萬裕藥業有限公司,國藥準字號:J20130085。

1.1.3儀器:電泳儀(美國Bio-Rad);超靈敏多色熒光成像分析系統(美國protein simple公司);高速冷凍離心機(賽默飛世爾科技);制冰機(常熟市學科電器有限公司);核酸蛋白濃度測定儀(NanoDrop);CFX-connect 96熒光定量PCR儀(美國Bio-Rad);搖擺式脫色搖床(杭州佑寧儀器有限公司);超低溫冰箱(賽默飛世爾科技);超純水機(埃爾格)。

1.1.4試劑:蛋白酶抑制劑(康為世紀,批號:DU2200S);磷酸酶抑制劑(康為世紀,批號:CW2383S);p-p38一抗(Proteintech,批號:28796-1-AP);p-ERK1/2一抗(Proteintech,批號:28733-1-AP);β-actin(Proteintech,批號:66009-1-lg);二抗(成都正能生物有限公司,批號:KK1028);0.45 μm PVDF膜(Biosharp 批號:BS-PVDF-45);超純總RNA提取試劑盒(批號:20211153);cDNA反轉錄試劑盒(批號:05227808);NovoStart SYBR qPCR SuperMix Plus(批號:05256502)。

1.2 方法

1.2.1試藥的制備:①酒制山茱萸[10]:取適量生山茱萸飲片,用16 % 黃酒拌勻,悶潤 30 min后,隔水蒸 360 min,取出,室溫干燥后即得紫黑色或者黑色酒茱萸飲片。②六味地黃湯的制備:取熟地黃 24 g,酒茱萸或生茱萸、山藥各 12 g,牡丹皮、澤瀉、茯苓各 9 g,用 6 倍量純凈水浸泡 30 min后,煎煮兩次,每次30 min,過濾合并后濃縮,得到生藥濃度為 1.125 g/mL的藥液,放置于4 ℃冰箱保存備用。

1.2.2分組及造模:所有大鼠編號、稱重后用隨機數字表法隨機分為 5 組,即假手術組,模型組,陽性藥物組(阿侖膦酸鈉片),六味地黃湯生茱萸[六(生)]組和六味地黃湯酒茱萸[六(酒)]組。適應性喂養7 d,禁食不禁水 24 h,行切除雙側卵巢術,麻醉大鼠,于雙側肋后緣切縱形切口,摘除雙側梅花狀卵巢。假手術組僅切除卵巢周圍的部分脂肪組織。術后連續 3 d 肌肉注射 10 萬單位青霉素鉀。術后 24 h,大鼠恢復正常飲食。

1.2.3給藥:于術后第 5 d 開始給藥,陽性藥物組(6.3 mg/kg),六(生)組(6.75 g/kg)和六(酒)組(6.75 g/kg)分別灌胃給藥相應的劑量藥物,假手術組及模型組大鼠給予等體積水灌胃(煎藥用水),每日1次,連續 90 d。給藥后每周測量一次體重,并根據各組大鼠體質量調整給藥量。

1.2.4取材:5 個實驗組分別于術后 30、60、90 d 分批隨機取大鼠 6 只,禁食不禁水24 h,稱重后麻醉,用碘附消毒手術部位,脫毛開腹,剝離大鼠兩側股骨(保留骨膜)。

1.2.5指標檢測:①PMOP 模型大鼠BMD 值測定:取PMOP模型大鼠左側股骨,用紗布完全包裹好后放置于離心管中,由湖南中醫藥大學第一附屬醫院骨密度室測量。②Western blot 檢測PMOP 模型大鼠股骨組織 p-p38和p-ERK1/2蛋白表達:取大鼠骨組織碎片,加入冷藏保存的組織蛋白裂解液,充分勻漿后冰上裂解 30 min,4 ℃、14 000 r/min 離心15 min,取上清,檢測總蛋白含量。配制上樣緩沖液后,100 ℃加熱 10 min后上樣。10 % SDS-PAGE凝膠60V電泳30 min,隨后80V電泳至溴酚藍跑到凝膠底部即停,200 mA冰上轉膜1 h后,5 % 脫脂奶粉室溫封閉 70 min,放置4 ℃冰箱孵育一抗[p-p38 (1∶4 000稀釋),p-ERK1/2 (1∶5 000稀釋),β-actin (1∶7 000稀釋)]過夜,室溫孵育二抗[羊抗兔(p-p38 、p-ERK1/2)或羊抗鼠(β-actin),均為1∶5 000稀釋] 1 h,顯影。膠片經Image Lab掃描儀掃描后獲得圖像。用Image J軟件計算各蛋白條帶的灰度比值(p)。③RT-qPCR 檢測PMOP 模型大鼠股骨組織中p38 mRNA、ERK1/2 mRNA 表達:取出凍存股骨,低溫下研磨,按試劑盒說明提取總 RNA,檢測各組總 RNA 純度和濃度后,濃度調至一致。使用cDNA反轉錄試劑盒擴增為 cDNA(反轉錄條件:75 ℃ 30 min,55 ℃ 15 min)。各基因引物序列見表 1。RT-qPCR擴增體系為20 μL:cDNA 5 μL,上下游引物各0.3 μL,SYBR qPCR SuperMix Plus 10 μL,加RNase-free dd H2O至 20 μL。擴增程序為:預變性:95 ℃ 60 s,變性:95 ℃ 20 s,退火:55 ℃ 20 s,延伸:72 ℃ 30 s,40 個循環。擴增反應在Bio-Rad CFX PCR儀上執行。以 β-actin 為內參,通過 2-ΔΔCt法計算各組 p38 mRNA和ERK1/2 mRNA的相對表達量。

1.3 統計學處理

表1 各基因序列引物Table 1 Primers for Each Gene Sequence

2 結果

2.1 絕經后骨質疏松癥模型大鼠的評價

與假手術組比較,模型組術后60、90 d的 BMD 值降低(P<0.01),提示術后60、90 d后模型大鼠BMD 值與假手術組比較,骨量降低,表明術后60、90 d后造模成功。見表2。

表2 PMOP 模型大鼠術后30、60、90 d BMD值

2.2 六味地黃湯對PMOP 模型大鼠術后 30、60、90 d 股骨中 p38 mRNA、p-p38蛋白表達的影響

與模型組比較,六(生)組和六(酒)組大鼠術后90 d股骨中 p38 mRNA,p-p38蛋白表達升高,差異具有統計學意義(P<0.05,P<0.01);六(酒)組大鼠術后30、60 d股骨中 p38 mRNA 表達升高及術后60 d股骨中p-p38蛋白表達升高差異均具有統計學意義(P<0.01)。提示六(生)和六(酒)均可上調術后90 d模型大鼠股骨p38 mRNA、p-p38蛋白表達,六(酒)還可上調術后30、60 d模型大鼠股骨中 p38 mRNA 表達及術后60 d股骨中p-p38蛋白表達。表明六(生)和六(酒)均可在上調絕經晚期PMOP模型大鼠股骨中p38 mRNA、p-p38蛋白表達,調節BMD,改善PMOP,且后者在絕經早、中期上調p38 mRNA及絕經中期上調p-p38蛋白表達。見表3、圖1。

注:K:假手術組;M:模型組;Y:陽性藥物組;LS:六(生)組;LJ:六(酒)組。圖1 六味地黃湯干預PMOP模型大鼠術后30、60、90 d股骨中p-p38及p-ERK1/2的蛋白表達的影響Fig.1 Effect of Liuwei Dihuang Tang on the protein expression of p-p38 and p-ERK1/2 in the femur of PMOP model rats at 30, 60, and 90 days after surgery

表3 六味地黃湯對PMOP 模型大鼠術后 30、60、90 d 股骨中 p38 mRNA、p-p38蛋白表達的影響

2.3 六味地黃湯對PMOP 模型大鼠術后 30、60、90 d 股骨中ERK1/2 mRNA、p-ERK1/2 蛋白表達的影響

與模型組比較,六(生)組和六(酒)組模型大鼠術后90 d股骨中ERK1/2 mRNA、p-ERK1/2蛋白及術后30、60 d模型股骨中p-ERK1/2蛋白升高且差異有統計學意義(P<0.01),六(酒)組大鼠術后30、60 d股骨中ERK1/2 mRNA表達量明顯增加(P<0.05,P<0.01)。提示六(生)和六(酒)均可上調術后9 0 d模型大鼠股骨p-ERK1/2、ERK1/2 mRNA表達及術后30、60 d模型大鼠股骨ERK1/2 mRNA表達,后者還可上調術后30、60 d模型大鼠股骨p-ERK1/2蛋白表達。表明六(生)和六(酒)均可在絕經晚期上調p-ERK1/2和ERK1/2 mRNA表達及絕經早、中期ERK1/2 mRNA表達,后者還可上調p-ERK1/2蛋白表達,從而調節BMD,改善PMOP。見表4、圖1。

表4 六味地黃湯對PMOP 模型大鼠術后 30、60、90 d 股骨中ERK1/2 mRNA、p-ERK1/2 蛋白表達的影響

3 討論

PMOP模型常采用切除動物雙側卵巢法(去卵巢法)造模[11-12],SD大鼠因其去卵巢后雌激素水平下降及骨代謝等與臨床上PMOP癥狀極為相似[13],且因其穩定性和重復性較好,為建立PMOP模型的常用動物之一[14]。較多學者僅選擇PMOP術后90 d這一個時間點為其造模周期進行研究[15,17-18],而部分學者也僅選擇術后30 d或60 d中一個時間點[19-22]造模。究竟何種造模周期為佳?目前尚未規范。本實驗通過研究PMOP模型大鼠術后30、60、90 d的骨密度值,發現術后60、90 d 的骨密度值顯著下降,可見該大鼠術后60、90 d均可成模,此發現可為PMOP大鼠模型的造模周期規范化提供一定的實驗依據,尤其是術后60 d的造模時間可縮短造模周期并節約實驗成本。

絕經后骨質疏松癥的發病機制與絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信號通路(MAPK通路)密切相關[23]。MAPK通路有3個亞族:p38 MAPK ( p38)、細胞外信號調節激酶(ERK1/2)、c-Jun N-末端激酶 (JNK),其中 p38 和 ERK1/2 均通過蛋白的磷酸化修飾(蛋白磷酸化)即mRNA被翻譯成蛋白后,對其氨基酸殘基進行的磷酸化修飾,變成能發揮生物活性的成熟蛋白[24-25],從而激活經典三級激酶模式,激活成骨相關因子如Runt相關轉錄因子2(Runx2)實現信號的傳遞,從而調控OB生長、增殖、凋亡等過程[26-27],調節BMD,干預PMOP。本研究發現六味地黃湯通過調控MAPK通路中 p38 及 ERK1/2 兩個蛋白,使其均發生蛋白磷酸化,從而激活成骨相關因子,干預PMOP。但是否還通過激活該通路中的JNK蛋白還有待進一步研究。

山茱萸為六味地黃湯中臣藥,含有改善PMOP藥效物質成分[28-30],然山茱萸炮制品較多,最早記載六味地黃方的《小兒藥證直決》中以生茱萸入方,2010—2020 共計3版的《中國藥典》卻均以酒茱萸入方。課題組前期研究發現[31-32],不同炮制山茱萸入方的六味地黃湯作用效果不盡相同,以酒茱萸、蒸茱萸為佳。本研究發現,六(酒)可上調PMOP術后 30、60、90 d模型大鼠股骨中 p-p38、p-ERK1/2及ERK1/2 mRNA表達以及術后 60、90 d 模型大鼠股骨p38 mRNA表達,而六(生)僅能調整術后 90 d 模型大鼠股骨中p-p38及p-ERK1/2及 mRNA 表達及術后 30、60 d 模型大鼠股骨中 p-ERK1/2 表達。研究[32-35]發現,PMOP模型大鼠術后30、60、90 d的骨密度變化與女性絕經早、中、晚期具有一定的相似性;故山茱萸、酒茱萸分別入方的六味地黃湯均可有效延緩PMOP的發生發展,其中六(酒)從絕經早、中期便開始起效,并穩定至絕經晚期,而六(生)則主要在絕經晚期發揮作用,六(酒)作用較優于六(生)可能與本課題組前期研究[9]發現六(酒)中5-羥甲基糠醛、沒食子酸含量增加有關。該研究可為六味地黃湯多靶點干預PMOP發生發展以及2020版《中國藥典》選用酒茱萸配方入六味地黃湯提供一定的實驗和理論依據。