骨碎補總黃酮抑制Notch1/Hes1/Prdx1通路對骨質疏松大鼠抗氧化能力的影響

魯林 方虹

1. 武漢市中醫醫院,湖北 武漢 430000

2. 湖北省中醫院,湖北 武漢 430000

絕經后骨質疏松癥(postmenopausal osteoporosis,PMOP)是一種與雌激素缺乏相關的退行性疾病,其典型特征是骨量吸收增加,骨量減少和骨強度不足[1]。PMOP通常發生在絕經后的10到15年內[2]。PMOP的主要并發癥是增加脆性骨折的可能性[3]。雌激素替代療法對PMOP是有效的,但容易引起多種疾病,效果并不理想[4]。因此,尋找新的治療PMOP的藥物迫在眉睫。

骨碎補總黃酮(total flavonoids of rhizoma drynariae,TFRD)是骨碎補根莖中的主要成分,常用于治療老年性骨質疏松[5]。臨床研究發現,TFRD能夠通過提高骨密度和改善骨結構等方式來治療卵巢切除所致的骨質疏松[6-7],但其機制仍不清楚。氧化應激能夠促進成骨細胞凋亡和破骨細胞的增殖和分化等,在骨質疏松中發揮重要作用。研究表明,Notch信號通路參與氧化應激反應的調節,且Notch信號通路及其與ROS相關的信號串擾與骨質疏松癥的發生發展密切相關[8-9]。前人研究發現,TRFD可以調控Notch1及其下游靶點發狀分裂相關增強子1(hairy and enhancer of split 1,Hes1)的表達來改善骨質疏松,而高水平的ROS能夠上調Notch1[10]。因此,本研究假設TRFD可能通過Notch1介導的抗氧化反應和ROS介導的氧化應激反應發揮防治骨質疏松的作用。為驗證上述假設,本研究通過構建去卵巢(ovariectomized,OVX)骨質疏松大鼠模型,并使用TRFD干預治療,研究Notch1通路表達水平和氧化應激水平的變化,明確TRFD對OVX骨質疏松的作用機制,為其臨床應用提供參考依據。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物:SPF級7周齡雌性SD大鼠,共36只,來源于湖南斯萊克景達。于SPF級條件下飼養,飼養溫度22～26 ℃,相對濕度50 %～60 %,明暗人工光照各12 h。實驗動物使用許可證號:SYXK(鄂)2018-0104,本研究經武漢華聯科生物技術有限公司倫理審查委員會批準(HLK-20220821-001)。

1.1.2試劑:骨碎補黃酮(Z20030007)購于北京岐黃醫藥股份有限公司,補佳樂(戊酸雌二醇片)(523A)購于拜耳醫藥保健有限公司廣州分公司,HE染色試劑盒(G1120)、DAB顯色試劑盒(DA1010)購于北京Solarbio公司,SOD(A001-3-1)和MDA(A003-1-1)檢測試劑盒購于南京建成生物工程研究所,ROS檢測試劑盒(BB-475015)購自上海貝博生物,OPG(PAB33195)、BMP-2(PAB30060)、Notch1(PAB35376)、Hes1(PAB37469)、Prdx1(PAB40094)和GAPDH一抗(PAB36269)及HRP標記的山羊抗兔二抗(SAB43714)購于武漢Bioswamp公司,免疫組化試劑(63707)購于美國CST公司。

1.2 方法

1.2.1卵巢摘除術致骨質疏松大鼠模型構建:大鼠麻醉后,將四肢和頭部仰臥固定于手術臺上,用剪刀腹部正中切口,暴露卵巢,進行雙側卵巢摘除術,手術結束后,按照4萬U/d的劑量向大腿肌肉中注射青霉素鈉,連續注射3 d。繼續飼養8周后成模。假手術組僅切除腹部與卵巢等重量的脂肪。

1.2.2實驗分組及處理:將36只SD大鼠隨機分成假手術組(Sham)、去卵巢組(OVX)、骨碎補總黃酮組(TFRD)和補佳樂組(BJL)。Sham組切除腹部與卵巢等重量的脂肪;OVX組卵巢摘除術造模;TFRD組卵巢摘除術術后第7 d開始給藥,每天上午按108 mg/(kg·d)的劑量灌胃1次骨碎補總黃酮,連續12周[11];BJL組卵巢摘除術術后第7 d開始給藥,每天上午按0.21 mg/(kg·d)的劑量灌胃1次補佳樂,連續12周[12]。結束后,稱重,收集血清,處死大鼠,截斷股骨,用刮匙刮取斷面處骨組織進行病理檢測,其他約取0.5 g儲存在-80 ℃備用。

1.2.3HE染色觀察股骨組織形態學變化:4 %多聚甲醛固定股骨組織,脫鈣后進行石蠟包埋,切取厚度約3 μm的切片,按照HE染色步驟進行染色,顯微鏡下觀察并拍照。采用Luo等[13]的方法進行病理評分。

1.2.4免疫組織化學染色檢測股骨組織中OPG和BMP-2的表達:將大鼠股骨組織切片脫蠟至水,進行抗原修復18 min,3 % H2O2孵育10 min,滴加OPG(1∶100)、BMP-2(1∶50)一抗,4 ℃孵育過夜,加入二抗(1∶100),37 ℃孵育60 min,DAB染色,有顏色變化后停止染色,蘇木精復染,染色時控制染色程度,梯度酒精脫水,置于二甲苯中透明3 min×2次,中性樹膠封片,顯微鏡下觀察OPG和BMP-2的陽性表達,并拍照。

1.2.5生化試劑盒檢測血清中SOD、MDA和ROS的水平:取上清液,嚴格按照試劑盒說明書步驟進行操作,檢測各組大鼠血清中SOD、MDA和ROS水平變化。

1.2.6Westernblot檢測股骨組織中Notch1、Hes1、Prdx1蛋白的表達:股骨組織用裂解液充分裂解,離心取上清,進行蛋白質定量,SDS-PAGE電泳分離蛋白,轉膜,5 %脫脂奶粉室溫封閉過夜,加入Notch1、Hes1、Prdx1和GAPDH(均1∶1 000)抗體,室溫孵育1 h,洗膜3次后,加入二抗(1∶20 000),室溫孵育1 h,ECL顯影,TANON GIS軟件讀取條帶灰度值。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 骨碎補總黃酮對去卵巢骨質疏松大鼠體重的影響

各組大鼠給藥結束后體重結果見圖1。與Sham組相比,OVX組大鼠體重顯著升高(P<0.01);與OVX組相比,TFRD組和BJL組大鼠體重均顯著降低(P<0.01)。

注:與Sham組比較,**P<0.01;與OVX組比較,##P<0.01。圖1 各組大鼠體重的比較Fig.1 Comparison of body weight of rats in each group

2.2 骨碎補總黃酮對去卵巢骨質疏松大鼠骨組織形態學的影響

HE染色結果見圖2。Sham組大鼠股骨形態結構完整,骨小梁間隙較小且無斷裂現象;而OVX組大鼠股骨形態結構不完整,骨小梁丟失、斷裂嚴重,骨小梁間距增大,與Sham組比較病理評分顯著升高(P<0.01);與OVX組相比,TFRD組和BJL組大鼠骨小梁間距減小,斷裂現象也減少,病理評分均顯著降低(P<0.01)。

注:與Sham組比較,**P<0.01;與OVX組比較,##P<0.01。圖2 各組大鼠股骨組織HE染色結果(200×)Fig.2 HE staining results of femur tissue of rats in each group(200×)

2.3 骨碎補總黃酮對去卵巢骨質疏松大鼠股骨組織中OPG和BMP-2表達的影響

免疫組化檢測結果見圖3。與Sham組相比,OVX組股骨組織中OPG和BMP-2的陽性表達顯著降低(P<0.01);與OVX組相比,TFRD組和BJL組股骨組織中OPG和BMP-2的陽性表達均顯著升高(P<0.01)。

注:與Sham組比較,**P<0.01;與OVX組比較,##P<0.01。圖3 各組大鼠股骨組織中BMP-2(A)和OPG(B)表達情況的比較Fig.3 Comparison of the expression of BMP-2 (A) and OPG (B) in femur tissue of rats in each group

2.4 骨碎補總黃酮對去卵巢骨質疏松大鼠血清中MDA、SOD和ROS水平的影響

生化試劑盒檢測結果見圖4。與Sham組相比,OVX組大鼠血清中MDA和ROS水平顯著升高(P<0.01),SOD水平顯著降低(P<0.01);與OVX組相比,TFRD組和BJL組大鼠血清中MDA和ROS水平均明顯降低(P<0.01),SOD水平均明顯升高(P<0.01)。

注:與Sham組比較,**P<0.01;與OVX組比較,##P<0.01。圖4 各組大鼠血清中MDA、SOD和ROS水平的比較Fig.4 Comparison of serum levels of MDA, SOD and ROS in each group

2.5 骨碎補總黃酮對去卵巢骨質疏松大鼠股骨組織中Notch1-Hes1-Prdx1通路相關因子表達的影響

Western blot檢測結果見圖5。與Sham組相比,OVX組大鼠股骨組織中Notch1、Hes1、Prdx1蛋白表達水平均顯著升高(P<0.01);與OVX組相比,TFRD組和BJL組大鼠股骨組織中Notch1、Hes1、Prdx1蛋白表達水平均顯著降低(P<0.01)。

注:與Sham組比較,**P<0.01;與OVX組比較,##P<0.01。圖5 各組大鼠股骨組織中Notch1、Hes1和Prdx1蛋白表達水平的比較Fig.5 Comparison of protein expression levels of Notch1, Hes1 and Prdx1 in femur tissues of rats in each group

3 討論

現有的抗骨質疏松藥物會導致如股骨非典型骨折、頜骨壞死等的并發癥,這限制了其在臨床上的應用。而大量中草藥提取物表現出了良好的抗骨質疏松作用[14]。本研究結果顯示,TFRD干預后,OVX小鼠體重減輕,股骨組織損傷也有所減輕,骨小梁間距減小,斷裂現象也減少,這表明TFRD具有抗骨質疏松的作用,與前期研究結果一致[6]。

破骨細胞過度活化導致骨質疏松,因此,靶向破骨細胞是抗骨質疏松癥治療的重要策略[15]。破骨細胞的生成受到多種細胞因子的調節。OPG能夠抑制破骨細胞的生成,從而影響骨吸收過程[16]。BMP-2是調控成骨的關鍵因子,能夠誘導骨形成[17]。Wang等[18]發現OVX大鼠OPG和BMP-2水平降低,而經過治療后OPG和BMP-2水平均顯著升高。本研究中,灌胃給予OVX大鼠補佳樂和TFRD治療后,大鼠股骨組織中OPG和BMP-2的表達均上調,且兩組OPG和BMP-2的表達水平接近,提示TFRD能夠通過調控OPG和BMP-2的表達來調控骨形成和骨吸收穩態。

細胞內ROS是調節破骨細胞形成的關鍵信號因子。有報道稱,增加破骨細胞中ROS的水平可能會促進破骨細胞的形成和激活[19]。此外,ROS產生的增加與雌激素缺乏和炎癥性關節炎相關的病理性骨吸收有關[20]。本研究檢測了TFRD對OVX大鼠ROS水平及氧化應激相關指標MDA和SOD的影響,其中MDA是一種過氧化產物;而SOD是一種抗氧化金屬酶,能夠促進氧和過氧化氫的形成。結果顯示,給予補佳樂和TFRD治療后,ROS和MDA水平降低,SOD水平升高,提示TFRD能夠通過抑制ROS介導的抗氧化應激反應緩解OVX骨質疏松。

Notch信號通路在細胞分化、增殖、凋亡、上皮-間充質轉化、血管生成和遷移等一系列生理和病理過程發揮重要的調控作用[21]。研究表明,Notch通路對成骨細胞分化至關重要,而成骨細胞分化又會影響骨質疏松的進程。多項研究證實TFRD參與Notch信號通路激活的調節,Hes1是受Notch信號通路調節的主要轉錄下游靶點[22]。郭松等[23]發現TFRD能夠通過抑制Notch1和Hes1的表達來促進成骨細胞增殖。黃翔宇等[10]也發現TFRD可通過抑制Notch通路改善骨質疏松臨床癥狀。但關于TFRD通過激活Notch通路緩解氧化應激損傷的研究較少。本研究結果顯示,TFRD和補佳樂均能夠抑制Notch1和Hes1的表達,且TFRD的抑制效果更好,提示TFRD可能通過抑制Notch信號通路緩解OVX骨質疏松,與前期研究結果一致。研究發現,Notch通路與ROS的相互串擾對骨質疏松的發生和發展至關重要[24]。Prdx1是一種過氧化物酶,參與調節細胞內ROS的動態平衡。Du等[25]發現,Prdx1在OVX小鼠成骨細胞中上調。本研究結果顯示,TFRD能夠抑制OVX大鼠股骨組織中Prdx1的表達,表明TFRD可通過Notch1/Hes1通路調控Prdx1介導的抗氧化反應緩解OVX骨質疏松。

綜上所述,TFRD可抑制OVX大鼠的氧化應激反應,調控骨穩態,其發揮抗骨質疏松的作用可能與抑制Notch1/Hes1/Prdx1通路有關。但由于骨質疏松機制復雜,后續可以進一步通過細胞實驗深入探究TFRD的作用機制,為TFRD防治PMOP提供新思路。