Ferrostatin-1抑制高糖誘導的小鼠BMSC鐵死亡并防治糖尿病骨質疏松

涂來勇 夏力 田峰 胡銅 吳昊天 祖力卡爾·阿地力 趙疆*

1.新疆維吾爾自治區中醫醫院,新疆 烏魯木齊 830099

2.新疆醫科大學,新疆 烏魯木齊 830000

3.新疆維吾爾自治區中醫藥研究院,新疆 烏魯木齊 830000

4.武警新疆總隊醫院外二科,新疆 烏魯木齊 830000

糖尿病骨質疏松癥(DOP)是持續威脅糖尿病患者骨骼健康的疾病。最近越來越多的證據證實糖脂代謝與鐵代謝之間存在著密切的聯系[1-2],DOP的進展常伴有糖脂穩態受損和血漿糖脂代謝產物升高[3]。鐵死亡是一種由不受控制的鐵依賴性脂質過氧化引起的細胞程序性死亡的新形式,與其他形式的細胞死亡不同,鐵死亡具有獨特的生物學特征,如鐵積累、脂質過氧化物生成增加以及谷胱甘肽過氧化物酶4 (GPX4)表達下調。因此,鐵死亡可能在DOP的發病機制中起重要作用。骨髓間充質干細胞(BMSC)的成骨分化潛能與骨骼健康密切相關。然而,關于糖尿病微環境中BMSC與鐵死亡的關系尚不清楚。

Ferrostatin-1,一種小分子藥物,是一種有效的鐵蛋白酶抑制劑,也是一種廣泛使用的鐵死亡抑制劑,具有清除脂質過氧化物的能力。在本研究中,我們建立了DOP小鼠模型,在體內和體外實驗中,我們都證實了高糖環境誘導的BMSC鐵死亡在DOP中起著至關重要的作用。這些結果為DOP的潛在機制提供了見解,并為未來DOP治療策略提出了一個潛在的治療靶點。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1動物:SPF級雄性C57BL/6小鼠30只。實驗在SPF級實驗室進行。飼養條件:每天光照時間12 h,溫度控制在22～26 ℃,濕度控制在45 %～75 %,每日更換清潔、干燥的墊料,小鼠維持飼料及無菌水喂養。倫理編號為TCMF1-20210521。

1.1.2試劑:Ferrostatin-1 (Sigma,Sm0583),Cell Counting Kit-8 (CCK-8試劑盒)、ALP染色試劑盒、ARS染色試劑盒均購自碧云天,STZ(鏈脲菌素,S0130,Sigma),血糖儀(580,魚躍),血糖試紙(580,魚躍),引物訂購自上海生工生物,引物序列見表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.2 方法

1.2.1構建動物模型:選取30只8周齡健康雄性SPF級C57BL/6小鼠,體重23±2 g,小鼠隨機分籠后適應性飼養兩周。所有小鼠均自由飲用無菌水,均給與足量高脂飼料喂養,飼養間保持清潔干燥,溫度控制在22～25 ℃,濕度控制在40 %～60 %,造模前每周更換小鼠墊料1次,糖尿病模型成模后每天更換1次墊料,并更換清潔干燥的飼養籠。小鼠適應性飼養1周后隨機分為3組,對照組6只,模型組(糖尿病模型鼠)與治療組(糖尿病模型+Ferrostatin-1)均為12只。前期預實驗的基礎提示,結合小鼠造模過程中的死亡率及最終模型成功率,最終綜合成模率約為60 %。造模前1 d晚8點開始,所有小鼠禁食,給予足夠飲水,次日晨8點開始構建模型,模型組及治療組一次性左下腹腔注射STZ 100 mg/kg( STZ凍干粉完全解凍后,溶解于預冷的1 %檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液),建立胰島功能損傷模型,對照組給予體重劑量的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。腹腔注射完成后,消毒局部皮膚,轉移至清潔干燥的鼠籠,給予足量的水、高脂飼料。1周后測量空腹血糖。當小鼠出現多飲、多食、多尿、體重下降,空腹血糖≥16. 7 mmol /L表現時,判斷為糖尿病模型構建成功。最終選取模型構建成功的12只小鼠分為模型組與治療組。

1.2.2干預措施:對照組及模型組給予生理鹽水腹腔注射,治療組給予腹腔注射Ferrostatin-1,劑量為2.5 μmol/kg,每2天1次,共持續8周。

1.2.3動態指標檢測:模型構建成功后,每日觀察小鼠的毛發色澤、活動能力。每周尾靜脈采血測血糖1次,并測體重1次。測血糖前日晚8點禁食,給予足夠飲水,次日晨8點測血糖。測血糖時注意輕柔處理小鼠,避免過度刺激引起血糖波動。

1.2.4收集標本:完成干預后,過量麻醉處死小鼠。去前正中入路剪開小鼠腹部皮膚,用紗布完整去除小鼠腹腔臟器后,充分暴露脊柱,找到L3椎體后完整取出。4 %多聚甲醛固定24 h,脫鈣14 d后,制作組織切片并按照流程完成HE染色。自然風干后顯微鏡下拍照。Image J定量。

1.2.5小鼠BMSC的獲取:過量麻醉處死小鼠后,完整取出小鼠下肢骨,并剝離軟組織充分暴露長骨干。剪去兩端骨骺端,收集長骨干至離心管,3 000 r/min離心5 min,即可獲得骨髓間充質細胞沉淀。含10 %FBS的完全培養基重懸沉淀,并種板,5 d后傳代,即可獲得小鼠BMSC。本研究采用P3～P4代小鼠BMSC。

1.2.6小鼠BMSC的干預及誘導成骨分化:小鼠BMSC按照每孔5×104的密度種于12孔板,24 h后鏡下觀察到細胞完全貼壁,3組均預干預24 h后更換成骨誘導液。預干預方法[4]:對照組,葡萄糖(5.5 mmol/L)+BSA(300 μmol/L);模型組與治療組:葡萄糖(25.5 mmol/L)+棕櫚酸(300 μmol/L)。治療組中Ferrostatin-1為全程干預。

1.2.7qPCR檢測相關mRNA的表達:按照每孔2×105的密度將BMSC種于6孔板,按照實驗方案完成干預后,吸去培養基,PBS洗3遍,每孔加入1 mL Trizol,冰上裂解10 min,反復吹打后收集轉移至EP管。嚴格按照說明書提取RNA,采用2-△△Ct法計算目標基因的相對表達量。

1.2.8ALP染色:完成成骨誘導7 d后,倒掉培養基,PBS洗兩遍,每孔加入500 μL 4 %多聚甲醛固定1 h,吸去固定液后PBS洗兩遍。嚴格按照說明書操作,40 μL A液加入1 mL反應緩沖液,混勻,加入40 μL B液,配置成染色液(現配現用),每孔加入染色液500 μL,37 ℃孵育30 min后吸去染色液,PBS洗兩遍,自然風干后掃描拍照。

1.2.9骨質量相關指標的檢測:骨小梁面積百分數,骨小梁面積/總骨表面積×100%;骨小梁寬度,(2000/1.199) ×(骨小梁面積/骨小梁周長);骨小梁數量,(1.199/2) ×(骨小梁周長/總骨表面積)。

1.3 統計學處理

采用Graphpad 8.0完成統計分析及作圖。兩獨立樣本采用t檢驗,不符合正態分布或方差不齊時采用非參數檢驗。多組間比較采用單因素方差分析,多組間比較存在兩變量時采用雙因素方差分析。P<0.05表示差異有統計學意義。*:P<0.05;***:P<0.001;****:P<0.000 1。

2 結果

2.1 Ferrostatin-1促進小鼠BMSC成骨分化能力

CCK8結果顯示,當Ferrostatin-1在不超過10 μmol/L濃度時對小鼠BMSC的增殖能力沒有影響,當Ferrostatin-1濃度為20 μmol/L時顯著抑制小鼠BMSC的增殖(圖1A)。ALP染色顯示,高糖高脂環境下,BMSC的成骨分化能力被顯著抑制,Ferrostatin-1(10 μmol/L)能夠挽救高糖高脂抑制的成骨分化(圖1B)。

注:A:Ferrostatin-1對 BMSC的增殖能力的影響;B:高糖高脂環境對BMSC成骨分化能力的影響及Ferrostatin-1的治療作用。圖1 Ferrostatin-1挽救高糖環境抑制的小鼠BMSC成骨分化能力Fig.1 Ferrostatin-1 rescues the osteogenic differentiation ability of mouse BMSC inhibited by high glucose environment

2.2 Ferrostatin-1促進小鼠BMSC成骨分化標志基因的表達

qPCR結果顯示,高糖環境下,成骨分化標志基因Runx2、ALP的表達量被抑制,Ferrostatin-1促進Runx2、ALP的表達量,且差異均有統計學意義;同時,高糖環境下,鐵死亡負相關標志基因Gpx4、Slc7a11的表達量被抑制,Ferrostatin-1促進Gpx4、Slc7a11的表達量,且差異均有統計學意義。見圖2。

注:高糖高脂環境下檢測Runx2、ALP、Gpx4、Slc7a11基因的表達及Ferrostatin-1的干預效果。圖2 高糖環境下小鼠BMSC標志基因的表達及Ferrostatin-1的干預作用Fig.2 Expression of BMSC marker genes in mice under high glucose environment and intervention effect of Ferrostatin-1

2.3 Ferrostatin-1降低糖尿病模型鼠的空腹血糖并增加體重

開始構建小鼠糖尿病模型后,連續8周,每周檢測1次各組小鼠空腹血糖及體重。發現糖尿病模型鼠空腹血糖迅速上升,體重下降明顯,且差異均有統計學意義;Ferrostatin-1可以有效降低糖尿病模型小鼠的空腹血糖,并增加體重,且差異均有統計學意義。見圖3。

注:左圖代表對照組、模型組、治療組小鼠的體重,右圖代表各組小鼠的空腹血糖。圖3 Ferrostatin-1降低糖尿病模型鼠的空腹血糖并增加體重Fig.3 Ferrostatin-1 reduces Glucose test#Fasting blood sugar and gains weight in diabetes model rats

2.4 Ferrostatin-1恢復糖尿病模型鼠的骨量

小鼠的椎體骨HE染色切片顯示,與對照組相比,糖尿病模型鼠骨小梁面積百分數、骨小梁寬度、骨小梁數量下降,且差異有統計學意義;與模型組相比,Ferrostatin-1治療組骨小梁面積百分數、骨小梁寬度、骨小梁數量增加,且差異有統計學意義。見圖4。

3 討論

糖尿病骨質疏松是一種繼發性骨質疏松,在1984年首次報道[5]。有意思的是,1型糖尿病可以顯著降低骨密度,而2型糖尿病更多的是表現出嚴重的骨微結構惡化,以皮質孔隙度和骨脆性增加為特征。因此,2型DOP的作用機制可能更為復雜,值得進一步研究。研究顯示,采用高脂飲食和1周內多次注射低劑量STZ建立小鼠2型DOP模型。研究表明,2型糖尿病誘導的骨質疏松沒有觀察到皮質骨相關參數的改變[6-7]。糖脂毒性可能首先影響最活躍的細胞骨重建區域,即松質骨骨小梁[8-9]。我們的體內實驗表明,糖尿病模型鼠骨小梁面積百分數、骨小梁寬度、骨小梁數量下降,Ferrostatin-1治療后糖尿病模型的骨質量相關指標上升(圖4)。

STZ聯合高脂飲食誘導的骨質疏松被認為是由于骨形成受到抑制或者是骨吸收過度激活[10]。高血糖、高脂血癥可直接抑制骨細胞前體細胞的成骨,但具體機制還不清楚。已有文獻報道,糖尿病環境中細胞的凋亡處于激活狀態[7,11-12]。因此,維持成骨細胞的活力是穩定骨質量的有效方式。文獻表明,糖脂代謝與鐵代謝之間存在著密切的聯系,DOP的進展常伴有糖脂穩態受損和血漿糖脂代謝產物升高[1-2]。谷胱甘肽過氧化物酶4(glutathione peroxidase 4,GPX4)具有清除脂質氧化產物的能力,已成為細胞鐵死亡研究的明星分子,可以作為判斷細胞鐵死亡的指標[13]。SLC7A11介導的胱氨酸攝取在抑制氧化反應,調控細胞存活生物過程中發揮關鍵作用。本研究中體外實驗證實,高糖環境下,BMSC的成骨分化被抑制,鐵死亡的抑制劑能夠挽救高糖環境下被抑制的的成骨分化(圖1);BMSC成骨分化過程中鐵死亡負相關標志物Gpx4、Slc7a11基因表達量顯著下調,Ferrostatin-1治療后能夠促進Gpx4、Slc7a11上調,成骨分化標志物Runx2、ALP基因表達上調(圖2)。

鐵死亡是細胞焦亡、凋亡、自噬、壞死等多種細胞死亡機制之一。鐵是人體必需的微量元素,是生命所必需的物質,在氧轉運、酶促反應、免疫反應等多種生物化學過程中發揮著重要作用。已經有研究關注到骨質疏松與鐵死亡之間的聯系[14],其中糖尿病骨質疏松是熱點之一。Song等[15]發現FANCD2可抑制erastin誘導的BMSC鐵死亡, FANCD2可減少鐵死亡過程中的鐵積累和脂質過氧化。研究表明,鐵蛋白抑制BMSC成骨分化,小鼠鐵超載與骨細胞中鐵蛋白升高和RUNX2水平降低有關[16-17]。進一步的研究發現,高糖誘導的MC3T3細胞中GPX4表達被抑制,氧化應激水平升高,線粒體普遍更小,膜染色較深,內膜折疊明顯中斷,線粒體碎片化明顯[6]。此外,在高糖環境下,MC3T3向成骨細胞分化和礦化結節形成的能力降低,在小鼠成骨細胞中也觀察到類似的現象[18]。骨質疏松是糖尿病患者的常見并發癥。有研究認為,高血糖引起的氧化應激反應和膠原蛋白中晚期糖基化終末產物(AGEs)的積累,是導致骨形成減少的主要因素[19-20]。鐵是一種強氧化劑,能夠促進活性氧自由基的產生。鐵代謝指標可直接或間接影響2型糖尿病的發生發展[21-22]。鐵死亡過程產生大量氧化應激產物,激活ROS,導致脂質過氧化物的積累和細胞損傷[23-24]。有研究觀察到,成骨細胞鐵死亡發生時,GPX4、骨鈣素(ALP)、堿性磷酸酶(ALP)和骨保護素(OPG)的表達降低,礦化結節減少,ROS水平增加,脂質過氧化增加[10,18]。當使用鐵死亡抑制劑Ferrostatin-1治療時,能夠挽救鐵死亡。褪黑素,是一種用途廣泛的抗氧化藥物,通過激活Nrf2相關信號通路,在體內實驗和體外實驗中顯著降低了鐵死亡水平,提高了MC3T3-E1的成骨能力[6]。本研究中發現,Ferrostatin-1治療能夠提高糖尿病模型造成的體重下降,同時可以降低糖尿病模型小鼠的空腹血糖。體內實驗顯示,Ferrostatin-1治療后,糖尿病模型小鼠骨小梁面積百分數、骨小梁寬度、骨小梁數量增加。

關于鐵死亡與糖尿病骨質疏松的研究還處于初級階段,關于糖尿病骨質疏松中鐵死亡的具體機制、靶點分子和直接相關的信號通路尚不清楚。本研究通過構建糖尿病骨質疏松模小鼠型,在體內實驗,提示了鐵死亡抑制劑Ferrostatin-1在體內可以增加體重、降低血糖、增加骨小梁相關參數;在體外實驗,能夠抑制鐵死亡相關基因的表達,促進成骨分化相關基因的表達,促進BMSC的成骨分化。這些新發現的表型及相關的分子靶點有待進一步研究,以開發有效的治療方法。本研究將有助于確定糖尿病骨質疏松與鐵死亡之間的關系,對進一步認識和有效治療糖尿病骨質疏松有指導作用。