麻黃堿調控AMPK/NF-κB信號通路改善大鼠膝骨關節炎的實驗研究

王俊杰 郭中華* 史棟梁 丁琳琳

1. 河南省中醫院骨病一科,河南 鄭州 450053 2. 金水區總醫院中醫科,河南 鄭州 450008

膝骨關節炎(knee osteoarthritis,KOA)是一種慢性炎癥性關節退行性疾病,多發于中老年人,臨床主要表現為關節疼痛、關節畸形或功能障礙,具有較高的致殘率,嚴重影響患者生活質量[1]。KOA病理機制復雜,與炎癥反應、創傷、自身免疫反應等多種因素有關,其病理變化最初發生于關節軟骨組織,炎癥因子刺激可誘導骨細胞外基質降解,破壞關節軟骨,加重KOA的進展,抑制膝關節炎癥反應,可延緩關節病理進展[2-3]。腺苷酸激活蛋白激酶(AMPK)可維持細胞內能量平衡,通過調節下游靶分子如核轉錄因子-κB(NF-κB)的轉錄,介導炎癥損傷,與多種炎癥性疾病密切相關,在關節炎疾病中,AMPK活性下降時可導致關節軟骨的退行性變[4],激活AMPK可提高軟骨細胞的抗應激能力,修復軟骨細胞線粒體功能,延緩實驗性骨關節炎的發生發展[5]。麻黃堿(Ephedrine)是從麻黃屬植物中提取的生物堿,具有擴展支氣管、升高血壓的作用,最新研究顯示,麻黃堿具有調節免疫炎癥反應的作用,可降低促炎細胞因子表現出抗關節炎作用[6-7]。麻黃堿對KOA的作用機制尚不清楚,本研究探討麻黃堿對KOA的影響及可能的影響機制,為KOA的治療提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1動物:SPF級SD雄性大鼠,6～8周齡,210～230 g,購于中國醫學科學院醫學實驗動物研究所(許可證號:SCXK(京)2021-0004),動物飼養于溫度為(22±2)℃,濕度約55 %,12 h/12 h 晝夜交替的環境中。本實驗按照河南省中醫院倫理委員會關于實驗動物飼養和使用的原則進行,并審核通過(倫理號:HNSZYY202210012)。

1.1.2主要試劑:鹽酸麻黃堿片(國藥準字H36020897,規格:30 mg)購自江西制藥有限責任公司;AMPK抑制劑Compound C(P5499,HPLC≥98 %)購自Sigma公司;改良番紅O-固綠軟骨染色試劑盒(G1371)、MMP-13(K002867P)、IL-1β(K009661P)、p-AMPK(K009990P)、AMPK(K200063M)抗體購自索萊寶生物科技有限公司;大鼠TNF-α(PT516)、IL-1β(PI303)ELISA試劑盒及p-NF-κB p65(AF5881)、NF-κB p65(AF0246)、β-actin(AF5003)抗體購自碧云天生物科技有限公司。大鼠環氧化酶-2(COX-2)ELISA試劑盒(SP13477)購自武漢賽培生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1實驗動物分組及模型制備:根據參考文獻,采用Hulth法[8]制備KOA模型,大鼠適應性飼養1周后,腹腔注射2 %戊巴比妥鈉麻醉大鼠,打開右膝關節腔,髕骨向外側推,切斷前交叉和內側副韌帶與內側半月板切除,術后臀大肌注射40萬U青霉素3 d預防感染,假手術組(Sham組)經切開皮膚后進行縫合。術后自由活動,8周后造模結束。造模成功后,將大鼠隨機分為KOA組、Ephedrine組、Ephedrine+AMPK抑制劑組(Ephedrine+Compound C組),每組10只。Ephedrine組大鼠給予40.0 mg/kg的麻黃堿灌胃給藥,每天1次,Ephedrine+Compound C組使用40.0 mg/kg的麻黃堿灌胃給藥及0.2 mg/kg的AMPK抑制劑Compound C尾靜脈注射,給藥劑量參考文獻[7],Sham組與KOA組大鼠同時灌胃與尾靜脈注射等量的生理鹽水,每天1次,連續給藥4周。

1.2.2膝關節寬度檢測:分別于造模成功后第1、14、28 d觀察關節腫脹情況,使用游標卡尺測量大鼠膝關節寬度。

1.2.3大鼠疼痛閾值:分別于造模成功后第1、14、28 d,用電子壓力感測器測量大鼠機械刺激縮爪閾值,使用刺激針刺激大鼠右肢足底二、三跖骨處并增加刺激壓力,大鼠出現縮足、舔腳等陽反應時記錄刺激壓力數值,每只大鼠連續刺激3次,計算平均值。

1.2.4軟骨組織病理學觀察:大鼠采集完關節液后,將右側膝關節腔剖開后緊貼骨關節表面切取軟骨組織,其中5種大鼠軟骨組織使用4 %多聚甲醛固定5 d,10 % EDTA溶液脫鈣4周,石蠟包埋后切片,依次將切片放入二甲苯-無水乙醇-75 %乙醇脫蠟至水,自來水沖洗,固綠染液5～10 min,洗去多余染液,至軟骨呈無色,分化液稍浸泡,自來水稍洗后加入番紅染液15～30 s,使用無水乙醇快速脫水,二甲苯透明5 min,中性樹膠封片,顯微鏡下觀察軟骨組織病理變化并拍照,并進行Mankin評分[9]。

1.2.5關節液TNF-α、IL-1β、COX-2水平檢測:末次給藥24 h,大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉,右側膝關節腔穿刺取關節液,并用0.1 mL生理鹽水沖洗關節腔,將關節液與沖洗液合并,3 000 g離心15 min,留取上清液,-80 ℃保存。根據TNF-α、IL-1β、COX-2試劑盒說明書分別配制TNF-α、IL-1β、COX-2標準品溶液,解凍關節液樣本,使用全自動酶標儀檢測TNF-α、IL-1β、COX-2標準品溶液以及關節液在450 nm處的吸光度,繪制TNF-α、IL-1β、COX-2標準品曲線,根據標準品回歸曲線方程,計算TNF-α、IL-1β、COX-2水平。

1.2.6免疫組化檢測軟骨組織IL-1β、MMP-13蛋白:軟骨組織石蠟切片經脫蠟、抗原修復、山羊血清封閉、加入IL-1β(1∶1 000)、MMP-13(1∶1 000)一抗稀釋液,4 ℃孵育過夜,加羊抗兔二抗(1∶1 000)37 ℃孵育60 min,PBS洗滌后DAB顯色,蘇木精復染,以細胞中出現黃色顆粒為陽性表達,采用Image-Pro Plus 6.0分析吸光度值。

1.2.7Western blot檢測蛋白:各組大鼠取軟骨組織勻漿后加入RIPA裂解液提取總蛋白,采用Western blot法檢測蛋白,p-AMPK、AMPK、p-NF-κB p65、NF-κB p65及β-actin一抗按照1∶1 000稀釋,HRP標記的羊抗兔IgG二抗按照1∶1 500稀釋,實驗結束后,以β-actin為內參,采用Image-QuaNT 軟件測量其吸光度,分析各蛋白相對表達量。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 各組大鼠膝關節寬度

與Sham組比較,給藥第14、28 d后KOA組大鼠膝關節寬度顯著增加(P<0.05);與KOA組比較,給藥第14、28 d后Ephedrine組大鼠膝關節寬度顯著降低(P<0.05);與Ephedrine組比較,Ephedrine+ Compound C組給藥第14、28 d后大鼠膝關節寬度顯著增加(P<0.05),見表1。

表1 各組大鼠膝關節寬度比較

2.2 各組大鼠疼痛閾值

與Sham組比較,給藥第14、28 d后KOA組大鼠疼痛閾值顯著降低P<0.05);與KOA組比較,給藥第14、28 d后Ephedrine組大鼠疼痛閾值顯著升高(P<0.05);與Ephedrine組比較,給藥第14 、28 d后Ephedrine+Compound C組大鼠疼痛閾值顯著降低(P<0.05),見表2。

表2 各組大鼠疼痛閾值比較

2.3 各組大鼠軟骨組織病理變化及Mankin評分

Sham組軟骨組織結構完整,細胞分布均勻,潮線清晰;KOA組軟骨組織損傷嚴重,結構破壞嚴重,細胞聚集,潮線模糊不清,Mankin評分較Sham組升高(P<0.05);Ephedrine組軟骨損傷明顯改善,軟骨組織結構較完整、清晰,Mankin評分較KOA組顯著降低(P<0.05);Ephedrine+ Compound C組軟骨組織損傷較Ephedrine組加重,軟骨細胞聚集增多,潮線模糊,Mankin評分較Ephedrine組升高(P<0.05),見圖1與表3。

圖1 各組大鼠軟骨組織病理變化(番紅O-固綠染色)Fig.1 Pathological changes of cartilage tissue of rats in each group (safranine O-solid green staining)

表3 各組大鼠Mankin評分比較(分,

2.4 各組大鼠關節液TNF-α、IL-1β、COX-2水平

與Sham組比較,KOA組大鼠關節液TNF-α、IL-1β、COX-2水平顯著升高(P<0.05);與KOA組比較,Ephedrine組關節液TNF-α、IL-1β、COX-2水平顯著降低(P<0.05);與Ephedrine組比較,Ephedrine+ Compound C組關節液TNF-α、IL-1β、COX-2水平顯著升高(P<0.05),見表4。

表4 各組大鼠關節液TNF-α、IL-1β、COX-2水平比較

2.5 各組大鼠軟骨組織IL-1β、MMP-13蛋白表達

Sham組軟骨組織僅有少量IL-1β、MMP-13蛋白陽性表達,與Sham組比較,KOA組大鼠軟骨組織IL-1β、MMP-13陽性表達顆粒增多,IL-1β、MMP-13光密度值顯著升高(P<0.05);與KOA組比較,Ephedrine組IL-1β、MMP-13陽性表達顆粒減少,IL-1β、MMP-13光密度值顯著降低(P<0.05);與Ephedrine組比較,Ephedrine+ Compound C組IL-1β、MMP-13陽性表達顆粒增多,IL-1β、MMP-13光密度值顯著升高(P<0.05),見圖2與表5。

圖2 各組大鼠軟骨組織IL-1β、MMP-13蛋白表達(免疫組化,200×)Fig.2 IL-1β, MMP-13 protein expression of rat cartilage in each group (immunohistochemistry,200×)

表5 各組大鼠軟骨組織IL-1β、MMP-13蛋白表達(光密度值,

2.6 各組軟骨組織AMPK/NF-κB通路相關蛋白表達

Western blot結果顯示,與Sham組比較,KOA組大鼠軟骨組織p-AMPK/AMPK水平顯著降低,p-NF-κB p65/NF-κB p65水平顯著升高(P<0.05);與KOA組比較,Ephedrine組p-AMPK/AMPK水平顯著升高,p-NF-κB p65/NF-κB p65水平顯著降低(P<0.05);與Ephedrine組比較,Ephedrine+Compound C組p-AMPK/AMPK水平顯著降低,p-NF-κB p65/NF-κB p65水平顯著升高(P<0.05),見圖3與表6。

注:A:Sham group;B:KOA group;C:Ephedrine group;D:Ephedrine+Compound C group。圖3 Western blot檢測p-AMPK、AMPK、p-NF-κB p65、NF-κB p65蛋白表達Fig.3 p-AMPK, AMPK, p-NF-κB p65 and NF-κB p65 proteins expression were detected by Western blot

表6 各組大鼠軟骨組織AMPK/NF-κB通路相關蛋白表達比較

3 討論

關節軟骨發生病變及結構破壞為KOA主要病理表現之一,軟骨損傷后自我修復能力較差,進而影響膝關節活動功能,軟骨細胞外基質降解與細胞凋亡可導致KOA軟骨降低[10]。

目前KOA的治療主要包括物理治療與藥物治療,但只能緩解癥狀,不能根治,因此尋找有效治療藥物具有重要意義。麻黃具有利尿、鎮咳、平喘、解熱、升高血壓與興奮中樞神經等多種藥理學作用,麻黃堿是中藥麻黃的主要成分,在呼吸系統疾病、心血管系統疾病、中樞神經系統疾病中均有廣泛的應用[11]。研究顯示,麻黃堿與瑞帕林II聯合治療可減少哮喘大鼠氣道重塑和炎癥反應,改善哮喘大鼠肺組織高反應性[12]。本研究給予KOA大鼠麻黃堿干預后,大鼠軟骨組織病理損傷減輕,膝關節寬度顯著降低,疼痛閾值顯著升高,提示麻黃堿可有效改善KOA癥狀與病理損傷。

炎癥與KOA的發病機制密切相關,關節囊滑膜組織和關節腔內炎癥因子如IL-1β、TNF-α促進關節軟骨細胞外基質蛋白降解,加速軟骨破壞,促進KOA進程[13]。IL-1β、TNF-α等炎癥介質可誘導COX-2與MMP-13大量表達,COX-2可與前列腺素合成酶(PGES)結合形成PGE-2,促進關節腫脹與血管擴張,導致疼痛產生,MMP-13可降解軟骨基質中的CollagenⅡ,誘導軟骨細胞變性凋亡,破壞軟骨完整性[14]。本研究給予大鼠麻黃堿干預后,大鼠關節液TNF-α、IL-1β、COX-2水平及軟骨組織IL-1β、MMP-13表達水平顯著降低,提示麻黃堿通過抑制炎癥反應改善KOA大鼠軟骨病理損傷。已有研究證實,抑制炎性因子釋放,可改善關節軟骨代謝,促進關節軟骨修復[15]。本研究亦印證這一觀點。

AMPK/NF-κB信號通路參與炎癥反應,AMPK是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶,可抑制氧化應激與炎癥反應,在軟骨細胞中,AMPK可通過調節下游基因表達(如PGC-1α、SIRT1)增強軟骨細胞線粒體生物合成和功能,抑制軟骨細胞產生氧化應激增強細胞活性,在關節炎軟骨細胞中AMPK活性降低[16]。NF-κB信號通路是一種炎癥性通路,AMPK通過下調NF-κB抑制TNF-α、IL-1β等炎癥因子分泌,抑制軟骨細胞的炎癥反應,促進軟骨修復[17]。研究顯示,茶黃素通過調節AMPK/SIRT1/NF-κB信號通路,抑制炎癥反應與氧化應激,對KOA大鼠起治療作用[18]。本研究結果顯示,麻黃堿可激活AMPK通路,抑制NF-κB信號通路,提示麻黃堿可能通過調節AMPK/NF-κB信號通路改善大鼠KOA。Shi等[19]研究顯示,麻黃堿通過抑制NF-κB信號通路,降低炎癥反應,減輕大鼠腦缺血/再灌注損傷。本研究亦證實麻黃堿可抑制NF-κB信號通路激活。此外,給予KOA大鼠AMPK抑制劑Compound C后,大鼠軟骨組織損傷加重,炎癥因子水平增加,麻黃堿改善KOA的作用被部分逆轉,證實麻黃堿通過激活AMPK通路抑制NF-κB信號通路,抑制炎癥反應,改善KOA大鼠軟骨炎性損傷。

綜上所述,麻黃堿通過激活AMPK通路,抑制NF-κB信號通路,抑制炎癥反應,改善KOA大鼠軟骨損傷,麻黃堿可能成為治療KOA的潛在藥物。