仙茅苷調節lncRNA MEG3/miR-181a-5p通路對骨質疏松大鼠成骨細胞自噬的影響

王勤儉 張睿昕 張攀 李泊泊

河南省中醫院 河南中醫藥大學第二附屬醫院,河南 鄭州 450000

骨質疏松癥(osteoporosis,OP)是一種系統性骨病,其特征是骨量下降和骨微細結構破壞,表現為骨的脆性和骨折的危險性大大增加,即使是輕微的創傷或無外傷的情況下也容易發生骨折[1]。臨床上治療OP的藥物包括雌激素、降鈣素、選擇性雌激素受體調節劑、雙膦酸鹽等,它們大都通過抑制破骨細胞活性、阻止骨吸收發揮治療作用,對骨形成的作用極小,因此提高成骨細胞活性、促進骨形成是此領域關注的焦點[2]。仙茅苷(Curculigoside, CUR)是石蒜科仙茅的主要活性成分,屬于苯甲酸酯類衍生物,能夠促進成骨細胞活性、治療骨質疏松[3]。已經證明,OP患者長鏈非編碼RNA(lncRNA)MEG3高表達,微小RNA(miR)-181a-5p表達減少,下調lncRNA MEG3、上調miR-181a-5p對預防OP和潛在OP風險具有重要意義[4-5]。CUR是否能調節lncRNA MEG3/miR-181a-5p信號軸影響OP的進展尚不清楚。因此,本研究將探究CUR在OP中對lncRNA MEG3/miR-181a-5p軸的調節,嘗試為OP的診治提供理論基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1細胞:骨髓間充質干細胞(BM-MSCs,CP-R131),購自普諾賽生物。

1.1.2動物:SD雄性大鼠(6～7周齡,(220±25) g),購自北京北方艾特生物科技有限公司[SCXK(京)2020-0005],大鼠生活環境為SPF級動物房,注射、取材等操作遵守實驗室相關規定。

1.1.3試劑與儀器:胎牛血清、Lipofectamine 3000轉染試劑盒、熒光素酶檢測試劑、地塞米松、β-甘油磷酸鈉,購自美國Thermo公司;抗壞血酸、DMEM細胞培養基、堿性磷酸酶(ALP)染色試劑盒、4 %多聚甲醛(PFA)、RIPA裂解液、ECL超敏化學發光液、Cy3 IgG二抗(紅色熒光,A0507)、FITC IgG二抗(綠色熒光,A0562),購自碧云天生物;一抗微管相關蛋白1-輕鏈3(LC3,ab192890),自噬效應蛋白(Beclin1, ab289864),購自美國Abcam公司。

微型CT掃描儀,購自皕赫科學儀器;CO2培養箱,購自德國Memmert公司;熒光顯微鏡,購自日本Keyence公司;電泳儀、轉膜儀,購自北京鴻濤基業科技;Tanon 1600分析儀,購自天能集團。

1.2 細胞實驗

1.2.1成骨細胞分化:復蘇BM-MSCs細胞至穩定生長,接種至96孔板中,使用誘導培養基(含20 mL/L胎牛血清、10-8mol/L地塞米松、50 mmol/L β-甘油磷酸鈉、50 μmol/L抗壞血酸、25 μL骨形態發生蛋白的DMEM培養基)培養30 d誘導成骨細胞分化,第15 d、25 d進行堿性磷酸酶染色鑒定成骨細胞,細胞質中有藍、紫顆粒,提示成骨細胞分化成功[6]。

1.2.2CUR濃度篩選:將1.2.1分化成功的成骨細胞接種至96孔板,分別與0、6.25、12.5、25、50、100 μg/mL的CUR共培養72 h[7],按照CCK-8試劑盒要求測定各組細胞的吸光度(OD),評價增殖活力。

1.2.3檢測lncRNAMEG3對miR-181a-5p的轉錄調控:使用Starbase數據庫預測lncRNA MEG3基因與miR-181a-5p的結合位點。構建lncRNA MEG3野生型質粒(lncRNA MEG3-WT)和突變型質粒(lncRNA MEG3-MUT),lncRNA MEG3-WT和lncRNA MEG3-MUT分別與miR-181a-5p NC或miR-181a-5p共轉染于細胞,48 h后,使用熒光顯微鏡觀察轉染效率,評價熒光素酶活性。

1.2.4細胞轉染、分組:將對數生長期的成骨細鋪板至24孔板,融合至60 %時,加入25 μg/mL CUR培養3 h,立即使用Lipofectamine 3000試劑盒分別轉染pc-NC、pc-LncRNA MEG3,轉染24 h,分別命名為CUR+pc-NC組、CUR+pc-LncRNA MEG3組;只加入25 μg/mL CUR 3 h的組命名為CUR組;加入25 μg/mL CUR 3 h和5 mmol/L 3-MA 1 h的組命名為CUR+3-MA組[8];正常培養的成骨細胞組命名為NC組,轉染48 h后,鑒定轉染效率,用于后續實驗。

1.2.5檢測成骨細胞中lncRNAMEG3、miR-181a-5p的表達水平:使用qRT-PCR檢測mRNA水平。Trizol提取細胞RNA,反轉錄得到cDNA,根據PCR試劑盒要求制備反應體系:TaqDNA聚合酶1 μL,上、下游引物各2 μL,緩沖液10 μL,dNTP mix 1 μL,cDNA 1 μL,H2O 33 μL。將樣品置于qRT-PCR儀,設定反應程序:預變性(95 ℃,5 min),變性(95 ℃,30 s),退火(67 ℃,15 s),循環40次。結果使用2-△△Ct法統計,并計算lncRNA MEG3、miR-181a-5p 的相對表達量。lncRNA MEG3、miR-181a-5p的引物序列見表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.2.6檢測細胞ALP活力:按照1.2.3中細胞分組,誘導分化14 d后,使用ALP染色法評價細胞分化能力。使用多聚甲醛固定細胞,PBS洗3次,加入BCIP/NBT染液避光孵育0.5 h,蒸餾水洗3次,滴加核固紅染液染色3 min,顯微鏡下觀察,計算相對ALP活力。

1.2.7檢測細胞自噬體數量:使用0.25 %胰蛋白酶將1.2.3中細胞消化1 min,接種至6孔板中。24 h后離心棄去胰蛋白酶消化液,使用洗滌緩沖液使細胞懸浮,吸取90 μL細胞懸液并加入10 μL MDC染液孵育0.5 h,離心棄去上清,重新懸浮后滴在載玻片上,使用顯微鏡觀察,藍色為自噬陽性細胞,自噬陽性率%=藍色染色細胞數/總細胞數×100 %。

1.2.8檢測細胞LC3、Beclin1的表達:將1.2.3中細胞涂布到玻片上,使用多聚甲醛固定15 min,0.5 % Triton X-100通透20 min,封閉30 min,一抗LC3、Beclin1孵育過夜;二抗避光孵育1 h,最后滴加DAPI染液,封片后在顯微鏡下拍照并分析LC3、Beclin1的表達。

1.3 動物實驗

1.3.1動物分組:SD大鼠肌肉注射地塞米松磷酸鈉1 mg/kg,每周2次,持續8周,建立OP大鼠模型,脛骨近端骨礦物質密度(BMD)明顯下降,表示模型建立成功[9]。建模過程中損失大鼠及時補充。同時間同頻次肌肉注射生理鹽水大鼠作為對照組(CT組)。模型大鼠建立1周后,隨機分為2組:OP組(灌胃適量生理鹽水,隔天1次)、OP+ CUR組(灌胃15 mg/kg CUR,隔天1次)[10]。CT組處理方式同OP組,每組6只大鼠。技術路線見圖1。

圖1 動物實驗技術路線圖Fig.1 Animal testing technology roadmap

1.3.2骨形態學分析:給藥結束后,使用1.5 %戊巴比妥鈉麻醉大鼠,通過微型CT檢測脛骨遠端骨小梁數(Tb.N)、骨小梁間距(Tb.Sp)、骨小梁厚度(Tb.Th)。

兩次世界大戰之間，ICMI少有活動；1952年ICMI重建后成為國際數學聯盟（IMU）的分支組織．目前，ICMI有92個成員國，包括70個IMU成員國和其他以個案申請并得到批準參加的成員國．

1.3.3Westernblot檢測LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin1蛋白表達:大鼠保持麻醉狀態,斷頭法處死,取各組脛骨組織,勻漿液一分為二,一份使用Trizol提取組織RNA待測,另一份提取總蛋白,BCA法定量蛋白濃度。在新配置的SDS-PAGE凝膠中上樣各組樣品,經過電泳和轉膜,將樣品轉至PVDF膜;PVDF膜經封閉后在LC3、Beclin1稀釋液(1∶1 000)中過夜,再使用IgG二抗(1∶2 000)和ECL發光液孵育,Tanon 1600分析灰度值。

1.3.4檢測脛骨組織中lncRNA MEG3、miR-181a-5p的表達水平:取1.3.3中大鼠脛骨組織RNA,按1.2.5中方法檢測各組lncRNA MEG3、miR-181a-5p的表達水平。

1.4 統計學處理

2 結果

2.1 不同濃度CUR對成骨細胞增殖活力的影響

與0 μg/mL CUR組比較,25、50、1 000 μg/mL CUR組成骨細胞增殖活力提高(P< 0. 05)。后續選擇25 μg/mL劑量的CUR進行實驗。見表2。

表2 不同濃度CUR對成骨細胞增殖活力的影響

2.2 lncRNA MEG3靶向miR-181a-5p結合位點和轉染效率

lncRNA MEG3靶向miR-181a-5p結合位點見圖2。與mimic NC和lncRNA MEG3-WT共轉染組比較,miR-181a-5p mimic和lncRNA MEG3-WT共轉染組熒光素酶活性降低(P<0.05);與mimic NC和lncRNA MEG3-MUT共轉染組比較,miR-181a-5p mimic和lncRNA MEG3-MUT共轉染組熒光素酶活性變化差異無統計學意義(P>0.05)。見表3。

圖2 Starbase數據庫預測lncRNA MEG3與miR-181a-5p的結合位點Fig.2 Starbase database predicts the binding sites of lncRNA MEG3 and miR-181a-5p

表3 熒光素酶活性比較Table 3 Comparison of luciferase

轉染效果見圖3。qRT-PCR結果顯示,轉染后,與pc-NC組比較,細胞中LncRNA MEG3 的相對表達水平升高(P< 0.05),miR-181a-5p的相對表達水平顯著降低(P>0.05)。見表4。

圖3 轉染后在顯微鏡下的觀察結果(100×)Fig.3 The results were observed under microscope after transfection(100×)

表4 轉染后細胞中lncRNA MEG3、miR-181a-5p表達比較

2.3 各組細胞ALP活性比較

與NC組比較,CUR組細胞ALP活性提高(P< 0.05);與CUR組比較,CUR+3-MA組細胞ALP活性下降(P< 0.05);與CUR+pc-NC組比較,CUR+pc-LncRNA MEG3組細胞ALP活性下降(P< 0.05)。見表5。

表5 各組細胞ALP活性比較

2.4 各組細胞自噬陽性率比較

與NC組比較,CUR組細胞自噬陽性率提高(P<0.05);與CUR組比較,CUR+3-MA組細胞自噬陽性率下降(P<0.05);與CUR+pc-NC組比較,CUR+pc-LncRNA MEG3組細胞自噬陽性率下降(P<0.05)。見圖4和表6。

圖4 MDC染色檢測各組細胞自噬陽性率(100×)Fig.4 MDC staining was used to detect the positive rate of autophagy in each group(100×)

表6 各組細胞自噬陽性率比較

2.5 各組細胞LC3、Beclin1的表達比較

LC3、Beclin1蛋白表達細胞分別被標記為綠色、紅色熒光,與NC組比較,CUR組細胞LC3、Beclin1的表達升高(P< 0.05);與CUR組比較,CUR+3-MA組細胞LC3、Beclin1的表達下降(P< 0.05);與CUR+pc-NC組比較,CUR+pc-LncRNA MEG3組細胞LC3、Beclin1的表達下降(P< 0.05)。見圖5、圖6和表7。

圖5 免疫熒光檢測各組細胞LC3的表達(100×)Fig.5 The expression of LC3 in each group was detected by immunofluorescence(100×)

圖6 免疫熒光檢測各組細胞Beclin1的表達(100×)Fig.6 The expression of Beclin1 in each group was detected by immunofluorescence(100×)

表7 各組細胞LC3、Beclin1的表達比較Table 7 Comparison of LC3 and Beclin1 expression

2.6 各組大鼠骨形態學分析比較

與CT組比較,OP組大鼠Tb.N、Tb.Th降低,Tb.Sp升高(P< 0.05);與OP組比較,OP+CUR組大鼠Tb.N、Tb.Th升高,Tb.Sp降低(P< 0.05)。見表8。

表8 各組大鼠骨形態學分析比較Table 8 Comparison of bone morphology

2.7 各組大鼠脛骨LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin1、LncRNA MEG3、miR-181a-5p的表達比較

與CT組比較,OP組大鼠LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1蛋白及miR-181a-5p表達水平降低,lncRNA MEG3表達水平升高(P< 0.05);與OP組比較,OP+CUR組大鼠LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1蛋白及miR-181a-5p表達水平升高,lncRNA MEG3表達水平降低(P< 0.05)。見圖7和表9。

圖7 各組大鼠脛骨組織蛋白表達Fig.7 Histamin expression in tibia of rats in each group

表9 各組大鼠脛骨 LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1、LncRNA MEG3、miR-181a-5p的表達比較

3 討論

成骨細胞在骨骼生長、發育、重塑過程中以連接細胞群的方式發揮重要作用,它能夠連續生成新骨、增加骨量,其功能異常可能引起代謝性骨病包括OP[11]。近年來研究發現,lncRNA MEG3參與多個間充質干細胞的成骨分化,在骨形成和OP的發展中充當關鍵介質[12]。增加miR-181a-5p的表達可以促進成骨細胞分化,減輕OP[13]。探索調控lncRNA MEG3/miR-181a-5p信號軸的藥物可能有助于開辟治療OP的新路徑。

大量研究證實,CUR通過促進成骨細胞增殖、分化,抑制破骨細胞骨吸收發揮抗OP的作用[14]。本研究通過使用梯度濃度的CUR處理BM-MSCs細胞,發現25 μg/mL以上濃度的CUR能夠提高BM-MSCs細胞的增殖活力,且成骨細胞分化能力增加;經過CUR處理的OP模型大鼠骨形態好轉,說明CUR具有治療OP的作用,已前述觀點一致。另外,在lncRNA MEG3過表達的成骨細胞中,其分化能力下降,提示lncRNA MEG3表達的增加可能促進了OP疾病進展,但其作用機制還需進一步探究。

我們也在實驗中檢測了成骨細胞和大鼠的自噬相關指標。自噬即細胞質蛋白或細胞器包被進入囊泡,并與溶酶體融合降解包裹內容物的過程,是維持細胞本身代謝和細胞器更新的重要環節[15]。Beclin1位于染色體17q21,是哺乳動物自噬基因Atg6的同系物,啟動自噬進程[16]。LC3是自噬過程標志物,它的功能是參與自噬小體的形成,LC3首先裂解成胞質形LC3I,然后轉移至ATG3以形成膜結合形式LC3II附著到自噬體的膜上,LC3Ⅱ/Ⅰ升高代表自噬活性增強[17]。此外,抑制成骨細胞自噬和分化,會加重OP[18]。本研究中,CUR能夠提高成骨細胞自噬陽性率和LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin1蛋白的表達,說明CUR能提高成骨細胞自噬活性;在lncRNA MEG3過表達的成骨細胞中,LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin1蛋白表達也是下調的,提示lncRNA MEG3表達的增加可能是成骨細胞自噬活性降低的原因之一;此外,OP大鼠脛骨組織LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin1蛋白表達減少,經CUR治療能提高自噬蛋白的表達,且lncRNA MEG3表達下降,miR-181a-5p表達增加。

本研究使用Starbase數據庫對LncRNA MEG3作靶基因預測,我們發現miR-181a-5p是lncRNA MEG3的一對潛在靶基因。本研究中,過表達lncRNA MEG3可負向調控miR-181a-5p表達,抑制成骨細胞自噬活性,也進一步說明miR-181a-5p可能與成骨細胞自噬功能有關。另外,本研究使用自噬抑制劑3-MA聯合CUR干預OP大鼠,發現3-MA完全逆轉了CUR對OP大鼠的治療作用,進一步驗證CUR的作用機制之一是下調lncRNA MEG3、增加miR-181a-5p的表達來增加成骨細胞自噬活性,從而改善OP進展。

綜上所述,CUR可能通過調節lncRNA MEG3/miR-181a-5p信號軸增加OP大鼠成骨細胞自噬活性。