不同方法提取卵黃抗體的對比

牛亞麗，王 萌，王亞楠

（豪威生物科技有限公司，天津 301700）

隨著禽畜業的迅速發展，其規模化程度越來越高，抗生素濫用導致的細菌耐藥性及抗生素殘留問題也越來越突出。加快尋找和使用其他安全可靠的產品來取代抗生素成為行業亟待解決的問題。雞源性的卵黃免疫球蛋白被認為是一類非常重要的免疫物質，其作用機制在于，可以抵御外界的病毒，并且可以促進免疫系統的正常運作[1]，其作用機制主要表現在促進免疫反應，如促進免疫系統的活性和免疫耐受性，減少病毒的傳播，防止病毒的蔓延。除了具備抵御病毒感染的能力，卵黃抗體也被證實是一種非常有效的毒素抑制劑，它的穩定性極佳，特異性極強[2]，完全沒毒，沒有任何殘余，也沒有出現任何耐藥現象，而且它還能夠提升機體的免疫力，因而，它已經成為動物的健康監測、預防與治療的首選手段[3]。隨著卵黃抗體的持續發展，它的獨特性、療效顯著超越了傳統的抗生素，成為一種可以快速獲得、精確分析、低毒副反應、安全可靠的新一代“抗生素”。它的出現，使得抗生素的使用更加安全、環保，在畜牧業中發揮著越來越重要的作用[4]。

在雞蛋黃中，蛋白質和脂肪的比例通常在1∶2之間，而這些物質的組成主要由蛋白質和脂肪組成的脂蛋白。然而，這些脂蛋白很難被水解，而磷脂和不飽和脂肪酸也容易發生化學反應，從而使得抗體的有效性受到影響，因此，給動物注入發生化學反應的抗體可能會導致動物的死亡。由此去除卵黃抗體的脂蛋白和脂質是至關重要的，若無法有效地去除這些成分，將可能導致其應用于動物的免疫系統中，從而造成極其危險的后果[5]。因此，有效地去除這些成分變得至關緊迫。在這項研究中，我們使用了多種技術來提純卵黃抗體，并對它們的優勢和劣勢進行了全面的評估，旨在尋求最佳的技術，并將這些結果應用于未來的生產實際[6]。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及儀器

tg16g臺式高速離心機、10~100μl8道移液器、96孔V型微量板、XK96-3型微量振蕩器以及北京勃林格殷格翰的高免蛋雞，均按照常規的雞類免疫程序進行了處理，以滿足實驗需求。

1.2 主要試劑

新城疫標準抗原（批號：202111、中國獸醫藥品監察所）、禽流感H9亞型標準抗原（批號：2021001、哈爾濱維科生物技術有限公司）、辛酸（批號：20201210、國藥集團）、無水乙酸鈉（批號：20211111、國藥集團）、三氯甲烷（批號：20210720、天津市科密歐化學試劑有限公司）、PBS緩沖液（干粉）（批號：PM31132120、coolaber）、鹽酸分析純（批號：20190123、天津市科密歐化學試劑有限公司）、乙酸分析純（批號：20171119、天津市福晨化學試劑）、75%乙醇（批號：20221129、山東福爾特消毒制品有限公司）。

1.3 試驗方法

為了確保產品的安全，我們需要對所有的雞蛋進行處理。我們需要把它們放在42℃的0.1%新潔爾滅溶液中浸泡15 min，接著，我們需要使用75%的乙醇來徹底洗滌，以消滅它們的細菌。最終，我們需要把它們分開，分離出蛋清和蛋黃，丟棄蛋清，只保留蛋黃。接下來，我們就要按照如下步驟來提取卵黃抗體[7]。

（1）酸化水提取法：將卵黃和純化水按照1∶8的體積混合，即1 mL卵黃+8 mL純化水，震蕩均勻，用20%的稀鹽酸調節pH值為5.2，4℃靜置6h，然后4℃、10000 r/min離心25 min，棄掉沉淀，收集上清液即可[8]。

（2）氯仿萃取法：將卵黃和PBS緩沖液（pH7.5）按照1：8的體積混合，再加入同體積的三氯甲烷。即1 mL卵黃+8 mLPBS緩沖液，混合均勻，加入9 mL三氯甲烷，振蕩均勻，4℃、10000 r/min離心30 min，取上層清液即可[9]。

（3）將卵黃液和乙酸鈉緩沖液按1∶8的比例混合，1 mL卵黃液和8 mL乙酸鈉緩沖液混勻，再加入25%的辛酸，攪拌30 min，最后以6000 r/ min 的速度離心20 min。將沉淀物拋棄，取出上層清澈的液體[10]。

（4）安檢試驗：我們從10日齡的SPF雞中挑選出40只，將它們隨機地劃分到4組，其中第3組接受免疫，第4組作為對照。我們將SPF雞按順序接種卵黃抗體，而另一組接種了與之相當的生理鹽水，最終將它們置于相同的環境中，通過14d的持續監測，以確保實驗結果的準確性。

（5）抗體效價檢測

①血凝試驗：將96孔的微量板放置，從第1孔到第12孔中添加0.1MPBS 0.025 mL，在第1孔中添加0.025 mL的血凝素標準抗原，接著按順序進行2倍的稀釋，一直到第12孔。棄去第12孔的稀釋液，并設置紅細胞對照孔，然后從第1孔到第12孔加入1%雞紅細胞懸液0.025 mL，在振蕩器上混合均勻后，在10~30℃的環境下，靜置20~40 min，到對照孔中的紅細胞呈顯著紐扣形態，即可確認結果，使其100%的凝集的稀釋度，確認為其凝集價。

②血凝抑制試驗：通過血凝素的凝集價，我們可以確定4HAU抗原。如果我們的凝集價值是1∶1024，那么我們可以得出4HAU抗原是1∶256。將1 mL血凝素和9 mL緩沖液混合在一起，使其成1∶10稀釋的混合液，取1∶10稀釋液1 mL添加至24.6 mL 0.1 Mol/L PBS緩沖液中，以達到1∶256的濃度。將待檢樣品取出，在96孔微量板分別標記待檢樣品、病毒對照、紅細胞對照，取出3個加樣槽，分別標記0.1 mol/LPBS、4HAU、1%雞紅細胞懸液。從第1孔至第12孔，在待檢樣品組及病毒對照組中，每孔加入0.1 mol/LPBS 0.025 mL，紅細胞對照組每孔加入0.1 mol/LPBS 0.05 mL，使用移液器將被檢樣品混合均勻，然后加入第1孔中，進行2倍背比稀釋，稀釋倍數依次為2、4、8、16...和4096孔，將4HAU的血凝素和1 %的雞紅細胞懸液分別添加到待檢的樣本和病毒對照的試驗孔內，并將其放置于微量振蕩器震蕩均勻，在10~30℃的環境溫度下放置20~40 min。然后每孔再加入1%雞紅細胞懸液0.025 mL，同樣的環境溫度下放置20~40 min，當對照孔中的紅細胞呈顯著紐扣狀時即可開始判定結果。使紅細胞100%凝集抑制的樣品最高稀釋度為判定終點（凝集抑制價）。

2 結果與分析

（1）通過本次實驗，我們發現，不同的提取方法會導致卵黃抗體的物理性質發生變化。我們通過觀察提取液的顏色、氣味、透明度和體積，發現這些變化。具體情況可以參考表1和表2。

表1 使用不同方法提取卵黃抗體時的物理特征

表2 3種方法提取卵黃抗體的體積

由表1可知，酸化水提取的卵黃抗體具有良好的透明度，而辛酸法提取的卵黃抗體則存在一定的氣味，其中以氯仿法的效果最佳，但也會帶來一股刺鼻的氯仿氣味。由表2可知，本試驗采取的3種提取卵黃抗體的方法中，用相同體積的卵黃原液，以氯仿萃取法提取的卵黃抗體量最多，其次為酸化水提取法，而辛酸法提取的抗體量最少。

（2）安檢試驗：通過觀察SPF雞的存活情況，發現14 d后，3組免疫雞與對照組SPF雞一樣，均存活。這一情況表明，通過3種不同提取方法得到的卵黃抗體均對動物機體無毒害作用，安全可靠。

（3）通過對3種不同提取方法獲得的卵黃抗體進行血凝抑制試驗，我們發現它們的抗體效價存在顯著差異，具體情況可參見表3。

表3 3種方法提取卵黃抗體效價的對比

由表3可知，本試驗采取的3種提取卵黃抗體的方法中，氯仿萃取法得到的抗體，無論是新城疫還是禽流感，其效價最高，酸化水提取法略低于氯仿萃取法，而辛酸法的抗體效價最低。

3 小結與討論

在這項研究工作中，本課題組認為氯仿萃取法在提煉卵黃抗體時具有顯著的優勢，它的提取速度快，體積大，溶解度良好，但是萃取劑三氯甲烷具有潛在的危險，可導致嚴重的副反應，包括嘔吐、消化不良、食欲不振和神經系統癥狀，甚至可能導致病變。由于抗體的殘留可能會給動物的健康帶來潛在的危險，所以，應當采取措施避免這些情況的出現。此外，研究發現，抗體的殘余可能影響酶標板的吸附能力，從而使得ELISA檢測出現偽陽性，從而影響最終的診斷精度。酸化水提取法的提取率僅次于氯仿萃取法，且物理性狀較好，雖然抗體效價略低，但是后期如果用于生產，可以在生產過程中采用超濾濃縮技術，即可提高卵黃抗體效價。盡管辛酸法的抗體提取效率不高，抗體數量較少，抗體效價也不及其他兩種技術，然而，根據相關研究，它能夠更加準確地清除卵黃脂類，并且由于辛酸的溶解度很高，因此，它的殘留量幾乎可以忽略不計，對動物機體不會造成毒害作用[11]。

經過系統的研究，酸化水提取法在提取卵黃抗體方面具備了許多優勢：操作簡便、提取效果顯著、提取質量優良、化學試劑消耗量小、提取過程中沒有任何危害，而且提取出來的抗體質量更加穩定，并且提取過程也更加便捷，提取的卵黃抗體質量更加優良，因此，它具備了大范圍的應用前景。同時辛酸法去除脂類效果好，故而綜合考慮，酸化水提取法結合辛酸法是大規模生產最好的選擇[12]。

4 展望

根據農業農村部194號公告，規定了從2020年元旦開始，我們將嚴格禁止飼料中抗生素的使用，以防止抗生素的過度使用帶來的危害。卵黃抗體是一種更具安全性、可靠性和療效的抗菌劑，近年來已經被廣泛地運用于生物技術、醫療保健和食品工業[13]。卵黃抗體具備的優點有以下幾個方面：①制備原材料簡單、只需收集高免蛋即可，無需采血，對實驗動物機體不會造成傷害[14]。②免疫蛋雞的飼養成本相對較低，只需要少量的資源，就能夠獲得高品質的特異性卵黃抗體。③抗體的制備過程也相對簡單，無需使用復雜的儀器設備，因此生產成本也相對較低。④由于不與蛋白A、G和Fc受體結合，因此在進行免疫學檢測時，可以避免出現錯誤的結果。保證檢測結果準確性[15]。⑤卵黃抗體化學性質穩定、耐熱、耐酸，在60℃巴氏滅菌溫度下活性不會下降，在室溫下可存放4個月，2~8℃可存放數十年也不會失去活性。⑥安全、高效、無公害、不受地域和季節的限制，使用方便。基于以上的諸多優點，卵黃抗體已被開發成功能性食品、消毒劑及其他產品等，例如：作為食品添加劑以及飼料添加劑等[16]。盡管卵黃抗體的應用范圍越來越廣，但是目前尚未建立起一套完善的標準化流程和質量控制體系，同時也存在著生產工藝的不穩定性等諸多挑戰。然而，隨著卵黃抗體技術的持續改進和研究，以及生產方法的持續優化，卵黃抗體的應用前景將變得更加光明[17]。