富源某豬場高致病性藍耳病及豬圓環(huán)病毒病的實驗室檢測

李華高，荀紹雄，李方志，晏 波，潘 基，馬萬圣，潘愛查，湛峰一，雷洪梅，趙家禮，顧紹鋒，楊樹林，肖玉權(quán)，陳士春

（1.富源縣大河鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)農(nóng)村綜合服務(wù)中心，云南 富源 655500；2.富源縣動物疫病預(yù)防控制中心，云南 富源 655500；3.富源縣大河鎮(zhèn)龍澤畜禽養(yǎng)殖服務(wù)農(nóng)民專業(yè)合作社，云南 富源 655500）

1 前言

豬繁殖與呼吸綜合征是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）感染所致的一種急性傳染病，以繁殖障礙、呼吸系統(tǒng)疾病等為主要特征，主要引起母豬流產(chǎn)，產(chǎn)死胎、弱仔等臨床癥狀，簡稱豬藍耳病。藍耳病是一種接觸性的傳染病，呈地方性流行，一年四季都可發(fā)病，以夏秋兩季最為嚴重。持續(xù)性感染是藍耳病的重要特征，PRRSV在感染豬體內(nèi)存在時間長，通過血液循環(huán)引起胎豬受到感染。2022年9月份，富源某豬場部分豬只陸續(xù)出現(xiàn)不明高熱，發(fā)病豬主要是保育豬，死亡淘汰率在20%~30%。根據(jù)臨床及剖檢特點，懷疑有藍耳病或圓環(huán)病毒病的存在，而且這2種疾病會引起動物機體嚴重的免疫抑制，因此，檢測了PRRSV和PCV2，為豬場進一步采取全面、有效的措施打下了基礎(chǔ)，提供了方向。

2 材料與方法

2.1 實驗地點和時間

本試驗于2017年2—5月在云南農(nóng)業(yè)大學牧醫(yī)樓404實驗室進行。

2.2 病料來源

2017年2月份富源大河某豬場不同時間、不同周齡發(fā)病豬的脾臟、肺臟、淋巴結(jié)等病變器官，共15份。

2.3 實驗材料

2.3.1 儀器

手術(shù)剪刀、眼科剪刀、酒精燈、臺式高速離心機、電泳儀、電泳槽、微量移液器、凝膠成像系統(tǒng)、恒溫培養(yǎng)箱、恒溫水浴鍋、電子秤量器、搖床、離心管、槍頭、乳膠手套等。

2.3.2 溶液及試劑

化學試劑：TE緩沖液（含RNA酶）、Tris飽和酚、氯仿、異戊醇、異丙醇、70%乙醇。酶類：蛋白酶K、RNA酶等。電泳類試劑：1×TBE電泳緩沖液、6×蔗糖上樣緩沖液、溴化乙啶溶液（EB）、瓊脂糖凝膠。

2.4 實驗方法

2.4.1 PRRSV的檢測

（1）病毒RNA的提取

取病料脾臟、肺臟和淋巴結(jié)病變組織，液氮研磨。應(yīng)用TRIZOL Reagent細胞裂解液按常規(guī)方法提取組織總RNA，用于病毒基因組反轉(zhuǎn)錄和PCR擴增。提取過程中所有的器皿及消耗品均用DEPC處理，避免RNA酶的污染，給獲得組織RNA帶來困難。

（2）RT-PCR擴增

①在微量離心管中配制如下表1溶液，置于冰盒上混勻，37℃下靜置10 min后移入 42℃水浴鍋中保溫 1 h。

表1 微量離心管中配制溶液

②PCR反應(yīng)體系：在微量離心管中配制如下表2 DNA 溶液（置于冰盒上）。

表2 微量離心管中配制DNA溶液

③擴增DNA 片段的 PCR 反應(yīng)條件如下：

（3）電泳檢測

①1%瓊脂糖凝膠的配制 稱取1 g瓊脂糖，置于三角瓶中，加入100 mL TBE工作液，混勻后將該三角瓶置于微波爐加熱煮沸10sec，加入20μL（約1滴）溴化乙啶（1 mg/ mL），混勻后室溫降溫至50℃左右。用擋板封住膠板，在固定位置放上梳子，將凝膠緩慢倒入膠板，室溫下靜止30 min左右，待凝膠凝固后，輕輕拔出梳子。拔掉擋板，將凝膠板放入含有TBE緩沖液的電泳槽中。

②點樣 取5 μL提取的動物基因組DNA，分別與適量的溴酚藍（樣品的1/5）混勻后，點入凝膠孔內(nèi)。同時將分子量標記5μL（GL2000）也點入凝膠第一孔位置內(nèi)。注：GL2000分子量標記分別是：2000、1600、1000、750、500、250和100bp。

③電泳 接通電源后，將電泳儀的電壓調(diào)至100V，電泳1h左右，溴酚籃移動距點樣孔2 cm左右，停止電泳。

④觀察和拍照 將凝膠從凝膠板上取下，放到紫外觀察箱中，打開紫外觀察燈254 nm，可見到大分子量的動物基因組DNA。凝膠DNA的拍照采用凝膠成像儀。

（4）目的基因的純化

將RT-PCR擴增出的目的片段膠回收，使用大連寶生物工程有限公司（TaKaRa）Agarose Gel DNA Fragment Recovery Kit Ver.2.0試劑盒進行回收，將膠回收的產(chǎn)物送至大連寶生物工程有限公司（TaKaRa）進行測序。

2.4.2 PCV2的檢測

（1）病毒DNA的提取

用剪刀剪取病豬脾臟、肺臟和淋巴結(jié)組織約0.2~0.5 g于1.5 mL離心管內(nèi)。加入700 mL STE液（含RNA酶），同時加入77 mL 10%SDS液（總體積1/10），用眼科剪刀剪碎組織樣品。加入20 mL 蛋白酶K（20 mg/ mL），指彈混勻。70℃消化20 min后加700 mL Tri飽和酚，置脫色搖床抽提10 min。12000 r/min離心1 min，取上清液于另一1.5 mL離心管中。加700μL 酚氯仿（1：1）于離心管中，置于脫色搖床抽提10 min。12000 r/min離心1 min，取上清液于另一1.5 mL離心管中。加700 μL氯仿－異戊醇（24∶1），置于脫色搖床抽提10 min。

（2）PCR擴增

①在微量離心管中配制如下表3 DNA 溶液（置于冰盒上）。

表3 微量離心管中配制DNA 溶液

②擴增DNA 片段的 PCR 反應(yīng)條件如下：

（3）電泳檢測 步驟同2.4.1（3）。

（4）目的基因的純化 步驟同2.4.1（4），將膠回收的產(chǎn)物送至大連寶生物（TaKaRa）公司進行測序。

3 結(jié)果

3.1 病豬的臨床癥狀及剖檢

發(fā)病豬主要是保育豬，28d斷奶留床7d，后轉(zhuǎn)入保育舍，在保育舍7到20d發(fā)病，病豬體溫39~42℃不等，20d后慢慢穩(wěn)定，死亡淘汰率在20%~30%。免疫器官全身淋巴結(jié)不同程度的腫大，特別是腹股溝淋巴結(jié)腫大明顯。脾大，邊緣有丘狀突起以及出血性梗死灶。

3.2 PRRSV的檢測

擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，在約421bp處出現(xiàn)擴增條帶，其大小與設(shè)計的PRRSV-F和PRRSV-R預(yù)期擴增的目的片段相一致。測序結(jié)果經(jīng)比對分析，與已公布的序列相符。

3.3 PCV2的檢測

擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，在約522bp處出現(xiàn)擴增條帶，其大小與設(shè)計的PCV2-F和PCV2-R擴增出的預(yù)期片段相一致。測序結(jié)果經(jīng)比對分析，與已公布的序列相符。

4 討論

目前，我國豬場PRRSV感染非常普遍，陽性場也很高，但并不是所有陽性場都會發(fā)生藍耳病。同時，我國圓環(huán)病毒病感染的豬場也較多，圓環(huán)病毒病流行越來越廣泛，甚至育肥豬早期也常有感染。流行引起的原因有：①圓環(huán)病毒抵抗力強，一般消毒劑無效。此病毒無囊膜，對醇、氯、碘、苯酚等有機消毒劑具有抵抗力，但能夠被堿性消毒劑（氫氧化鈉）、氧化劑（次氯酸鈉）和季銨鹽化合物滅活；②PCV2 基因變異：有PCV2a、PCV2b、PCV2d 型等；③PCV2 傳播途徑多，可水平傳播和垂直傳播；④養(yǎng)殖場對PCV2的免疫抑制危害認識不夠。影響圓環(huán)病毒病疫苗免疫效力的因素有很多，其中，最重要的有疫苗質(zhì)量、使用方法、免疫程序、豬群健康狀態(tài)等，應(yīng)客觀、辯證地分析疫苗免疫效力。另外，PCV2母源抗體有保護作用，并且有抗體滴度依賴性。試驗研究表明：未吃到初乳的仔豬更易發(fā)病；抗體水平低的母豬所產(chǎn)仔豬死亡率高于抗體高的母豬后代；母豬血清 PCV2含量高，其仔豬死亡率也高。因此在飼養(yǎng)管理中也應(yīng)注意，盡量做到使仔豬比較均等攝入足量的母源抗體。

總之，需要結(jié)合豬場的實際特點，將疫苗免疫技術(shù)、閉群 200 d凈化技術(shù)、生物安全控制技術(shù)、新的飼養(yǎng)模式、血清人工馴化技術(shù)、藥物預(yù)防與保健等新技術(shù)合理地利用起來，對PRRSV和PCV2提供更為全面、有效的綜合防控措施。

5 結(jié)論

本實驗成功提取了病料中的RNA和DNA，采用RT-PCR、PCR方法檢測出了PRRSV和PCV2，判定該豬場患病豬確為豬藍耳病和圓環(huán)病毒病陽性。通過對PRRSV和PCV2的危害、傳播特點及商品化疫苗的現(xiàn)狀等問題進行分析，總結(jié)了豬場在PRRSV和PCV2的防控方面的有效手段，為我縣養(yǎng)豬業(yè)更為健康地發(fā)展提供幫助。