基于SSR標記的12個非洲菊品種指紋圖譜構建及雜交F1后代鑒定

劉小飛，于 波，任桂萍，余超然，劉 沖，孫映波，鐘榮輝，馮恩友

（1.廣東省農業科學院環境園藝研究所/廣東省園林花卉種質創新綜合利用重點實驗室/農業農村部華南都市農業重點實驗室，廣東 廣州 510640；2.湛江市農業科學研究院/廣東省農業科學院湛江分院，廣東 湛江 524003；3.云南大學生命科學學院，云南 昆明 650500；4.廣東省農業科學院蔬菜研究所/廣東省蔬菜新技術研究重點實驗室，廣東 廣州 510640；5.廣東省農業科學院農業資源與環境研究所，廣東 廣州 510640）

【研究意義】非洲菊（Gerberahybrida）是菊科扶郎花屬多年生常綠草本植物，別名扶郎花、舞娘花、燈盞花［1］，原產于南非，在溫度適宜的條件下可周年開花，具有很高的觀賞價值，是世界十大切花之一［2-3］，園藝品種繁多，商品名稱易混淆，不利于種質資源的收集與鑒評。因此，開發適用于非洲菊種質資源鑒評的分子標記，可實現對非洲菊種質資源的快速鑒評，為非洲菊新品種選育奠定基礎。【前人研究進展】目前，在三色堇［4］、桂花［5］、牡丹［6］、山茶［7］和三角梅［8］等花卉中均已開發出相應的SSR 標記，但有關非洲菊SSR 標記開發的報道尚較少［9-10］。林發壯等［9］對非洲菊‘云南紅’轉錄組序列的SSR位點進行挖掘，發現其SSR 位點豐富，分布密度大，具有較高的多態性潛能，可作為開發SSR 標記的有效來源。在菊屬種質資源遺傳多樣性研究中，SSR 分子標記技術應用廣泛。肖雨沙等［11］對南美蟛蜞菊轉錄組測序得到的23 338 個SSR 位點設計引物，隨機選擇200 對引物進行擴增實驗驗證，有效擴增55 對，其中6 對引物特異性高，重復性好。宋江琴等［12］基于表型性狀和SSR 標記的9 份萬壽菊種質遺傳多樣性分析發現9 個材料具有較高的遺傳多樣性，且兩種聚類結果總體上較為一致。丁紅旭［13］對菊花全長轉錄組測序結果開發 的SSR 標記進行綜合研究，發現這些標記在菊花全長轉錄組5'UTR 區擴增多態性最高，且部分SSR 與對應性狀相關聯，菊花插穗再生植株和組培苗中SSR 標記的多態性受5-氮雜胞苷（5-Azacytidine，5-azaC）或甲基磺酸乙酯（Ethyl methane sulfonate，EMS）處理影響。Yuan 等［14］基于SSR 標記多態性對中國菊花品種進行鑒定和分類，為菊花種質資源鑒評奠定了良好基礎。【本研究切入點】目前非洲菊SSR 標記的開發和應用尚不多見，有關SSR 標記在非洲菊種質資源鑒評和雜交后代快速鑒定中的應用研究仍較少。【擬解決的關鍵問題】綜上，本研究采用18 對SSR標記對12 份非洲菊種質進行親緣關系分析，構建其指紋圖譜，并對部分品種的雜交后代的真假雜種進行鑒定，篩選出可用于非洲菊分子育種的SSR 熒光標記引物，以期為非洲菊種質資源鑒評及創新利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2021 年12 月25 日，于湛江市農業科學研究院從云南寬霆生物科技有限公司購買11 份非洲菊種質（表1）的種苗，7 d 后移栽至直徑5 cm 的黑色種植袋，放于大棚苗床上培養，培養溫度為25～30 ℃，45 d 后移栽至廣東省農業科學院環境園藝研究所上盆培養；同時從華南師范大學引種‘深圳5 號’（第12 份種質），培養溫度同上。2022 年2 月14 日，取2 月苗齡的非洲菊幼嫩葉片為材料，-80℃保存備用。受檢的雜交后代以紫水晶（Gerberahybrida‘Zishuijing’）為母本，以粉佳人（Gerberahybrida‘Fenjiaren’）為父本，獲得雜交F1代2 個單株（Gh-1 和Gh-4）；以粉佳人為母本，以紫水晶為父本，獲得雜交F1代1個單株（Gh-5），2023 年7 月13 日，取播種后6月苗齡雜交苗幼嫩葉片為材料，-80 ℃保存備用。

表1 供試材料Table 1 Information of 12 G.hybrida germplasms 12 份非洲菊種質信息

試驗用試劑：TaqPlus DNA 聚合酶（B600090，生工生物工程股份有限公司），POP-7TMPolymer〔4363785，ThermoFisher（Applied BiosystemsTM）〕，HiDiFormamide〔4311320，ThermoFisher（Applied BiosystemsTM）〕；其他常用試劑均由生工生物工程股份有限公司提供。

主要儀器：PCR 儀（VeritiTM96well，美國ABI），凝膠成像儀（FR-980A，上海復日科技有限公司），測序儀（3730XL，美國ABI），臺式高速離心機（TD5A-WS，湖南湘儀實驗儀器開發有限公司），電泳儀（DYY-6C，北京六一儀器廠），電泳槽（DYCP-32B，北京六一儀器廠），UVVis Spectrophotometer（SMA4000，Merinton）。

1.2 DNA 提取

使用Ezup 柱式植物組織基因組DNA 抽屜試劑盒（生工生物工程股份有限公司，B518261），參考劉小飛等［15］方法進行提取，提取DNA 后電泳檢測DNA 質量，并保存于-20 ℃備用。

1.3 引物合成

從非洲菊‘香檳’（Gerberahybrida‘Champagne’）轉錄組（SRA accession：PRJNA378315）測序得到的SSR 標記中隨機挑選出2 堿基和3堿基重復類型的SSR 標記，設計引物（表2），初篩后，選擇條帶清晰且多態性好的引物合成帶M13 標記（正向引物，序列為：5'-TGTAAAACGACGGCCAGT-3'）的熒光引物，熒光標記6-FAM（藍色）、HEX（綠色）、TAMRA（黑色）和ROX（紅色）均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表2 SSR 引物序列Table 2 SSR primer sequences

1.4 PCR 反應體系及程序

PCR 反應體系：10×TaqBuffer（含Mg2+）2.5 μL，20～50 ng/μL 模板DNA 1 μL，10 μmol/L 正向引物 0.5 μL，10 μmol/L 反向引物 0.5 μL，10 μmol/L dNTP（mix）0.5 μL，5 U/μLTaq酶0.2 μL，以ddH2O 補足25 μL。PCR 反應條件：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，2～4 個循環；94 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，30 個循環；72 ℃ 10 min。

1.5 毛細管電泳檢測SSR 標記熒光引物的多態性

參考白松等［16］方法，使用ABI 測序儀（3730 xl）對擴增結果進行檢測。

1.6 數據分析

使用Genemapper 軟件分析SSR 數據，使用Excel 進行常規分析。指紋圖譜編碼方法參見文獻［17］，UPGMA 聚類分析方法參見文獻［18］。

2 結果與分析

2.1 SSR 引物篩選結果

提取12 份非洲菊種質的基因組DNA（圖1）后，基于非洲菊‘香檳’轉錄組中篩選出50 對SSR 標記（表2），以每對引物PCR 擴增4 個樣品進行初篩。電泳結果（圖2）顯示，GHSSR-1/6/9/10/13/14/16/17/18/20/21/24/25/30/36/38/39/43共計18 對引物的擴增條帶清晰，多態性較好，合成帶M13 標記（正向引物）的熒光引物（表3）用于后續試驗。

圖1 12 份非洲菊種質基因組DNA 提取電泳檢測結果Fig.1 Genomic DNA extraction and electrophoresis detection results of 12 varieties of Gerbera hybrida

圖2 基于50 個SSR 標記設計引物的PCR 擴增電泳結果Fig.2 Result of PCR amplification electrophoresis based on 50 SSR markers designed primers

表3 用于毛細管電泳的SSR 引物連接M13 接頭情況Table 3 SSR primer connection M13 connector for capillary electrophoresis

2.2 18 對引物在12 份非洲菊種質擴增后的毛細管電泳結果

使用Genemapper 軟件分析毛細管電泳結果發現，18 對引物共擴增出74 個等位位點，平均每對引物擴增4.1 個（表4）。其中，GHSSR-1、GHSSR-18、GHSSR-20 和GHSSR-21 多態性較好，分別擴增出9、7、7 和7 個等位位點，這4 對引物分別帶有HEX（綠色）、6-FAM（藍色）、6-FAM（藍色）和ROX（紅色）標記，SSR 標記類型均分別為AG（2*8）、TCT（3*5）、CA（2*6）和GT（2*6）。綜上，該4 個SSR 標記設計的引物可作為核心引物用于指紋圖譜構建。

表4 18 對引物在12 份非洲菊種質PCR 擴增后的毛細管電泳結果Table 4 Capillary electrophoresis results of 18 pairs of primers after PCR amplification in 12 varieties of Gerbera hybrida

2.3 12 份非洲菊種質指紋圖譜構建

將4 對核心引物（GHSSR-1、GHSSR-18、GHSSR-20 和GHSSR-21）在12 個非洲菊品種中擴增的等位位點進行串聯排列，得出對應的指紋圖譜編碼。結果表明，12 個非洲菊品種的編碼均不相同，可有效對不同非洲菊品種進行區分（表5）。

表5 12 份非洲菊種質的DNA 指紋編碼Table 5 DNA fingerprint code of 12 varieties of Gerbera hybrida

2.4 12 份非洲菊種質聚類分析

依據18 對引物在12 份非洲菊種質中的毛細管電泳結果進行UPGMA 聚類，結果顯示，在遺傳系數為0.75 時，可將12 個非洲菊品種分為5組：Ⅰ組包含3 個品種，分別是‘云南紅’‘大088’和‘情人’；Ⅱ組包含4 個品種，分別是‘粉佳人’‘粉球’‘真愛’和‘福娃’；Ⅲ組包含3 個品種，分別是‘繡色’‘淑女’和‘黃球’；Ⅳ組包含1 個品種‘紫水晶’；Ⅴ組包含1 個品種‘深圳5 號’（圖3）。

圖3 12 份非洲菊種質UPGMA 聚類分析Fig.3 UPGMA cluster analysis of 12 varieties of Gerbera hybrida

2.5 部分非洲菊品種真假雜種鑒定

使 用GHSSR-18、GHSSR-20 和GHSSR-21 3對引物對‘紫水晶’和‘粉佳人’的雜交F1后代進行PCR 擴增，毛細管電泳檢測結果顯示，上述3 對引物鑒定出兼具雙親特異位點的單株分別是Gh-5、Gh-4 和Gh-1（表6、圖4），單獨1 對引物的鑒定率為33%。綜合3 對引物的鑒定結果，發現受檢的3 個單株均為真雜種，真雜種率為100%。

圖4 3 株雜交F1 實生苗的擴增圖譜Fig.4 Amplification maps of three hybrid F1 seedings

表6 不同 SSR 位點在雜交 F1 實生苗中的分布情況Table 6 Distribution of different SSR loci in hybrid F1 seedings

3 討論

非洲菊具有較高的觀賞價值，在盆栽方面亦有很大的發展潛力，但在我國難以獲得種子，常規雜交育種時間長［19］，急需可縮短育種周期的技術體系。同時，從市場上收集的品種因無法有效了解其來源，為育種帶來較大困擾。SSR 分子標記以其穩定、高效及多態性好的優點成為種質資源鑒評的重要手段［20-21］。王繼華等［10］對來源于Plant genome Network 的非洲菊EST 序列SSR進行系統分析，發現SSR 重復單元中，富含A/T核苷酸的重復單元占據優勢地位，而富含G/C 的重復單元在基因編碼區中含量較低。冗余與非冗余的SSR 分布頻率與密度相似，僅存在較小距差，說明可從現有的EST 數據中篩選出有效的微衛星標記。林發壯等［9］對非洲菊‘云南紅’轉錄組序列的SSR 位點進行挖掘，發現14 928 個SSR 位點由73 種重復基序構成，（A/T）、（AG/CT、AC/GT）、（AAT/ ATT、AAG/CTT)分別是單核苷酸、二核苷酸和三核苷酸優勢重復基元，分別占總SSR 重復類型的62.31%、18.13%和6.93%。類似地，本研究所選用的50 對引物（表2）的SSR 重復單元中，富含A/T 核苷酸的重復單元也高于富含G/C 的重復單元。

非洲菊已有的SSR 分子標記研究中，多集中在SSR 位點信息［9］、SSR 頻率和分布特點分析［10］等方面，在資源鑒評與創新利用方面的研究較少。本研究利用18 對擴增效果穩定的SSR 引物檢測了12 份非洲菊種質，結果顯示可以將其分為5組，其中，‘紫水晶’和‘深圳5 號’單獨為一組，與‘粉佳人’親緣關系較遠，后續的雜交育種中將首先選用親緣關系較遠且觀賞性狀優良的‘紫水晶’和‘粉佳人’開展試驗，也將選擇‘紫水晶’和‘深圳5 號’為親本開展不同的雜交組合，探索不同品種間的雜交親和性及結實情況。同 時，以GHSSR-1、GHSSR-18、GHSSR-20 和GHSSR-21 4 對引物為核心，成功構建12 份非洲菊種質的指紋圖譜，為非洲菊種質資源鑒評提供了可靠的SSR 熒光標記引物。在此基礎上，利用GHSSR-18、GHSSR-20 和GHSSR-21 3 對引物對‘粉佳人’和‘紫水晶’的3 個雜交F1后代進行真假雜種鑒定，綜合得出3 個雜交F1后代實生苗均為真雜種，初步建立了非洲菊雜交后代快速鑒定技術，為縮短非洲菊育種周期奠定基礎。

4 結論

本研究從云南寬霆生物科技有限公司和華南師范大學生命科學學院共收集了12 份非洲菊種質，通過預實驗篩選出18 對多態性較好的引物，合成帶M13 接頭的熒光引物。利用其檢測12 份非洲菊材料，經毛細管電泳檢測獲得對應的多態性結果，聚類分析將其分為5 組。同時，借助GHSSR-1、GHSSR-18、GHSSR-20 和GHSSR-21等4 對核心引物構建了12 個非洲菊品種的指紋圖譜。利用后3 對引物對‘粉佳人’和‘紫水晶’的雜交F1后代進行真假雜種檢測，綜合3 對引物的結果判斷3 個單株均為真雜種。本研究為非洲菊種質資源鑒評和創新利用提供了可靠的SSR 熒光標記引物，同時，也為非洲菊雜交后代的快速鑒定提供了可用的技術體系。