內(nèi)皮型一氧化氮合酶G894T基因多態(tài)性與2型糖尿病腎病關(guān)系的Meta分析

徐石張，謝敏娟

內(nèi)皮型一氧化氮合酶G894T基因多態(tài)性與2型糖尿病腎病關(guān)系的Meta分析

徐石張1，謝敏娟2

1.宜春市人民醫(yī)院腎內(nèi)科，江西宜春 336000；2.宜春學(xué)院病理教研室，江西宜春 336000

系統(tǒng)性評價內(nèi)皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxidesynthase，eNOS）中G894T基因多態(tài)性與2型糖尿病腎病（type 2 diabetic nephropathy，T2DN）的關(guān)聯(lián)。計算機檢索PubMed、Cochrane Library、EMBASE、Science Citation Index、Wiley Online Library、Google Scholar、中國期刊全文數(shù)據(jù)庫、中國生物醫(yī)學(xué)文獻數(shù)據(jù)、萬方數(shù)據(jù)庫、中國科技期刊數(shù)據(jù)庫等電子數(shù)據(jù)庫，根據(jù)納入與排除標準，納入G894T基因多態(tài)性與T2DN關(guān)聯(lián)的病例對照研究，利用Review Manager5.1和Stata12.0軟件，對相關(guān)基因型與等位基因頻率的差異行Meta分析。此次研究納入23篇文獻，共包含T2DN患者4655例與2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）患者4093例。①T2DN組基因型TT頻率（=1.39，95%：1.10～1.76，<0.01）與基因型GT頻率（=1.33，95%：1.13～1.57，<0.01）均明顯高于T2DM組，基因型GG頻率明顯低于T2DM組（=0.66，95%：0.55～0.79，<0.01），結(jié)果均存在明顯異質(zhì)性。②等位基因T的頻率T2DN組明顯高于T2DM組（=1.41，95%：1.21～1.65，<0.01）。③中國人群T2DN組基因型GT頻率（=2.37，95%：1.81～3.09，<0.01）與等位基因T頻率（=2.07，95%：1.62～2.65，<0.01）均明顯高于T2DM組，基因型GG頻率明顯低于T2DM組（=0.42，95%：0.32～0.55，<0.01），且結(jié)果均無統(tǒng)計學(xué)異質(zhì)性。④ 2項研究中的對照組不符合Hardy-Weinberg平衡，剔除該2項研究后行敏感性分析，結(jié)果無明顯變化。G894T基因多態(tài)性可能與T2DN的發(fā)病相關(guān)。

2型糖尿病；糖尿病腎病；一氧化氮合酶；基因多態(tài)性；Meta分析

內(nèi)皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxidesynthase，eNOS）含有25個內(nèi)含子和26個外顯子，編碼1個含有1203個氨基酸的蛋白質(zhì)，eNOS基因是第一個被測定的人類NOS基因[1]。有研究證實eNOS基因存在多種變異，其中第7外顯子處G894為T變異最為常見，將導(dǎo)致編碼的谷氨酸變成天冬氨酸。eNOS基因的G894T變異和多種疾病密切相關(guān)，其中與糖尿病性腎病（diabetic nephropathy，DN）的關(guān)系研究最常見，而糖尿病的高糖狀態(tài)也可直接抑制eNOS基因的表達[2-3]。

目前，已有部分文獻報道eNOS中G894T基因多態(tài)性與T2DN的關(guān)系，但結(jié)論仍存在爭議。本研究檢索和納入相關(guān)文獻，著重探討我國人群中G894T基因多態(tài)性與T2DN的關(guān)系，并進行Meta分析。同時，利用敏感性分析與回歸分析從多角度研究總體異質(zhì)性的來源，并以獨特的多重亞組分析方法逐個進行報道。

1 材料與方法

1.1 檢索策略

以“endothelial nitric oxide synthase” “eNOS” “NOS” “G894T” “diabetic nephropathy” “DN” “polymorphism” “內(nèi)皮細胞eNOS” “一氧化氮合酶” “2型糖尿病” “糖尿病性腎病” “基因多態(tài)性”為主題詞、標題詞、關(guān)鍵詞，分別檢索PubMed、EMBASE、Cochrane Library、Wiley Online Library、Science Citation Index、Google Scholar、中國期刊全文數(shù)據(jù)庫、萬方數(shù)據(jù)庫、中國生物醫(yī)學(xué)文獻數(shù)據(jù)、中國科技期刊數(shù)據(jù)庫等電子數(shù)據(jù)庫。以PubMed數(shù)據(jù)庫為例，英文檢索式：“endothelial nitric oxide synthase” (MeSH) OR “polymorphism” (MeSH) OR “diabetic nephropathy” (MeSH)；以中國生物醫(yī)學(xué)文獻數(shù)據(jù)庫為例，中文檢索式：“一氧化氮合酶”O(jiān)R “多態(tài)性” OR “糖尿病性腎病”。檢索時間均為1990年1月至2021年12月。并同時檢索納入文獻的參考文獻。

1.2 文獻選擇

納入標準：①eNOS中G894T基因變異與T2DN關(guān)聯(lián)性的病例對照研究；②文獻中有描述 2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）的診斷標準；③對照組為T2DM患者，且不伴有糖尿病性腎病；④文獻中明確提供各個等位基因或基因型的例數(shù)；⑤PCR引物基因序列設(shè)計中，正向引物：5?-AAG GCA GGA GAC AGT GGA TGG A-3?，負向引物：5?-CCC AGT CAA TCC CTT TGG TGC TCA-3?。

排除標準：①研究對象不明確，或包含1型糖尿病患者；②重復(fù)數(shù)據(jù)的研究。

1.3 數(shù)據(jù)提取

兩名研究員分別獨立提取納入文獻的相關(guān)數(shù)據(jù)，包含第一作者、發(fā)表時間、國家、對象類型（實驗組、對照組）、Hardy-Weinberg（-）平衡檢驗、腎病組病例數(shù)（GG、GT、TT）、非腎病組病例數(shù)（GG、GT、TT）等。當(dāng)提取數(shù)據(jù)存在差異，則由第三位研究員發(fā)起討論后決定。

1.4 文獻偏倚風(fēng)險評價

依照NHI-NHGRI研究工作組推薦的遺傳關(guān)聯(lián)性研究報告規(guī)范對納入文獻進行偏倚風(fēng)險評價。每項標準以“是（滿足）” “否（不滿足）” “不清楚（未描述）”分別進行評價。內(nèi)容：計算把握度、對照組特征、實驗組特征、連鎖不平衡檢測、多態(tài)性檢測、計算錯誤率、-檢驗、盲法、多重檢驗校正、協(xié)變量調(diào)整、危險因素發(fā)現(xiàn)、人群分層分析、重復(fù)性、功能驗證性試驗。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

利用RevMan公司官方網(wǎng)站提供的Review Manager 5.1軟件，對納入的研究進行Meta分析。分類變量采用相對危險度（odds ratio，OR）合并總體效應(yīng)，連續(xù)性變量采用加權(quán)均數(shù)差（weighted mean difference，WMD）合并總體效應(yīng)。每個合并研究效應(yīng)量均做異質(zhì)性檢驗，如值統(tǒng)計量、2統(tǒng)計量，若<0.10說明存在異質(zhì)性，則采用隨機效應(yīng)模型，反之采用固定效應(yīng)模型。利用Stata12.0軟件對研究進行發(fā)表偏倚檢驗（漏斗圖、Begg檢驗），并對存在異質(zhì)性的研究進行回歸分析，探討其異質(zhì)性來源。總體結(jié)果以<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 文獻資料

依照檢索策略對數(shù)據(jù)庫進行檢索，初步獲得173篇文獻，閱讀摘要后排除125篇內(nèi)容不相關(guān)文獻，對剩余的48篇文獻進行精讀，根據(jù)納入與排除標準，最終23篇文獻納入此次系統(tǒng)評價，篩選流程見圖1[4-26]；其中包含16篇外文研究，有2篇文獻中對照組不符合-平衡。23篇文獻中共8748例患者，其中T2DM患者4093例，T2DN患者4655例，一般情況和基因型數(shù)據(jù)見表1，文獻偏倚風(fēng)險評價見圖2。

2.2 不同基因型與T2DN的關(guān)系

將23篇文獻中基因型GG的頻率進行Meta分析，結(jié)果存在統(tǒng)計學(xué)異質(zhì)性（<0.01，2=71%），采用隨機效應(yīng)模型合并結(jié)果，總體效應(yīng)顯示T2DN組基因型GG頻率明顯低于T2DM組（=0.66，95%：0.55～0.79，<0.01）（圖3）。同樣，基因型TT與基因型GT文獻間均有異質(zhì)性，隨機效應(yīng)模型的Meta分析結(jié)果顯示，T2DN組基因型TT頻率（=1.39，95%：1.10～1.76，<0.01）與基因型GT頻率（=1.33，95%：1.13～1.57，<0.01）均明顯高于T2DM組，見圖4、圖5。

2.3 等位基因T與T2DN的關(guān)系

Meta分析中等位基因T的異質(zhì)性檢驗，<0.01，2=73%，有統(tǒng)計學(xué)異質(zhì)性，采用隨機效應(yīng)模型合并結(jié)果，顯示等位基因T的頻率T2DN組明顯高于T2DM組（=1.41，95%：1.21～1.65，<0.01），見圖6。

圖1 文獻篩選流程

表1 納入文獻的一般資料

注：DN：糖尿病腎病；DM：糖尿病；HWE：Hardy-Weinberg（-）平衡

2.4 不同亞組中基因多態(tài)性與T2DN的關(guān)系

針對文獻發(fā)表年份、-平衡、不同人群等多因素，采用Meta分析方法對異質(zhì)性來源進行研究，在基因型GG與基因型GT Meta分析中發(fā)現(xiàn)不同人群是總體效應(yīng)的異質(zhì)性來源之一。其中，中國人群T2DN組基因型GG頻率明顯低于T2DM組（=0.42，95%：0.32～0.55，<0.01），且結(jié)果無統(tǒng)計學(xué)異質(zhì)性（=0.66，2=0）。中國人群T2DN組基因型GT頻率高于T2DM組（=2.37，95%：1.81～3.09，<0.01），研究文獻具有同質(zhì)性（=0.63，2=0），見表2。在基因型TT Meta分析中，發(fā)現(xiàn)-平衡是總體異質(zhì)性來源之一。在符合-平衡文獻中，亞組分析顯示T2DN組基因型TT頻率顯著高于T2DM組（=1.48，95%：1.19～1.84，<0.01），且結(jié)果不存在異質(zhì)性（=0.10，2=34%）。

圖2 納入文獻的偏倚風(fēng)險評價

注：1：計算把握度；2：對照組特征；3：實驗組特征；4：連鎖不平衡檢測；5：多態(tài)性檢測；6：計算錯誤率；7：-檢驗；8：盲法；9：多重檢驗校正；10：協(xié)變量調(diào)整；11：危險因素發(fā)現(xiàn)；12：人群分層分析；13：重復(fù)性；14：功能驗證性試驗

圖3 基因型GG與T2DN關(guān)聯(lián)性的Meta分析

圖4 基因型GT與T2DN關(guān)聯(lián)性的Meta分析

圖5 基因型TT與T2DN關(guān)聯(lián)性的Meta分析

圖6 等位基因T與T2DN關(guān)聯(lián)性的Meta分析

等位基因T的Meta回歸分析發(fā)現(xiàn)，不同人群與-平衡均是總體效應(yīng)的異質(zhì)性來源。進行亞組分析顯示，中國人群T2DN組等位基因T頻率明顯高于T2DM組（=2.07，95%：1.62～2.65，<0.01），且結(jié)果無統(tǒng)計學(xué)異質(zhì)性（=0.82，2=0）。在符合-平衡的亞洲文獻中，亞組分析顯示人群T2DN組等位基因T頻率高于對照組（=1.72，95%：1.48～2.00，<0.01），且結(jié)果無異質(zhì)性（=0.20，2=23%）。

3 討論

由于人群遷移、不隨機婚配等因素，不同群體間基因型比例存在差異，若研究群體符合-平衡，就考慮來自同一蒙德爾群體，能有效減少研究中的群體差異，提高研究整體質(zhì)量[27-28]。本次Meta分析中包含2項亞洲人群研究不符合-平衡，將其數(shù)據(jù)剔除后行敏感性分析，發(fā)現(xiàn)結(jié)果與全體研究一致，仍存在明顯異質(zhì)性。為深入探討其異質(zhì)性來源，本研究針對文獻發(fā)表年份、-平衡、不同人群等多因素，通過Meta回歸分析發(fā)現(xiàn)-平衡與不同人群是總體效應(yīng)異質(zhì)性的主要來源之一，再次將2項研究數(shù)據(jù)剔除后行亞組分析，發(fā)現(xiàn)亞洲人群T2DN組中等位基因T與基因型TT的頻率均明顯高于T2DM組，而基因型GG的頻率顯著低于T2DM組，且結(jié)果均不存在統(tǒng)計學(xué)異質(zhì)性。而在非洲人群的亞組分析中得到類似的結(jié)果。因此，后續(xù)同類對照研究時，樣本應(yīng)盡量選用同一蒙德爾群體。

表2 G894T基因多態(tài)性的亞組分析

注：HWE：Hardy-Weinberg（-）平衡

eNOS基因是第一個被測定的NOS基因，關(guān)于eNOS基因多態(tài)性與DN的關(guān)系研究最多，被認為是DN的惡化因子而非啟動因素，等位基因a、等位基因T、基因型TT頻率等因素均可影響其表達。eNOS的基因變異包含多個位點，其中第7位外顯子處G894→T突變，導(dǎo)致密碼子298位谷氨酸被天門冬氨酸替代，影響酶的空間結(jié)構(gòu)與活性下降，通過降低NO的生成，調(diào)節(jié)血管舒張，抑制血小板及單核細胞的黏附，抑制血管平滑肌細胞增殖[3]。在DN中，eNOS基因多態(tài)性通過產(chǎn)生異常NO水平影響血壓改變和動脈粥樣硬化，對腎臟的保護作用減弱而加速DN的進展。在我國人群中，G894T突變是一種常見的eNOS基因變異。此次Meta分析中納入7項我國人群的研究，共包含571名T2DM患者與731名T2DN患者。但所有T2DM患者中均未檢測到基因型TT，僅有1例T2DN患者屬于基因型TT。在多重亞組分析中，我國人群T2DN組基因型GG頻率明顯低于T2DM組，而基因型GT與等位基因T頻率顯著高于T2DM組，且結(jié)果均無統(tǒng)計學(xué)異質(zhì)性。因此，eNOS中G894T突變可能是我國人群T2DN的危險因素與惡化因子，但需將來進一步證實。

本研究進行了多項亞組分析，包括-平衡、不同人群、不同種族等，盡量減小樣本差異導(dǎo)致的研究缺陷。eNOS中G894T基因多態(tài)性可能與T2DN發(fā)病存在聯(lián)系，而樣本質(zhì)量、對照人群的選擇可能是影響此次Meta分析結(jié)果的因素，深入探討時需要在種族、地域分類基礎(chǔ)上進行大規(guī)模、大樣本的針對性研究。

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Meta-analysis of the relationship between endothelial nitric oxide synthase G894T gene polymorphism and type 2 diabetic nephropathy

XU Shizhang, XIE Minjuan

1.Department of Nephrology, the People’s Hospital of Yichun City, Yichun 336000, Jiangxi, China; 2.Department of Pathology, Yichun University, Yichun 336000, Jiangxi, China

To assess the relation of endothelial nitric oxidesynthase (eNOS) G894T with diabetic nephropathy in type 2 diabetic nephropathy (T2DN).To search from the database of PubMed, Cochrane Library, EMBASE, Science Citation Index, Wiley Online Library, Google Scholar, China National Knowledge Infrastucture, China Biology Medicine, Wanfang Data, China science and technology journal, obtainliteratures according to the selection criteria, extract relevant data and perform statistical analysis by Review Manager5.1 and Stata12.0. Meta analysis of differences in frequency between related geno types and alleles.The study searched 23 literatures including 4655 T2DN and 4093 type 2 diabetes mellitus (T2DM). ①In group of T2DN, the frequency of TT genotype (=1.39, 95%: 1.10?1.76,<0.01) and GT genotype (=1.33, 95%: 1.13?1.57,<0.01) were higher than T2DM group, the frequency of GG genotype was lower than T2DM group (=0.66, 95%: 0.55?0.79,<0.01). However, there was an obviousheterogeneity in the publications. ② In group of T2DN, the frequency of T allele was higher than T2DM (=1.41, 95%: 1.21?1.65,<0.01). ③The subgroup analysis of Chiness show frequency of GT genotype (=2.37, 95%: 1.81?3.09,<0.01) and T allele (=2.07, 95%: 1.62?2.65,<0.01) were higher thanT2DM, the frequency of GG genotype was lower thanT2DM (=0.42, 95%: 0.32?0.55,<0.01). Importantly, there was no statistical heterogeneity in the results. ④Two literatures did not meet Hardy-Weinberg equilibrium. However, it did not bias the study by sensitive analysis.The polymorphism of eNOS G894T gene may be associated with the pathogenesis of T2DN.

Type 2 diabetes mellitus; Diabetic nephropathy; Nitric oxidesynthase; Gene polymorphism; Meta-analysis

R692

A

10.3969/j.issn.1673-9701.2023.30.005

江西省衛(wèi)生健康委科技計劃項目（20204732）

謝敏娟，電子信箱：380746203@qq.com

（2022–09–20）

（2023–10–10）