清營顆粒對大鼠的急性毒性研究*

劉月月，楊世發(fā)，李克鑫，殷斌，趙增成，林樹乾**

（1.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所，山東 濟(jì)南 250100；2.動物保健品山東省工程研究中心，山東 濟(jì)南 250100；3.山東鑫谷健康產(chǎn)業(yè)有限公司，山東 濱州 256600）

清營顆粒是由清營湯改造而來，清營湯為清熱劑，組方來自于我國中藥古籍《溫病條辨》，由犀牛角（水牛角代替）、生地黃、銀花、連翹、玄參、丹參、麥冬、黃連、竹葉心組成，能夠清熱解毒，透熱養(yǎng)陰，主治熱入營分證。據(jù)記載，清營湯在過去廣泛用于治療太陰溫病、手厥陰暑溫、暑癇、陽明溫病等。現(xiàn)代藥理學(xué)研究也發(fā)現(xiàn)，利用清營湯合生脈散加減可用來治療臨床膿毒癥[1]及別嘌醇過敏致急性腎損傷[2]，而且對治療熱毒血瘀型糖尿病腎病也起到一定的積極作用[3]。此外，清營湯加減與壽胎灌腸湯聯(lián)合使用可改善特發(fā)性畸形精子癥[4]；清營湯加減聯(lián)合刺絡(luò)拔罐可用于治療陰虛內(nèi)熱型面部激素依賴性皮炎[5]。在獸醫(yī)臨床方面，有研究報道清營口服液對雞大腸桿菌病[6]和流感病毒病[7]均具有較好的療效。但是，飲水用藥方式容易發(fā)生堵塞水道等問題。為了方便使用，我們將現(xiàn)有的口服液改變?yōu)轭w粒劑，并以SD 大鼠為研究對象，采用限量法進(jìn)行試驗，探究清營顆粒的急性毒性效應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑

清營顆粒：水牛角、生地黃、金銀花、黃連等藥物煎煮后加輔料制成顆粒劑，每1 g 成品含原生藥材1 g。藥材均購于山東百味堂中藥飲片有限公司。試驗時采用滅菌水配制成0.5 g/mL 的受試藥物，現(xiàn)用現(xiàn)配。

苦味酸，批號20191101，由廣東省臺山市化工廠生產(chǎn)；水合氯醛，批號20190823，由永華化學(xué)科技（江蘇）有限公司生產(chǎn)。

1.2 試驗動物

SPF 級6～7 周齡SD 大鼠20 只，雌、雄各10只，體重180～220 g，購自三峽大學(xué)實(shí)驗動物中心[生產(chǎn)許可證號：SCXK（鄂）2022-0012]。

1.3 主要儀器

雙扉脈動真空蒸汽滅菌器（YMQ 型），購自連云港佑源醫(yī)藥設(shè)備有限公司；電子天平（SQP型），購自賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司。

1.4 試驗方法

選取SD 大鼠20 只（雌、雄各10 只），禁食不禁水14 h 后，通過灌胃給予0.5 g/mL 受試藥物，每天灌服三次，每次間隔4 h，每次灌服劑量為10.0 g/kg 體重，即每天灌服劑量為30.0 g/kg 體重。染毒后3 h 內(nèi)恢復(fù)飼喂。

1.5 臨床觀察

觀察頻率：染毒前觀察1 次，染毒后每天觀察，連續(xù)14 d；觀察對象：染毒前全部大鼠，染毒后試驗中所有存活大鼠；內(nèi)容：觀察包括皮膚、被毛、眼、黏膜、分泌物、排泄物以及呼吸、循環(huán)、自主和中樞神經(jīng)系統(tǒng)等，特別要注意觀察有無震顫、驚厥、流涎、腹瀉、呆滯、嗜睡和昏迷等癥狀。記錄局部和全身反應(yīng)，記錄大鼠中毒體征的出現(xiàn)時間、程度和持續(xù)時間，評估可能的毒作用靶器官。

1.6 體重測定

在染毒當(dāng)天（視為0 d），染毒后1、2、7、14 d 上午測定所有存活大鼠的體重。

1.7 解剖觀察

對試驗過程中死亡的大鼠及試驗結(jié)束時存活的大鼠進(jìn)行解剖，肉眼觀察大鼠體表、所有體表孔竅、頭顱、胸部、腹部、骨盆等處及其內(nèi)容物有無異常，并進(jìn)行記錄。觀察重要器官（心、肝、脾、肺、腎、腎上腺、睪丸、子宮、卵巢、胃腸、腦等）的解剖病變。

1.8 數(shù)據(jù)分析

1.8.1 最大耐受量 灌服一定劑量的清營顆粒后，觀察期內(nèi)無大鼠死亡，則認(rèn)為該受試品對大鼠的經(jīng)口急性毒性耐受劑量大于受試劑量，即LD50大于該數(shù)值。

1.8.2 毒性分級 急性毒性分級見表1。根據(jù)表1級別標(biāo)準(zhǔn)確定清營顆粒的毒性級別。

表1 化學(xué)物急性毒性（LD50）劑量分級表[8--9]

2 結(jié)果

2.1 臨床觀察

大鼠臨床觀察結(jié)果見表2。在給予30 g/kg 體重的清營顆粒后，雌性大鼠精神狀態(tài)良好，飲食正常，大小便正常，直至試驗結(jié)束無異常癥狀出現(xiàn)；僅有一只雄性大鼠在給藥2 d 后出現(xiàn)糞便軟但成形情況，可能不是藥物引起，其他大鼠無異常癥狀。

2.2 體重測定

大鼠體重稱量結(jié)果見表3。所有動物在給藥后14 d 天存活，其中4 只雌性動物在給藥后1 d 或2 d體重降低，其他動物體重持續(xù)增長。雄性動物在給藥后1、2、7 d 和14 d，體重持續(xù)增長。

表3 大鼠體重測定結(jié)果 單位：g

2.3 解剖觀察

大鼠解剖觀察結(jié)果見表4。剖檢顯示，動物外觀（皮膚、皮下肌肉）未見明顯異常，呼吸系統(tǒng)（氣管、肺、咽喉、鼻）、消化系統(tǒng)（食管、胃腸、胰腺、肝等）、泌尿生殖系統(tǒng)（腎、膀胱、睪丸、附睪、子宮、卵巢等）、神經(jīng)系統(tǒng)（腦、腦垂體、眼、脊髓等）、腺體（腎上腺、胸腺）、心血管及造血系統(tǒng)（主動脈、心臟等）等未見肉眼可觀病變。

表4 大鼠解剖觀察結(jié)果

3 討論

清營顆粒是在新獸藥清營口服液基礎(chǔ)上優(yōu)化生產(chǎn)工藝改變劑型而得，跟口服液相比，顆粒劑具有口味改進(jìn)、方便使用、性質(zhì)穩(wěn)定、易儲存等優(yōu)勢。前期通過藥效試驗發(fā)現(xiàn)，清營口服液能對雞體內(nèi)注射的大腸桿菌起到較好的抑菌和殺菌效果；與其他藥物進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)清營口服液總體預(yù)防和治療效果好于氟苯尼考[6]。以小鼠（C57BL/6）和MDCK 細(xì)胞作為模型，通過使用臨床分離到的禽流感病毒攻毒來研究清營口服液抑制流感病毒復(fù)制的效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其對禽流感病毒有明顯抑制作用，且吸附前期抑制效果最好，免疫熒光試驗結(jié)果表明清營口服液能夠有效抑制病毒NP 蛋白核輸出[7]。本研究中受試品清營顆粒的前期藥理學(xué)研究結(jié)果顯示，其可有效緩解大腸桿菌內(nèi)毒素引起的高熱以及禽流感病毒感染引起的熱入營分等癥狀。然而，關(guān)于清營顆粒的毒性作用尚未研究，本試驗以此為目的，以期為藥物的開發(fā)提供依據(jù)。

在試驗動物選擇方面，按照《GB15193.3-2014食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)急性經(jīng)口毒性試驗》[9]中的要求，選擇嚙齒類動物大鼠。SD 大鼠是毒性試驗常用的嚙齒類動物，遺傳背景清楚，對藥物的反應(yīng)比較穩(wěn)定，個體差異較小，飼養(yǎng)管理方便，體形較小，便于試驗操作。為了觀察受試藥物對不同性別動物生長發(fā)育的影響，使用雌、雄兩種性別的健康成年大鼠各10 只，體重為180～220 g。

本次試驗采用限量法，該方法適用于有關(guān)資料顯示毒性極小的或未顯示毒性的受試品，給予動物一定劑量的受試品仍不出現(xiàn)死亡[9]。本次試驗的受試品——清營顆粒，主要成分為生地黃、水牛角、金銀花和玄參，這些中藥單用或組成方劑使用已經(jīng)十分成熟，有關(guān)藥效和藥理的研究也多有報道，目前在寵物臨床或家禽養(yǎng)殖上也有廣泛而有效的應(yīng)用[10-15]，因此，初步估計受試品清營顆粒毒性極小，本次試驗選用限量法是合適的。

研究結(jié)果顯示，在本試驗條件下，受試品清營顆粒對雌性和雄性SD 大鼠的急性經(jīng)口毒性耐受劑量大于30 g/kg 體重，其LD50大于30 g/kg 體重。根據(jù)化學(xué)物急性毒性（LD50）劑量分級標(biāo)準(zhǔn)，清營顆粒無毒。本研究結(jié)果為后續(xù)長期毒性試驗劑量的設(shè)計和臨床試驗起始劑量的選擇提供一定的參考。