UPLC-MS/MS法測(cè)定醬香型白酒原輔料中非揮發(fā)性酚酸

駱茂香，劉 磊，陳 雯，陳仁遠(yuǎn)*

（1.貴州省酒類(lèi)產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)檢測(cè)院，貴州仁懷 564500；2.茅臺(tái)學(xué)院，貴州仁懷 564500）

酚酸是酚類(lèi)化合物，是食品中主要抗氧化物質(zhì)的來(lái)源，其組成及含量對(duì)抗氧化活性起著決定性作用[1]。非揮發(fā)性酚酸包括原兒茶酸、對(duì)香豆酸、咖啡酸、阿魏酸等[2]。白酒釀造用原輔料如高粱、大曲中存在一些酚酸類(lèi)物質(zhì)，原輔料在各酶系、微生物的作用下也會(huì)生成一些酚酸，這些活性物質(zhì)經(jīng)過(guò)釀造、蒸餾等過(guò)程進(jìn)入酒體，賦予白酒特殊的苦味和堅(jiān)果香氣，不僅影響白酒的風(fēng)格和口感，增加白酒風(fēng)味層次感，同時(shí)還具有抗氧化的作用[3-5]。有研究報(bào)道，酚酸對(duì)冠心病、糖尿病、高血脂、痛風(fēng)等都有一定的預(yù)防作用[6-10]。阿魏酸是一種抗氧化劑，也是防癌物質(zhì)，具有抗炎鎮(zhèn)痛的功效[11]。因此，對(duì)白酒釀造原輔料中的酚酸進(jìn)行定量有助于監(jiān)控白酒的質(zhì)量，提升白酒的品質(zhì)。

目前，對(duì)酚酸進(jìn)行檢測(cè)的方法主要有薄層色譜法[12]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[13]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[14]等。酚酸類(lèi)物質(zhì)在醬香型白酒和其原輔料中含量較低，并且大多研究旨在檢測(cè)白酒中酚酸的含量，對(duì)白酒原輔料中酚酸含量的研究較少。因此，本研究采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)白酒原輔料中的非揮發(fā)性酚酸進(jìn)行測(cè)定。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

仁懷醬香型白酒核心產(chǎn)區(qū)所用大曲、高粱；原兒茶酸（99.0%）、對(duì)香豆酸（99.7%）、綠原酸（98.9%）、咖啡酸（99.7%）、阿魏酸（99.9%），阿爾塔公司；甲醇（色譜純，德國(guó)默克公司）；磷酸（色譜純，科密歐公司）；超純水（18.2 MΩ·cm）。

1.2 儀器與設(shè)備

漩渦振蕩器（XH-B，江蘇天翎公司）；臺(tái)式電子天平（精確度0.0001 g，賽多利斯公司）；0.44 μm濾頭；離心機(jī)（TD4Z-WS，湖南湘立公司）；液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（Thermo Ultimate 3000，美國(guó)賽默飛世爾科技公司）；超純水機(jī)（Milli-Q，Millipore公司）；電子天平（精度0.0001 g，賽多利斯公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品前處理

粉碎高粱、大曲后分別過(guò)40目、20目篩，參照趙尚碧等[15]的樣品預(yù)處理方法對(duì)樣品前處理?xiàng)l件進(jìn)行優(yōu)化。分別稱(chēng)取5 g（精確至0.001 g）高粱或大曲粉末樣品于50 mL離心管中，加入50%甲醇水溶液20 mL，振蕩5 min后，以3000 r·min-1離心30 min，吸取0.200 mL上清液于50 mL容量瓶中，加50%甲醇水溶液定容，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，待測(cè)。

1.3.2 儀器條件

（1）色譜條件。色譜柱：XDB-C18柱（50 mm×4.6 mm，1.8 μm）；流動(dòng)相A相為0.1%甲酸溶液，B相為甲醇，洗脫程序：0～15.00 min，5%→100% B，15.10～17.00 min，100% B，17.10～20.00 min，5% B；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；流速：0.25 mL·min-1。

（2）質(zhì)譜條件。電噴霧離子源（Electrospray Ionization，ESI），負(fù)離子模式；選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（Selected Reaction Monitoring，SRM）；毛細(xì)管溫度：300 ℃；霧化氣溫度：320 ℃；鞘氣壓力：25 Arb；噴霧電壓：3500 V。5種酚酸的質(zhì)譜分析參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 5種酚酸的質(zhì)譜分析參數(shù)

1.3.3 酚酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)溶液配制：分別取一定質(zhì)量的5種酚酸標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解并定容至100 mL，配制成一定濃度的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，在-20 ℃冷凍保存。用甲醇稀釋標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，配制5種酚酸混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，現(xiàn)配現(xiàn)用。標(biāo)準(zhǔn)溶液配制濃度見(jiàn)表2。

表2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

1.3.4 數(shù)學(xué)模型

樣品中酚酸含量的計(jì)算公式為

式中：C為待測(cè)組分的含量，g·kg；C測(cè)為由標(biāo)準(zhǔn)曲線得出的待測(cè)物的質(zhì)量濃度，μg·L-1；m為所稱(chēng)取的樣品質(zhì)量，g；V為定容體積，mL。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

對(duì)原兒茶酸、對(duì)香豆酸、阿魏酸、咖啡酸和綠原酸5種目標(biāo)化合物標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行測(cè)定，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如表3所示。原兒茶酸、對(duì)香豆酸、阿魏酸、咖啡酸和綠原酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)均大于0.995，相關(guān)系數(shù)滿足《檢測(cè)和校準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室能力的通用要求》（GB/T 27025—2019）、《檢測(cè)和校準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室能力認(rèn)可準(zhǔn)則在化學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用說(shuō)明》（CNAS—CL01-A002：2020）等規(guī)范性技術(shù)文件規(guī)定的對(duì)于確認(rèn)方法相關(guān)系數(shù)不應(yīng)低于0.99的要求。

表3 目標(biāo)化合物標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程

2.2 精密度實(shí)驗(yàn)

配制原兒茶酸、綠原酸、咖啡酸、對(duì)香豆酸和阿魏酸在高粱和大曲中3個(gè)濃度水平的樣品添加溶液，分別進(jìn)樣6次計(jì)算精密度。由表4可知，5種酚酸在高粱、大曲中的精密度試驗(yàn)中變異系數(shù)為0.6%～6.3%，滿足《檢測(cè)和校準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室能力的通用要求》（GB/T 27025—2019）、《檢測(cè)和校準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室能力認(rèn)可準(zhǔn)則在化學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用說(shuō)明》（CNAS—CL01-A002：2020）等規(guī)范性技術(shù)文件規(guī)定的精密度試驗(yàn)中變異系數(shù)小于7.5%的要求。

表4 目標(biāo)化合物檢測(cè)方法的精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3 回收率及準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn)

在空白樣品中分別添加原兒茶酸、綠原酸、咖啡酸、對(duì)香豆酸、阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，在S1、S2、S53個(gè)濃度水平進(jìn)行回收率和準(zhǔn)確度試驗(yàn)，每個(gè)濃度水平添加3個(gè)平行樣。由表5可知，在3個(gè)加標(biāo)水平下，化合物的回收率在94.2%～108.1%，滿足《檢測(cè)和校準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室能力的通用要求》（GB/T 27025—2019）、《檢測(cè)和校準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室能力認(rèn)可準(zhǔn)則在化學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用說(shuō)明》（CNAS—CL01-A002：2020）等規(guī)范性技術(shù)文件規(guī)定的回收率為90%～120%的要求。各樣品化合物在S1、S2、S53個(gè)空白加標(biāo)濃度水平的準(zhǔn)確度偏差在-5.8%～8.1%，滿足《檢測(cè)和校準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室能力的通用要求》（GB/T 27025—2019）、《檢測(cè)和校準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室能力認(rèn)可準(zhǔn)則在化學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用說(shuō)明》（CNAS-CL01-A002：2020）等規(guī)范性技術(shù)文件規(guī)定的準(zhǔn)確度偏差在-20%～20%的要求。

表5 目標(biāo)化合物回收率及準(zhǔn)確度

2.4 實(shí)驗(yàn)樣本測(cè)定

建立4種酚酸定性、定量方法后利用液相-串聯(lián)質(zhì)譜儀對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)。樣品中原兒茶酸、綠原酸、咖啡酸、對(duì)香豆酸、阿魏酸的含量范圍如表6所示。

表6 樣品中5種酚酸的含量 單位：g·kg-1

3 結(jié)論

采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)醬香型白酒原輔料（高粱和大曲）中的5種酚酸（原兒茶酸、對(duì)香豆酸、綠原酸、咖啡酸和阿魏酸）含量，方法操作簡(jiǎn)單、可靠，R2值、RSD、加標(biāo)回收率、準(zhǔn)確度等各項(xiàng)指標(biāo)均達(dá)到分析要求，可用于醬香型白酒原輔料中酚酸含量的測(cè)定，有助于監(jiān)控白酒的質(zhì)量，提升白酒的品質(zhì)。