高效液相色譜法同時測定醬油中7種防腐劑

黃 程，王婷婷

（武漢商學院 食品科技學院，湖北武漢 430056）

防腐劑能抑制微生物活動，防止食品腐敗變質，是一類十分重要的食品添加劑[1]。苯甲酸因其價格低廉，在我國食品生產中使用較為普遍[2]。山梨酸由于防腐效果穩定，且與一般食品中的成分不發生作用，不會對食品風味產生不良影響，所以在食品工業中應用較為廣泛[3]。納他霉素能抑制酵母和霉菌生長，對于容易被霉菌污染的食品具有良好的防霉效果[4]。對羥基苯甲酸酯類防腐劑主要用于食品、動物飼料以及化妝品中殺菌防腐，具有優良的生物降解性能[5]。

防腐劑可以延長食品的保質期，但長時間過量使用可能會對人體健康產生不良影響。研究發現，苯甲酸鈉多次給藥對大鼠肝腎有一定的損害[6-8]；人體過量攝入苯甲酸、山梨酸等食品添加劑，可能對人體外周血淋巴細胞產生細胞毒性和遺傳毒性[9]；對羥基苯甲酸酯類具有雌激素活性，可能會對消費者的健康產生一定的影響[10-11]，我國已禁止在食品中使用羥基苯甲酸丙酯和對羥基苯甲酸丁酯。因此，加強食品防腐劑的監測對保證食品安全具有重要意義。

目前，檢測食品中防腐劑的方法有液相色譜法[12-13]、液相色譜-質譜聯用法[14-16]、氣相色譜法[17-18]和氣相色譜-質譜聯用法[19-21]等。相較于氣相色譜或氣質聯用方法，液相色譜方法的適用性更為廣泛，前處理更為簡單，大多不需要經過復雜的萃取、衍生化等步驟，是目前較為常用的檢測方法。根據我國現行有效的檢測方法，苯甲酸、山梨酸、納他霉素主要采用液相色譜法[22-23]，對羥基苯甲酸酯類則采用氣相色譜法檢測[24]。對同一樣品，同時測定這7種防腐劑，需要分開進行，檢測效率低，且食品生產過程中涉及的原料、基質復雜多變，添加的防腐劑種類也較多，因此建立一種同時測定多種防腐劑的方法對其質量控制和保障食品安全具有十分重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

苯甲酸（99.66%，德國Dr.Ehrenstorfer公司）、山梨酸（99.18%，德國Dr.Ehrenstorfer公司）、納他霉素（1000 mg·L-1，上海安譜璀世標準技術服務有限公司）、4種對羥基苯甲酸酯類（1000 mg·L-1，上海安譜璀世標準技術服務有限公司）。甲醇（色譜級，德國默克股份兩合公司）、乙腈（色譜級，德國默克股份兩合公司）、乙酸銨（優級純，天津市大茂化學試劑廠）、氯化鈉（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）、亞鐵氰化鉀（分析純，天津市百世化工有限公司）、乙酸鋅（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）、乙酸（分析純，上海沃凱生物技術有限公司）、蒸餾水（廣州屈臣氏食品飲料有限公司）。醬油購于本地超市。

1.2 儀器與設備

2695高效液相色譜儀：美國Waters公司；TGL-205離心機：湖南平凡科技有限公司；QL-861渦旋振蕩器：海門市其林貝爾儀器制造有限公司；KQ-250B型超聲波清洗機：昆山市超聲儀器有限公司；FA204電子分析天平：上海越平科學儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 標準溶液制備

分別稱取適量的苯甲酸、山梨酸用甲醇溶解，配制成濃度為2.0 mg·mL-1的苯甲酸、山梨酸標準儲備液。取配制好的苯甲酸、山梨酸標準儲備液與納他霉素、4種對羥基苯甲酸酯類標準溶液適量，用甲醇逐級稀釋成濃度為0.2 μg·mL-1、0.5 μg·mL-1、1.0 μg·mL-1、2.0 μg·mL-1、5.0 μg·mL-1、10.0 μg·mL-1、20.0 μg·mL-1、50.0 μg·mL-1和100.0 μg·mL-1系列混合標準溶液。

1.3.2 樣品前處理

準確稱取2 g醬油樣品于50 mL離心管中，加入20 mL甲醇，渦旋混合均勻，超聲提取15 min后，10000 r·min-1離心5 min，上清液經0.45 μm微孔濾膜過濾，待用。

1.3.3 色譜條件

色譜柱：Acclaim 120 C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）+0.02 mol·L-1乙酸銨溶液（B）；梯度洗脫：0～10 min，12%A；11～20 min，20%A；21～35 min，35%A；36～45 min，40%A；46～55 min，45%A；56～65 min，12%A；流速：1 mL·min-1；柱溫：35.0 ℃；進樣量：10 μL；檢測器：二極管陣列檢測器；檢測波長：230 nm。

2 結果與分析

2.1 色譜條件的優化

本文分別比較了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.02 mol·L-1乙酸銨和乙腈-0.02 mol·L-1乙酸銨4種不同流動相體系對7種目標化合物的分離度及峰型的影響，并調整有機相與水相的比例以達到最佳分離效果。結果顯示，以甲醇-水、乙腈-水進行洗脫時，羥基苯甲酸酯類無法完全分離，分離度較差。以甲醇-0.02 mol·L-1乙酸銨為流動相洗脫時，由于流動相中含有鹽類物質，甲醇比例升高到一定程度后會導致色譜柱壓力過高，無法進行后續的實驗。綜合考慮，本實驗最終選擇了乙腈-0.02 mol·L-1乙酸銨溶液作為流動相進行梯度洗脫。在該條件下，7種防腐劑可完全分離，色譜圖見圖1。

圖1 7種防腐劑混合標準溶液色譜圖（100 μg·mL-1）

2.2 提取溶劑的選擇

為了減少樣品中蛋白質等雜質的影響，根據文獻報道[12,14,25-26]及國標方法[23]，本實驗分別考察甲醇、乙腈、飽和氯化鈉-乙腈3種不同提取溶劑對7種防腐劑的提取效果。準確稱取9份空白醬油樣品，每份2 g，置于50 mL的離心管中，分成3組，每組3個平行。向空白樣品中添加100 μg 7種防腐劑混合標準溶液，按照1.3.2方法進行處理。其中，飽和氯化鈉-乙腈作為提取溶劑時，先加入5 mL飽和氯化鈉溶液，渦旋混勻后，再加入20 mL乙腈超聲提取。結果顯示，甲醇和乙腈作為提取溶劑時，均有不溶性沉淀產生；飽和氯化鈉-乙腈作為提取溶劑時，樣品中大部分物質溶解在飽和氯化鈉溶液中，乙腈層較為清澈；3種提取方式均可在一定程度上達到去除雜質的效果。比較3種提取溶劑的回收率可知（表1），3種提取溶劑對4種對羥基苯甲酸酯類的提取效果均較好，回收率可達101.8%～114.7%。但乙腈、飽和氯化鈉-乙腈作為提取溶劑時，苯甲酸、山梨酸平均回收率較低，提取效果較差，這可能與苯甲酸、山梨酸微溶于水，導致部分滯留在水相中有關；且兩種提取方式中，雜質峰對苯甲酸均存在干擾，無法完全分離。飽和氯化鈉-乙腈作為提取溶劑時，苯甲酸幾乎被雜質峰完全掩蓋，無法獲取峰面積信號。而甲醇作為提提溶劑時，色譜圖中雜質峰相對較少，7種目標物質均不受雜質峰的干擾，且都有較高的回收率，平均回收率在104.9%～114.5%。故選定甲醇作為提取溶劑。

表1 3種提取溶劑的回收率和相對標準偏差（n=3）

2.3 線性范圍及檢出限

取1.3.1配制好的防腐劑的系列混合標準溶液，按1.3.3色譜條件進行分析。以峰面積為縱坐標，質量濃度（μg·mL-1）為橫坐標，繪制7種防腐劑的標準曲線。根據信噪比（S/N）=3計算檢出限，信噪比（S/N）=10計算定量限[27]。結果表明，7種防腐劑在0.2～100.0 μg·mL-1線性關系良好，相關系數（R2）均大于0.998。檢出限為0.063～2.000 mg·kg-1，定量限為0.209～6.667 mg·kg-1，詳見表2。

表2 7種防腐劑的線性方程、相關系數、檢出限及定量限

2.4 加標回收率及精密度

準確稱取18份空白醬油樣品，每份約2 g，分別添加（20 μg）、中（40 μg）、高（100 μg）3個水平的7種防腐劑混合標準溶液，按照1.3.2的處理方法進行加標回收試驗，每個水平進行6次平行實驗，各組分的回收率和相對標準偏差結果見表3。由表3可知，7種目標化合物的平均回收率為96.05%～114.17%，RSD為0.02%～4.02%，方法的回收率和精密度良好，可作為醬油中7種防腐劑的檢測方法。

表3 7種防腐劑加標回收率和相對標準偏差（n=6）

2.5 實際樣品測定

采用本實驗方法分別對5批醬油樣品進行處理，測定7種防腐劑的含量，結果如表4所示。5批次樣品中苯甲酸含量為0.471～0.856 g·kg-1，山梨酸含量為0.199～0.645 g·kg-1，均符合《食品安全國家標準 食品添加劑使用標準》（GB 2760—2014）規定。

表4 樣品的測定結果（n=3） 單位：g·kg-1

3 結論

本文建立了一種高效液相色譜同時測定醬油中7種防腐劑的分析方法。該方法操作方便、簡單易行、準確度和精密度較高，能夠滿足醬油中多種防腐劑的檢測需要，可為防腐劑的檢測和使用監管提供參考。