GC-MS/MS法測(cè)定發(fā)酵食品中氨基甲酸乙酯的含量

陳大鵬

（黑龍江農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，黑龍江佳木斯 154000）

氨基甲酸乙酯（Ethyl Carbamate，EC）是發(fā)酵食品在發(fā)酵與儲(chǔ)存過程中形成的污染物，屬于2A類致癌物，廣泛存在于黃酒、醬油等食品中[1]。《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中氨基甲酸乙酯的測(cè)定》（GB 5009223—2014）針對(duì)食品中EC的測(cè)定制定了詳細(xì)的標(biāo)準(zhǔn)，表明了國(guó)家對(duì)其測(cè)定工作的重視程度[2]。目前，EC測(cè)定方法主要有氣相色譜法（Gas Chromatography，GC）、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（Gas Chromatography-Mass Spectrometer，GC-MS）、分子印跡法和免疫分析法等，而上述方法存在定量不準(zhǔn)確等問題[3]。考慮到EC廣泛存在于各類發(fā)酵食品中，本文提出采用氣相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜法進(jìn)行發(fā)酵食品中EC的測(cè)定，了解發(fā)酵食品中EC的污染情況，從而識(shí)別其食品安全風(fēng)險(xiǎn)，指導(dǎo)消費(fèi)者合理飲食[4]。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

白酒、料酒、醬油、醋、腐乳、發(fā)酵乳、豆豉以及面包，市售。

Agilent 7890A/7000bGC-MS/MS三重四極桿氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀，美國(guó)安捷倫科技有限公司；Sartorms CPA225D電子天平，德國(guó)賽多利斯公司；TDZ5-WS臺(tái)式低速自動(dòng)平衡離心機(jī)，長(zhǎng)沙湘智離心機(jī)儀器有限公司；HP-5016SY氮吹儀，上海濟(jì)成分析儀器有限公司；默克Milli-Q超純水機(jī)，美國(guó)Millipore公司；MS3基本型渦旋混合器，德國(guó)IKA公司；ST-700A攪碎機(jī)，常州國(guó)華電器有限公司。

EC標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞99%），德國(guó)Dr．Ehrenstorfer公司；乙酸乙酯，美國(guó)TEDIA公司；氯化鈉、無水硫酸鈉（分析純），國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；色譜級(jí)甲醇、乙腈，美國(guó)Burdick-Jackson公司；硅藻土萃取柱，天津博納艾杰爾科技有限公司；D5-氨基甲酸乙酯，CDNISOTOPES。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

稱取10 mg EC標(biāo)準(zhǔn)品于10.0 mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，得到1 mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，采用同樣的方式制備質(zhì)量濃度為1000 μg·L-1的D5-氨基甲酸乙酯內(nèi)標(biāo)使用液。將不含有EC成分的同基質(zhì)物質(zhì)作為空白樣品，適量吸取質(zhì)量濃度為1000 μg·L-1的混合對(duì)照品中間液，采用氮吹儀吹至近干，制備成1 mg·mL-1基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)使用液。分別吸取0.01 mL、0.10 mL、0.20 mL、0.40 mL、0.80 mL、1.60 mL和3.20 mL中間液，采用乙酸乙酯定容，制備成質(zhì)量濃度為1 μg·L-1、l0 μg·L-1、20 μg·L-1、40 μg·L-1、80 μg·L-1、160 μg·L-1和320 μg·L-1的EC標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。

1.3 樣品前處理

液體基質(zhì)：樣品搖勻后稱取1 g放入10 mL試管中，加入25 μL 10 μg·mL-1內(nèi)標(biāo)中間液，除了醬油以外，其他樣品均加入0.3 g氯化鈉，渦旋振蕩5 s，溶解混勻后放入SPE小柱，靜置10 min后，采用正己烷進(jìn)行淋洗，之后采用乙醚-乙酸乙酯進(jìn)行洗脫處理，收集到的洗脫液于40 ℃以下采用氮吹儀吹至近干，并用甲醇定容，制備成供試液。

固體及半固體基質(zhì)：樣品絞碎后稱取1 g放入10 mL試管中，加入25 μL 10 μg·mL-1內(nèi)標(biāo)中間液，渦旋振蕩5 s后，加入0.5 g氯化鈉、1.5 mL乙腈和0.5 mL超純水，渦旋振蕩120 s后，3000 r·min-1離心15 min，取1 mL上清液過0.22 μm濾膜，待分析。

1.4 儀器條件

（1）色譜條件。毛細(xì)管色譜柱，DB-INNOWAX（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；進(jìn)出口溫度：190 ℃；載氣：高純氮?dú)猓贿M(jìn)樣方式：脈沖不分流，0.9 mL·min-1的恒流模式；進(jìn)樣量：1 μL；柱溫：50 ℃保持1 min，以10 ℃·min-1升溫至150 ℃保持2 min，再以30 ℃·min-1升溫至250 ℃保持5 min。

（2）質(zhì)譜條件。電離方式：電子轟擊電離；電子能量：70 eV；離子源溫度：230 ℃；四極桿溫度：150 ℃；傳輸線溫度：250 ℃；監(jiān)測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)方式；溶液延遲：5 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 碰撞能優(yōu)化

采用單四極桿質(zhì)譜獲取到EC的特征粒子包括m/z44、m/z62、m/z74、m/z89，實(shí)際樣品處理后進(jìn)樣，最終選取豐度大且干擾小的m/z62作為母離子，開展碰撞能優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。取一定量的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別在10～40 eV（每10 eV設(shè)定一個(gè)等級(jí)）的不同碰撞能下進(jìn)樣，結(jié)果如表1所示。在20 eV碰撞能下可以獲取最大豐度，子離子分別為m/z44、m/z44.9，豐度比為100∶33.5。

表1 碰撞能實(shí)驗(yàn)

2.2 方法學(xué)評(píng)價(jià)

2.2.1 線性關(guān)系、檢出限與定量限

分別以對(duì)照品濃度與對(duì)應(yīng)峰面積為橫縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，獲得的標(biāo)曲回歸方程為y=0.0078x-0.0239，相關(guān)系數(shù)R2=0.9999，接近于1，線性關(guān)系良好。

分別以3倍信噪比和10信噪比為基準(zhǔn)，進(jìn)行化合物檢出限與定量限測(cè)定，得到EC檢出限為3 ng·mL-1，定量限為10 ng·mL-1。

2.2.2 穩(wěn)定性

將制備好的供試品溶液在室溫內(nèi)進(jìn)行首次測(cè)定，之后分別在2 h、4 h、12 h、24 h、48 h進(jìn)樣測(cè)定，并記錄相應(yīng)的EC峰面積，通過EC峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（Relative Standard Deviation，RSD）大小反映測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性。測(cè)定結(jié)果顯示，不同時(shí)間段下EC峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.57%，小于國(guó)際聯(lián)合委員會(huì)（International Union of Pure and Applied Chemistry，IUPAC）提出的峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)＜2.0%的要求，說明供試品在48 h內(nèi)始終保持穩(wěn)定狀態(tài)。

2.2.3 加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果

精密稱取已測(cè)定含量的樣品，加入內(nèi)標(biāo)中間液（液體基質(zhì)100 μL，固體基質(zhì)500 μL），制備加標(biāo)回收率測(cè)定樣品溶液，針對(duì)液體基質(zhì)（料酒）和固體基質(zhì)（面包）進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表2。可以看出，液體基質(zhì)與固體基質(zhì)的平均回收率分別為100.17%、100.23%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于5%，說明方法準(zhǔn)確可靠。

表2 EC在液體基質(zhì)和固體基質(zhì)中的加標(biāo)回收率

2.3 實(shí)際樣品的測(cè)定

采用本文建立的方法對(duì)市售白酒、料酒、醬油、醋、腐乳、發(fā)酵乳、豆豉和面包8種發(fā)酵食品中的EC含量進(jìn)行測(cè)定，每種發(fā)酵食品各10份，測(cè)定結(jié)果取平均值。如表3所示，市售發(fā)酵食品中EC的平均含量為3.44～84.63 ng·g-1。在各類市售發(fā)酵食品中，腐乳中的EC平均含量最高，為84.63 ng·g-1，且檢測(cè)出的最高EC含量達(dá)到了246.82 ng·g-1，檢出率達(dá)到了100.00%。在日常飲食中，可將腐乳作為風(fēng)味調(diào)味品使用，但不宜過多食用，以避免其對(duì)人體造成傷害。酒類發(fā)酵食品中EC平均含量也較高，白酒與料酒中的EC平均含量分別為48.24 ng·g-1與20.87 ng·g-1，檢出率均達(dá)到了100.00%。且白酒中的EC含量相對(duì)更高，考慮到白酒的度數(shù)較高，日常飲食中一般不會(huì)出現(xiàn)過度飲用的現(xiàn)象，且EC處于酒類國(guó)際安全限量標(biāo)準(zhǔn)以內(nèi)，對(duì)人體幾乎不會(huì)造成傷害[5]。而料酒的主要功能是調(diào)味，其含量與醬油、醋等日常家用調(diào)味品相近，過多食用的概率較小，整體較為安全。豆豉、發(fā)酵乳、面包等發(fā)酵食品中的EC平均含量均處于較低水平，檢出率相對(duì)較低。綜上，本文選取的市售發(fā)酵食品中的EC含量整體處于合理范圍，食用量大的發(fā)酵食品EC含量較低，而EC含量較高的發(fā)酵食品多為調(diào)味品或食用量較小的白酒飲品，整體安全性可以得到保障。

表3 市售發(fā)酵食品中EC含量的測(cè)定結(jié)果

3 結(jié)論

EC污染是近些年食品領(lǐng)域面臨的主要安全問題。本研究提出了將GC-MS/MS法應(yīng)用到發(fā)酵食品中EC含量的測(cè)定工作中，通過方法學(xué)評(píng)價(jià)驗(yàn)證了該方法在測(cè)定發(fā)酵食品中EC含量的有效性。同時(shí)，采用GC-MS/MS法對(duì)8類市售發(fā)酵食品中的EC含量進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定結(jié)果顯示，各類發(fā)酵食品均有一定量的EC，以腐乳EC含量最高，豆豉、發(fā)酵乳、面包的EC含量低，整體表現(xiàn)出食用量與EC含量呈現(xiàn)反比的關(guān)系，即食用量大的豆豉、發(fā)酵乳、面包EC含量相對(duì)較低，而食用量較小，往往作為調(diào)味品的腐乳、白酒與日用調(diào)味品的EC含量相對(duì)較高，說明國(guó)內(nèi)市售發(fā)酵食品的EC含量處于合理范圍，整體安全性較高。