高效液相色譜法測定水產品中孔雀石綠及其代謝物的含量

黃昌興

（汕頭市檢驗檢測中心，廣東汕頭 515041）

孔雀石綠（Malachite Green，MG），別名孔雀綠、孔雀綠草酸鹽、堿性綠、草酸孔雀石綠等，是人工合成的一種三苯甲烷類化學物，可殺真菌、細菌、寄生蟲，因其對養殖水域中的水霉病、鰓霉病、小瓜蟲病和寄生蟲病等具有良好的療效，被作為殺菌劑在水產養殖業廣泛使用[1-2]。孔雀石綠在魚體內代謝為隱色孔雀石綠（Leucomalachite Green，LMG），其毒性強于母體孔雀石綠，有強烈的致畸胎、致突變、致癌作用。2002年原農業部頒布的《食品動物禁用的獸藥及其化合物清單》已明文規定孔雀石綠禁止用于所有食品動物。

水產品是汕頭當地居民經常食用的食品，水產品養殖更是當地的傳統海洋產業之一。因此強化水產品質量安全對于保障消費者生命健康、促進水產品養殖業繁榮發展均具有重要意義。目前，MG及其代謝物LMG的檢測方法主要包括分光光度法、酶聯免疫法（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA）、高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）、液質聯用法（Liquid Chromatography-Mass Spectrometer，LC-MS）等[3-5]，其中HPLC因檢測成本低、儀器普及率高而被基層檢測機構廣泛采用。本文建立了高效液相色譜-熒光法檢測水產品中MG及其代謝物LMG的方法，以期簡化樣品前處理過程，提高基層檢測機構的檢測效率和準確度。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

1200型液相色譜-熒光檢測器：美國Agilent安捷倫公司；HX-4型均質器：山東歐萊博醫療器械有限公司；TG16G型離心機：常州市億能實驗儀器廠；VOKTEX型渦旋混勻器：海門市貝爾儀器制造有限公司；SN-RE-201D型旋轉蒸發儀：上海尚儀儀器設備有限公司；固相萃取裝置：德國CNW公司；PRS固相萃取柱：500 mg/3 mL；中性氧化鋁固相萃取柱：1 g/3 mL。

孔雀石綠和隱色孔雀石綠，純度≥98%，購自德國Dr.Ehrenstorfer公司；甲醇、乙腈：均為色譜純；鹽酸羥胺、乙酸、對甲苯磺酸、二甘醇和硼氫化鉀，均為分析純；實驗用水為去離子水。

1.2 標準溶液的配制

準確稱取適量的MG或LMG標準品，用適量甲醇溶解并定容，配制成濃度為100 mg·L-1的標準溶液，4 ℃避光保存。

1.3 樣品前處理

1.3.1 提取

水產品去鱗、去骨、去皮，沿著背脊取可食用部分，粉碎；準確稱取樣品5.0 g（精度0.1 mg）于50 mL離心管內，依次加入0.1 mol·L-1乙酸銨緩沖液5.0 mL、20%鹽酸羥胺1.5 mL、1.0 mol·L-1對甲苯磺酸2.5 mL，用勻質機以10000 r·min-1的速度均質30 s，加入10 mL乙腈渦旋振蕩60 s；加入酸性氧化鋁10 g，渦旋振蕩30 s，6000 r·min-1離心5 min；上清液中加入二甘醇10 mL、乙腈10 mL，渦旋振蕩30 s，6000 r·min-1離心5 min；上清液加入1 mL硼氫化鉀、15 mL二氯甲烷，渦旋振蕩30 s，6000 r·min-1離心5 min，收集下層二氯甲烷溶液；殘渣中加入10 mL二氯甲烷重復提取一次，合并二氯甲烷溶液；45 ℃水浴下氮吹濃縮至近干，用5 mL乙腈充分溶解殘渣，待凈化。

1.3.2 凈化

將中性氧化鋁固相萃取柱與PRS固相萃取柱連接，PRS固相萃取柱安裝在固相萃取裝置上，用5 mL乙腈活化萃取柱后，將待凈化樣品溶液轉移至中性氧化鋁SPE小柱中凈化，棄去流出液；依次加入2 mL初始流動相、1 mL鹽酸羥胺甲醇溶液洗脫PRS柱，洗脫液經0.45 μm微孔濾膜過濾，濾液供HPLC測定。

1.4 液相色譜條件

色譜柱：Silversil C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-5 mmol·L-1乙酸銨溶液（82∶18）；進樣量：10 μL；流速：1.0 mL·min-1；激發波長：265 nm；發射波長：360 nm。

2 結果與分析

2.1 實驗條件優化

2.1.1 提取與凈化

結合MG和LMG的理化性質，比較了乙酸鈉緩沖溶液、乙腈、甲醇、二氯甲烷等有機溶劑對水產品中MG和LMG的萃取效率；比較了酸性氧化鋁、中性氧化鋁、堿性氧化鋁對水產品中MG和LMG的凈化效果。結果表明，乙腈對MG和LMG具有良好的萃取效率，加標回收率在93.4%～97.8%；堿性和酸性氧化鋁會吸附目標化合物而降低萃取率，而中性氧化鋁固相萃取柱凈化，可有效去除提取液中酸性雜質，消除水產品中油脂和基體的干擾，凈化效果好，基質干擾小，可有效保護色譜柱和檢測器。

2.1.2 流動相的選擇

比較了甲醇-乙酸銨溶液、乙腈-乙酸銨溶液、四丁基溴化鈉-乙腈或甲醇等不同流動相種類或比例對MG及其代謝物LMG的色譜分離效果。結果顯示，以乙腈-乙酸銨水溶液作為流動相時，MG和LMG可獲得更好的分離效果，且響應信號強，這可能是由于MG及LMG易于在乙腈中溶解，且乙酸銨作為緩沖溶液可提供合適的pH，從而促進其生成正離子；當乙酸銨濃度為5 mmol·L-1時，MG及其代謝物LMG可有效分離，峰形尖銳且對稱，出峰時間適中且相對穩定，基線穩定且基質干擾少，色譜圖見圖1。

圖1 MG及其代謝物LMG色譜圖

2.2 線性關系及檢出限

配制MG和LMG質量濃度為0 μg·mL-1、1.0 μg·mL-1、2.0 μg·mL-1、5.0 μg·mL-1、10.0 μg·mL-1和20.0 μg·mL-1的混合標準溶液，按本文建立的HPLC法進行測定，以MG和LMG響應值為縱坐標，以MG和LMG質量濃度為橫坐標，繪制標準曲線。結果顯示，在1.0～20.0 μg·mL-1濃度范圍內，GM的線性關系方程為y=0.3157x+0.03225，相關系數r為0.9998；LGM的線性關系方程為y=0.4213x+0.02486，相關系數r為0.9999，這表明MG和LMG均具有很好的線性關系。

在空白水產品樣品中添加濃度為0.1 μg·kg-1、0.5 μg·kg-1、1.0 μg·kg-1、1.5 μg·kg-1、5.0 μg·kg-1和10.0 μg·kg-1的系列標準溶液進行測定，以3倍信噪比（S/N）作為方法檢出限，10倍信噪比為方法定量限。結果顯示，該方法MG和LMG的檢出限為0.5 μg·kg-1，定量限為1.5 μg·kg-1。

2.3 方法回收率和精密度

分別對秋刀魚、對蝦和螃蟹空白樣品進行MG和LMG低、中、高3個水平的加標回收實驗，按本文建立的檢測方法進行測定，回收率和精密度（RSD）見表1。結果顯示，MG和LMG在3個加標水平下的平均回收率為88.1%～96.6%，RSD為0.9%～3.8%，表明本方法具有較好的準確度和精密度。

表1 回收率和精密度（n=6）

2.4 實際樣品檢測

采用本方法對市售的對蝦、螃蟹、鯽魚等10份水產品逐個進行MG和LMG含量檢測，均未檢出MG和LMG殘留，說明所檢10份水產品在養殖過程中均未使用孔雀石綠藥物。

3 結論

本文建立了水產品中MG和LMG的高效液相色譜-熒光法測定方法。水產品經乙腈超聲提取及中性氧化鋁柱凈化后，用液相色譜-熒光檢測器檢測。結果表明，MG和LMG在1.0～20.0 μg·mL-1濃度范圍內，均具有很好的線性關系，相關系數≥0.9998；檢出限為0.5 μg·kg-1，定量限為1.5 μg·kg-1；加標回收率為88.1%～96.6%，RSD為0.9%～3.8%。該方法具有較好的準確度和精密度，可滿足水產品中MG和LMG含量測定。