牛肉樣品中產志賀毒素大腸埃希氏菌和腸致病性大腸埃希氏菌的分離鑒定

朱應飛，聶 翔，熊麗霞，吳學平，占忠旭，匡佩琳

（江西省檢驗檢測認證總院食品檢驗檢測研究院，江西南昌 330000）

產志賀菌毒素的大腸桿菌（Shiga Toxin ProducingEscherichia coli，STEC）和腸致病性埃希氏菌（EnterogenicEscherichi coli，EPEC）是世界上最重要的食源性病原體之一。牛羊等動物作為STEC 和EPEC 的宿主，可通過糞便污染肉食對人們的健康造成危害[1]。STEC 可引起溶血性尿毒癥綜合征，甚至可能導致死亡[2]。EPEC 可引起急性或持續性腹瀉，多發于兩歲以下的兒童。通常，EPEC 會引起急性水樣腹瀉，并伴有發燒、嘔吐和脫水，該病發病迅速，在攝入細菌后幾小時后出現癥狀[3]。本研究旨在用傳統平板分離法結合分子生物學方法對江西省南昌市市售牛肉樣品中的STEC 和EPEC 進行分離鑒定。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

恒溫培養箱，上海智誠；實時熒光PCR 儀，伯樂；改良胰蛋白胨大豆肉湯培養基，新生霉素、營養瓊脂，北京陸橋；CHROMagar STEC 顯色培養基，科瑪嘉；改良Rainbow O157 顯色培養基，Biolog；引物和探針，生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 試驗方法

從2018 年9 月—2019 年3 月，每月采集牛肉及制品數量為20 份，共采集7 個月合計抽取140 個牛肉及制品樣本。于實驗當日清晨在實驗室周邊超市或農貿市場購買牛肉樣品，并將其置于無菌采樣袋中，詳細記錄樣品信息。采樣后應置于2 ～5 ℃保存，在4 h 內檢驗。

1.3 樣品制備和預培養

無菌操作條件下， 取樣品（325±32.5）g 于BagFilter P2000 均質袋中，并向均質袋中加入（975±19.5）mL 的改良胰蛋白胨大豆肉湯培養基，用拍擊式均質器拍打1～2 min，制成1∶4的樣品勻液，于（36±1）℃預培養4 h。

1.4 增菌

在生物安全柜中，向上述經過預培養的樣品勻液中加入新生霉素溶液，使其終濃度為10 mg·L-1，之后于（42±1）℃培養15 ～24 h。同時以含有stx1、stx2和eae基因的大腸埃希氏菌為陽性對照，以不含stx1、stx2和eae基因的大腸埃希氏菌為陰性對照，并做培養基空白對照。陽性對照菌株可使用大腸埃希氏菌CICC10670，陰性對照菌株可使用大腸埃希氏菌ATCC25922。

1.5 實時熒光PCR 初步篩選

以16S rRNA 基因作為PCR 體系內參照，檢測大腸埃希氏菌的志賀毒素編碼基因stx（stx1、stx2）和緊密素編碼基因eae。志賀毒素編碼基因stx（stx1、stx2）、緊密素編碼基因eae及內參照16S rRNA 的擴增引物和探針見引物和探針的核酸序列等同采用USDA-FSIS MLG 5C.03 中的規定[4]。

1.6 STEC 菌株的分離和確認

1.6.1 分離

用10 μL 接種環取上述增菌液劃線于CHROMagar STEC顯色培養基（或改良Rainbow O157顯色培養基），（36±1）℃培養18 ～24 h。記錄分離培養基上菌落生長情況及菌落形態，CHROMagar STEC 顯色培養基上STEC 為淡紫色，其他腸桿菌為藍色、無色或被抑制，改良Rainbow O157 顯色培養基STEC 有不同顏色的菌落，藍色、紫色、粉色或灰色。

1.6.2 生化確認

將典型或可疑菌落接種于三糖鐵瓊脂斜面，先在斜面劃線，再于底層穿刺；接種針不要滅菌，直接接種營養瓊脂平板，于（36±1）℃培養18 ～24 h。大腸埃希氏菌在三糖鐵瓊脂斜面和底層均呈黃色，產氣或不產氣，H2S 實驗陰性。

1.6.3 毒力基因確認

以16S rRNA 基因作為PCR 體系內參照，檢測大腸埃希氏菌的志賀毒素編碼基因stx和緊密素編碼基因eae。實時熒光PCR 反應體系，每個樣品做兩個平行。分別以含有stx1、stx2和eae基因的大腸埃希氏菌的核酸提取物為陽性對照，以不含stx1、stx2和eae基因的大腸埃希氏菌核酸提取物為陰性對照，以無菌水為空白對照。引物16S rRNA（上下游）終濃度為0.16 μmol·L-1，引物stx（下上游）終濃度為1.25 μmol·L-1，引物eae（上下游）終濃度為1 μmol·L-1，探針16S rRNA 終濃度為0.1 μmol·L-1，探針stx1、探針stx2終濃度為0.25 μmol·L-1，探針eae終濃度為0.2 μmol·L-1。實時熒光PCR 反應參數為95 ℃/15 s，59 ℃/1 min，45 個循環。

2 結果與分析

2.1 產志賀毒素大腸埃希氏菌和腸致病性大腸埃希氏菌總體監測情況

于2018 年9 月—2019 年3 月，每個月從超市和農貿市場抽取20 份樣本，7 個月共抽取140 份牛肉及制品樣本，在qPCR 初篩時stx陽性率為45.8%，eae的陽性率為52.2%，2018 年9 月—2019 年3 月，每月的stx初篩陽性率分別為65%、60%、80%、5%、25%、45%和40%；eae初篩陽性率分別為70%、70%、65%、0%、40%、65%和55%。

2.2 攜帶stx 基因的產類志賀毒素大腸埃希氏菌和攜帶eae 基因的腸致病性大腸埃希氏菌檢出情況

檢出攜帶stx基因的產類志賀毒素大腸埃希氏菌樣本為4 份，樣本陽性菌株檢出率為2.9%，檢出攜帶eae基因的腸致病性大腸埃希氏菌樣本為12 份，樣本陽性菌株檢出率為8.6%。從9月開始監測至3月，每個月共抽取樣本20 個，stx陽性檢出率分別為0%、0%、10%、0%、5%、5%和0%；eae陽性檢出率分別為0%、5%、10%、5%、15%、10%和15%。

2.3 陽性菌落培養特性

將PCR 結果擴增同時出現stx、eae基因陽性增菌菌懸液劃線或涂布改良CHROMagar STEC 顯色培養基和改良Rainbow O157 顯色培養基平板上，于37 ℃培養18 ～24 h，觀察形態。不同選擇性瓊脂平板上的菌落特征見圖1。

圖1 顯色平板上陽性菌落

用試劑盒分離得到的陽性單菌總DNA 后，對毒力基因stx、eae進行分析，PCR 擴增結果見圖2。單獨攜帶stx的有4 株；單獨攜帶eae基因的有9 株。

圖2 分離單菌落PCR 結果

3 結論與討論

大腸埃希氏菌是一種隨著環境變化而多變的微生物，即使侵襲性感染也有可能進化出危及生命的并發癥，產志賀毒素大腸埃希氏菌（STEC）和致腹瀉的大腸埃希氏菌（EPEC）菌株仍然是重要的病原體。STEC 的主要毒力因子是志賀毒素stx1和stx2（由stx1和stx2基因編碼），它們干擾蛋白質合成并導致腸道細胞死亡[5]。eae基因是EPEC 引起A/E 損傷所必需的[6]。本次研究抽取的樣本是140 個牛肉樣品，在qPCR 初篩時stx陽性率為45.8%，eae的陽性率為52.2%。篩出STEC 陽性樣本為4 份，樣本陽性菌株檢出率為2.9%，低于TORO 等[7]的研究（10%），篩出EPEC 的陽性樣本為12 份，樣本陽性菌株檢出率為8.6%，高于LEE 等[8]的研究（4.1%）。牛肉樣品中SETC 和EPEC 的檢出率不容樂觀，后續還將對其毒力做進一步研究，確定其致病性。