金屬有機框架富集-酶聯免疫法測定塑料包裝飲品中雙酚A

劉 鎮，曲麗潔

（河北省農產品食品質量安全分析檢測重點實驗室 河北北方學院，河北張家口 075000）

雙酚A（Bisphenol A，BPA）是制造環氧樹脂等樹脂類塑料制品的原料[1-2]。隨著食品特別是飲品外包裝輕量化、便捷化發展，塑料包裝已被廣泛用于飲品保存和運輸過程。在高溫、酸性和含有乳化劑等條件下，部分飲品包裝容器中的雙酚A 容易釋放進入飲品，被消費者攝入體內，對健康產生不利影響[3-5]。因此，飲品中的雙酚A 含量值得關注。

分散固相萃取（Dispersive Solid-Phase Extraction，DSPE）是將固體吸附劑分散于液體分析物，將分析物從復雜基質中分離和凈化的方法[6-7]，具有高效、易操作、快速等優點，被廣泛應用于樣品前處理中[8-9]。金屬有機框架（Metal Organic Frameworks，MOFs）是有機聚合物形成的三維結構，表現為有規則的多孔結構和大的比表面積，可以作為固相萃取的良好材料[10-12]。酶聯免疫法是一種利用抗原抗體反應的檢測方法，具有靈敏度高、特異性好的優點，被廣泛應用于食品安全檢測領域[13-15]。本試驗合成金屬有機框架材料，利用該材料研發一種塑料包裝飲品雙酚A 含量測定的前處理方法，而后利用酶聯免疫法進行測定，可顯著提高雙酚A 的檢測靈敏度，大大節省前處理步驟和時間，同時具有環境友好的優點。

1 材料和方法

1.1 試劑、儀器與設備

雙酚A、無水ZrCl4、2-氨基對苯二甲酸和N,N-二甲基甲酰胺（A.R.），無水乙醇（≥99.7%），麥克林；甲醇（A.R.），磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、鹽酸和氫氧化鈉（分析純），天津市大茂化學試劑廠；乙腈、丙酮（色譜純），Fisher；雙酚A 酶聯免疫檢測試劑盒，六角體科技。

LC-DZF-6090AB 真空干燥箱，力辰；TDZ4-WS離心機，湘儀；KQ-500B 超聲波清洗機，昆山儀器；KD200 氮吹儀，奧盛儀器；pH 計，雷磁；渦旋振蕩器，IKA；LC-FA2004 電子天平，力辰；K3 酶標儀，Thermo；SN-MWB-4 洗板機，尚儀。

1.2 方法

1.2.1 MOFs 固相萃取材料制備

取N,N-二甲基甲酰胺50 mL，加入1 g 無水ZrCl4和0.8 g 2-氨基-對苯二甲酸，超聲5 min 分散，將混合體系轉移至含有聚四氟乙烯的反應釜中，120 ℃反應24 h，冷卻后的反應液以2 000 r·min-1離心5 min，棄上清，用N,N-二甲基甲酰胺洗滌3 次，乙醇洗滌3 次，60 ℃真空干燥，得到鋯基MOF Uio-66金屬有機框架顆粒[16-17]。

1.2.2 樣品的處理和檢測

取塑料包裝中的10 mL 飲品樣品置于15 mL 玻璃離心管中，加入0.1 g MOFs 粉末，振蕩1 min，1 000 r·min-1離心，棄去上清，向沉淀中加入1 mL甲醇復溶，離心取上清，吹干，用1 mL 0.01 mol·L-1PBS 緩沖液（pH 值為7.4）復溶殘渣，使用ELISA 試劑盒檢測。

1.2.3 方法影響因素的考察

（1）樣品pH 值對測定結果的影響。一些飲品由于含有水果成分或檸檬酸等添加劑，常表現為酸性，一些豆漿類飲品則表現為偏微堿性。MOFs 材料在前處理過程中扮演固相萃取的角色，將溶液中的雙酚A 吸附在MOFs 材料表面，因此有必要驗證合成的MOFs 材料在不同pH 值溶液中的吸附性能。取去離子水將雙酚A 標準品稀釋至濃度為0.5 mg·L-1，分成若干份，使用鹽酸和氫氧化鈉溶液將其pH 值分別調整為2、3、4、5、6、7、8、9，按照1.2.2 方法使用MOFs 富集-ELISA 檢測試劑盒檢測。

（2）不同洗脫液對檢測結果的影響。設定pH 值為5，對4 管恒定濃度的BPA 水溶液（0.5 mg·L-1）中加入0.1 g MOFs 材料進行萃取，而后離心，棄去上清，向離心管中加入1 mL 甲醇、丙酮、正己烷、乙酸乙酯進行復溶，而后離心，取上清有機相氮氣吹干，用PBS（pH 7.4）定容，按照1.2.2 方法使用ELISA 試劑盒檢測，計算BPA 回收率。

（3）BPA 含量對檢測結果的影響。制作一系列不同濃度（0.01 mg·L-1、0.10 mg·L-1、1.00 mg·L-1、10.00 mg·L-1和100.00 mg·L-1）的BPA 水溶液模擬飲料樣本，各取10 mL 樣本（10 mL 樣本中BPA 含量分別為0.000 1 mg、0.001 0 mg、0.010 0 mg、0.100 0 mg和1.000 0 mg）加入0.1 g MOFs 進行BPA 的富集，而后按照1.2.2 方法使用ELISA 試劑盒檢測，計算回收率。

（4）飲品基質對測定結果的影響。選取果汁類、茶飲料、奶、豆漿、功能飲料、白酒（53 度）和啤酒樣本進行樣本加標回收實驗（加標濃度1 mg·L-1），測定回收率。

（5）飲品溫度對檢測結果的影響。飲品有熱飲、冷飲，溫度不同可能對MOFs材料富集BPA產生影響。本試驗將同一BPA 濃度（0.1 mg·L-1）的果汁樣本分成若干份，分別使溫度達到4 ℃、20 ℃、50 ℃、70 ℃，迅速加入0.1 g MOFs進行富集而后進行洗脫和測定。

2 結果與分析

2.1 樣品pH 值對測定結果的影響

如圖1 所示，當pH 處于2 ～7，雙酚A 的回收率均大于90%，當pH 為5 時，回收率達到最高，當pH ＞7 時，回收率隨pH 升高而下降。可能是因為酸性和中性條件下溶液中極性基團占據主導，BPA溶解度不大，當加入MOFs 材料后，根據相似相溶的原理，BPA 由于非極性基團的存在使其很容易吸附在MOFs 表面，隨著pH 增大，水中的氫氧根濃度增大，與BPA 作用生成的BPA 金屬鹽則更容易分散于水相，故而表現為MOFs 材料在堿性溶液中對BPA 分子固相萃取效果的減弱。當pH 為9 時，回收率仍然有80%，這說明MOFs 材料可對pH 值為2 ～9的水溶液中BPA 進行萃取并取得滿意結果，不需要對飲品的pH 值進行調整，可以作為飲品中BPA 的富集方法。

圖1 樣品pH 值對測定結果的影響

2.2 不同洗脫液對檢測結果的影響

如圖2 所示，甲醇和丙酮的洗脫效果較好，回收率大于95%，而正己烷和乙酸乙酯的洗脫回收率不高，小于90%。其原因可能是MOFs 材料表面有飲料水分，而正己烷對BPA 的溶解性不好，導致回收率不高，乙酸乙酯與水不互溶，形成油包水結構，阻礙了其與MOFs 接觸，從而影響了洗脫效果。因而在后續試驗中可選擇甲醇和丙酮作為洗脫劑。

圖2 洗脫液對檢測結果的影響

2.3 BPA 含量對檢測結果的影響

如圖3 所示，當BPA 的含量低于0.010 0 mg 時，該方法具有較好的回收率，當大于0.010 0 mg 時，隨著濃度升高，BPA 檢測回收率急劇下降。證明在水系當中，0.1 g MOFs 材料對BPA 的吸附極限在0.010 0 mg 左右，吸附的極限約1/10 000（m/m），若BPA 含量過高，則造成水相與MOFs 相分布達到平衡，不能完全吸附。造成這一現象的原因可能是MOFs 材料對于BPA 的吸附主要依靠非極性結構部分相似相溶與少量的氫鍵作用力，作用力較弱，結合位點有限。

圖3 BPA 含量對檢測結果的影響

2.4 飲品基質對測定結果的影響

如圖4 所示，基質為果汁、茶飲料、功能飲料的回收率均大于85%；對于啤酒來說，回收率達到83%，也比較滿意；對于奶和豆漿基質來說，回收率分別為68%和75%，說明牛奶和豆漿基質對于MOFs 的固相萃取效果有一定影響；對于白酒來說，回收率明顯不足（5%），原因可能是酒精含量高，BPA 與酒精的親和力強于MOFs，導致MOFs 在高度酒精體系中難以富集BPA。

圖4 不同飲品基質的加標回收實驗

2.5 飲品溫度對檢測結果的影響

如圖5 所示，不同溫度下的檢測結果并無明顯區別，說明溫度波動對MOFs富集BPA的影響不顯著。通常情況下，熱飲更容易將塑料包裝中的BPA 溶解到飲品之中，消費者攝入BPA 的風險更高。本試驗證明冷飲和熱飲均可進行MOFs 富集-ELISA 檢測工作，無須將樣本平衡至室溫，可以節省檢測時間。

圖5 飲品溫度對檢測結果的影響

2.6 方法檢出限的確定

按照1.2.2 的步驟，采用20 份空白樣品測定均值加3 倍標準差的方法測定方法的檢出限，結果為0.002 mg·L-1。

3 結論

劣質食品包裝容易導致BPA 溶出進入飲品，損害消費者健康[18]。本文將MOFs 材料富集功能和酶聯免疫技術結合起來，建立了檢測塑料包裝飲品中雙酚A 的方法，能為飲料中BPA 的檢測提供便利。通過試驗證實，該方法的檢出限達到0.002 mg·L-1，能夠滿足飲品中微量BPA 的檢測。