雷公藤甲素誘導(dǎo)自噬促進(jìn)人腎小管上皮HK-2細(xì)胞凋亡

王春強(qiáng),云 陽,梁馬丹,梁泰剛

(1.山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科,山西 太原 030001;山西醫(yī)科大學(xué) 2.藥學(xué)院、3.第一臨床醫(yī)學(xué)院,山西 晉中 030600)

雷公藤甲素(triptolide,TP)為環(huán)氧化二萜內(nèi)酯類化合物,是衛(wèi)矛科植物雷公藤的主要活性成分之一。研究表明,TP具有免疫抑制、抗炎和抗腫瘤等多種藥理活性[1]。然而,由于其對機(jī)體多個重要臟器具有毒性,可導(dǎo)致患者發(fā)生嚴(yán)重不良反應(yīng),TP的臨床應(yīng)用受到限制。腎毒性作為TP嚴(yán)重的毒副反應(yīng)之一,已受到廣泛關(guān)注,盡管大量研究表明凋亡、自噬、炎癥和氧化應(yīng)激等機(jī)制參與TP腎毒性的發(fā)生發(fā)展,其發(fā)生機(jī)制仍未完全清楚[2-4]。

TP腎毒性的發(fā)生與其導(dǎo)致腎臟細(xì)胞凋亡密切相關(guān)[2-3]。凋亡是由基因控制的細(xì)胞自主有序的死亡過程,在維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)中具有重要作用,可分為內(nèi)源性和外源性途徑凋亡[5]。其中,前者涉及線粒體凋亡通路,線粒體釋放細(xì)胞色素C,激活caspase 9,進(jìn)而催化caspase 3,引發(fā)級聯(lián)反應(yīng),最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡;另一種途徑為外源性凋亡,當(dāng)Fas、TNF(TNFR)和TRAIL(TRAILR)等死亡受體收到激活信號時,細(xì)胞也會發(fā)生凋亡[6]。人腎近端小管上皮HK-2細(xì)胞來源于正常人腎臟的原發(fā)性近端腎小管細(xì)胞,通過導(dǎo)入人乳頭瘤病毒(HPV16)E6/E7基因而獲得,接近原代培養(yǎng)的腎小管上皮細(xì)胞功能,常應(yīng)用于藥物的體外腎毒性評估[2-3]。研究表明,TP可在體外通過激活caspase 3途徑誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞凋亡[7]。

自噬是進(jìn)化上高度保守的分解代謝現(xiàn)象,可將受損的細(xì)胞器、錯誤折疊的蛋白質(zhì)、細(xì)胞中的某些病原體等由雙膜小泡包裹,并輸送到溶酶體進(jìn)行降解,是細(xì)胞維持自身穩(wěn)態(tài)的重要調(diào)節(jié)機(jī)制[8]。近年來,細(xì)胞自噬與凋亡間的調(diào)控關(guān)系受到廣泛關(guān)注,自噬對TP誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的影響及自噬在TP所致毒副反應(yīng)中的作用在不同臟器細(xì)胞中截然相反。Wei等[9]研究表明,自噬可降低TP誘導(dǎo)的心臟毒性和肝毒性。相反,Chan等[10]研究發(fā)現(xiàn),自噬增強(qiáng)TP對小鼠急性粒-單核白血病細(xì)胞系WEHI-3細(xì)胞的毒性。因此,研究受TP毒性損傷臟器細(xì)胞中自噬與凋亡間的調(diào)控關(guān)系,并通過對自噬水平的調(diào)控可能是降低TP所致毒副反應(yīng)的可行途徑。然而目前,自噬對TP誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞凋亡作用以及TP對HK-2細(xì)胞自噬的影響仍未見文獻(xiàn)報道。

因此,本論文旨在研究TP對HK-2細(xì)胞凋亡及自噬的影響,并采用自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)和自噬激動劑雷帕霉素(rapamycin,Rap)進(jìn)一步探討自噬對TP所致HK-2細(xì)胞凋亡的調(diào)控關(guān)系,為TP腎毒性的防治提供新思路和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物和試劑TP(JOT-10201)購自成都普菲德公司;吖啶橙(acridine orange,AO)(C11739823)購自麥克林公司;溴化乙錠(ethidium bromide,EB)(Top0236)購自北京博奧拓達(dá)公司;3-MA(40214)和Rap(44683)購自MCE公司;一抗caspase 9、Bax、Bcl-2、LC3、p62(SQSTM1)和Beclin 1購自武漢三鷹公司;CCK-8細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性檢測試劑盒購自上海翊圣公司;AnnexinV-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒、BCA試劑盒、超敏ECL化學(xué)發(fā)光即用型底物和DAPI染色液購自博士德公司;JC-1線粒體膜電位檢測試劑盒購自蘇州宇恒公司;4%多聚甲醛、0.5% Triton X-100、免疫染色封閉液、免疫染色洗滌液、免疫染色一抗稀釋液、免疫染色二抗稀釋液、Alexa Fluor 555熒光二抗購自上海碧云天公司。

1.2 儀器恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱(上海力申科學(xué)儀器有限公司);倒置生物顯微鏡(重慶奧特光學(xué)儀器有限公司);全波長多功能酶標(biāo)儀(美國Thermo公司);流式細(xì)胞儀(美國BD公司);臺式低速離心機(jī)和臺式高速冷凍離心機(jī)(湖南湘儀公司);倒置熒光顯微鏡(德國Leica公司);凝膠成像系統(tǒng)(美國BIO-RAD公司);激光掃描共聚焦顯微鏡(美國Meridian公司)。

1.3 方法

1.3.1細(xì)胞培養(yǎng) 人腎近端小管上皮HK-2細(xì)胞購自廣州吉妮歐生物科技有限公司,由本實(shí)驗室傳代凍存。HK-2細(xì)胞在含有10%(V/V)FBS(Gibco)和1%青鏈霉素混合液的RPMI 1640培養(yǎng)基中,置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%～90%后,胰蛋白酶消化傳代。

1.3.2CCK-8法測定細(xì)胞存活率 HK-2細(xì)胞(5×107L-1)按照每孔100 μL接種于96孔板中培養(yǎng)過夜。實(shí)驗分組1:設(shè)空白對照組和TP處理組,TP終濃度分別為10、50、100、200、400 nmol·L-1,作用時間24 h;實(shí)驗分組2:設(shè)空白對照組和12、24、36 h TP處理組,TP終濃度為50 nmol·L-1;隨后,棄去上清,每孔分別加入100 μL無血清RPMI 1640培養(yǎng)基和10 μL CCK-8試劑,孵育1 h后,用酶標(biāo)儀在450 nm處測定A值。

1.3.3倒置熒光顯微鏡觀察AO/EB染色細(xì)胞形態(tài)變化 通過倒置熒光顯微鏡觀察TP誘導(dǎo)及自噬抑制劑3-MA和誘導(dǎo)劑Rap干預(yù)下,HK-2細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化。將HK-2細(xì)胞(1×107L-1)接種于6孔板中,每孔2 mL。實(shí)驗分組1:設(shè)空白對照組和TP處理組,TP終濃度為25、50、100 nmol·L-1,作用時間24 h;實(shí)驗分組2:設(shè)空白對照組、TP(50 nmol·L-1)處理組、3-MA(1 mmol·L-1)+TP(50 nmol·L-1)處理組、3-MA(1 mmol·L-1)處理組、Rap(7 nmol·L-1)+TP(50 nmol·L-1)處理組、Rap(7 nmol·L-1)處理組,作用時間24 h;PBS輕輕洗滌2次,加入AO和EB(100 mg·L-1,1 ∶1)混合溶液避光孵育2 min,倒置熒光顯微鏡觀察拍攝。

1.3.4流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率 HK-2細(xì)胞(5×107L-1)于6孔板中培養(yǎng)過夜,每孔2 mL。實(shí)驗分組同“2.3”,消化并收集細(xì)胞,懸浮于PBS中。1 000 r·min-1離心5 min后棄去上清并加入200 μL 1×結(jié)合緩沖液、5 μL Annexin V-FITC和10 μL PI試劑,避光孵育15 min后,流式細(xì)胞儀檢測。

1.3.5線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential,MMP)的檢測 HK-2細(xì)胞(5×107L-1)接種于6孔板培養(yǎng)過夜,每孔2 mL。設(shè)空白對照組和TP處理組,TP終濃度為25、50、100 nmol·L-1,作用時間24 h,經(jīng)胰蛋白酶消化后,PBS洗滌離心,加入JC-1染料,于37 ℃在黑暗中孵育30 min。隨后,流式細(xì)胞儀檢測。

1.3.6免疫熒光檢測 HK-2細(xì)胞接種于激光共聚焦培養(yǎng)皿中培養(yǎng)過夜,50 nmol·L-1TP處理細(xì)胞24 h后,PBS洗滌兩次,并在室溫下用4%多聚甲醛固定10 min。繼而,0.5% Triton X-100(PBS配制)室溫處理10～15 min后,PBS洗滌,加入免疫染色封閉液室溫封閉60 min,與LC3抗體(1 ∶200)在4 ℃下孵育過夜。免疫染色洗滌液洗滌樣品后,與Alexa Fluor 555偶聯(lián)二抗(1 ∶1 000)于室溫下孵育60 min,加入DAPI染色3～5 min,并用PBS洗滌。最后,使用激光共聚焦顯微鏡觀察掃描。

1.3.7蛋白印跡分析 HK-2細(xì)胞(5×107L-1)接種于6孔板中培養(yǎng)過夜,每孔2 mL。實(shí)驗分組1:設(shè)空白對照組和TP處理組,TP終濃度分別為25、50、100 nmol·L-1,作用時間24 h;實(shí)驗分組2:設(shè)空白對照組和12、24、36 h TP處理組,TP終濃度為50 nmol·L-1;實(shí)驗分組3:設(shè)空白對照組、TP(50 nmol·L-1)處理組、3-MA(1 mmol·L-1)+TP(50 nmol·L-1)處理組、3-MA(1 mmol·L-1)處理組,作用時間24 h;實(shí)驗分組4:設(shè)空白對照組、TP(50 nmol·L-1)處理組、Rap(7 nmol·L-1)+TP(50 nmol·L-1)處理組、Rap(7 nmol·L-1)處理組,作用時間24 h;收集細(xì)胞,提取蛋白并使用BCA試劑盒對蛋白質(zhì)進(jìn)行定量。待測樣品通過電泳分離并轉(zhuǎn)移到NC膜上。然后,使用5%脫脂牛奶封閉,于4 ℃孵育caspase 9(1 ∶1 000)、Bax(1 ∶2 000)、Bcl-2(1 ∶1 000)、LC3(1 ∶2 000)、p62(SQSTM1)(1 ∶3 000)和Beclin 1(1 ∶2 000)一抗過夜,洗膜后加入二抗,室溫孵育1 h。最后,通過凝膠成像系統(tǒng)掃描,采用ImageJ軟件分析灰度值。

3 結(jié)果

3.1 TP降低HK-2細(xì)胞的存活率不同濃度TP處理細(xì)胞24 h,與對照組相比,隨著TP濃度增加,HK-2細(xì)胞的存活率逐漸降低。此外,50 nmol·L-1TP分別處理細(xì)胞12、24和36 h,與對照組相比,隨著時間增加,HK-2細(xì)胞的存活率逐漸降低(Fig 1)。

3.2 TP誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞凋亡為檢測TP是否可誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞凋亡,采用AO/EB染色法,通過倒置熒光顯微鏡進(jìn)行觀察HK-2細(xì)胞形態(tài)。對照組未見凋亡細(xì)胞,TP處理組中檢測到以黃綠色標(biāo)記的早期凋亡細(xì)胞和以橙色標(biāo)記的晚期凋亡細(xì)胞,隨著TP濃度升高,凋亡細(xì)胞增加(Fig 2A)。此外,通過流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)一步對TP誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞凋亡狀況進(jìn)行檢測,不同濃度TP(25、50和100 nmol·L-1)處理細(xì)胞24 h后,Annexin V-FITC和PI染色結(jié)果顯示,隨著TP濃度增加,HK-2細(xì)胞的凋亡率逐漸上升(Fig 2B-C)。

3.3 TP通過線粒體途徑誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞凋亡流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示,暴露于不同濃度TP 24 h后,隨著TP濃度增加,HK-2細(xì)胞MMP逐漸下降(Fig 3A-B)。并且,Western blot結(jié)果顯示,不同濃度TP處理HK-2細(xì)胞24 h,隨著TP濃度增加,cleaved caspase 9/caspase 9和Bax/Bcl-2比值上調(diào)(Fig 3C-E)。

3.4 TP誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞自噬50 nmol·L-1TP處理HK-2細(xì)胞24 h,與對照組相比,TP處理組細(xì)胞內(nèi)LC3Ⅱ熒光強(qiáng)度增強(qiáng)(Fig 4A)。隨后,進(jìn)一步使用Western blot檢測TP對細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白LC3、Beclin 1和p62(SQSTM1)表達(dá)的影響。不同濃度的TP處理細(xì)胞24 h,與對照組相比,p62(SQSTM1)的表達(dá)水平隨著TP濃度的增加而明顯下降,25和50 nmol·L-1TP處理組細(xì)胞中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值和Beclin 1的表達(dá)水平增加,然而100 nmol·L-1TP處理組差異無顯著性(Fig 4B)。此外,本研究檢測了50 nmol·L-1TP分別處理HK-2細(xì)胞12、24和36 h后自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的情況。如Fig 4C所示,隨著TP處理時間增加,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值和Beclin 1的表達(dá)水平逐漸上升,而p62(SQSTM1)的表達(dá)水平逐漸下降。

Fig 2 Effects of TP on morphology and apoptosis of HK-2 n=3)

Fig 3 Effects of TP on MMP and expression of apoptosis-related proteins in HK-2 n=3)

Fig 4 Effect of TP on autophagy activity of HK-2 n=3)

3.5 抑制自噬減少TP誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞凋亡,增強(qiáng)自噬增加TP誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞凋亡為了探討自噬對TP誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞凋亡的影響,采用自噬抑制劑3-MA和自噬激動劑Rap與TP(50 nmol·L-1)分別聯(lián)用進(jìn)行探索。如Fig 5A-B所示,1 mmol·L-13-MA降低HK-2細(xì)胞LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值,增加p62(SQSTM1)表達(dá);7 nmol·L-1Rap顯著增加HK-2細(xì)胞內(nèi)LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值,減少p62(SQSTM1)表達(dá)。在后續(xù)實(shí)驗中,我們選擇1 mmol·L-13-MA和7 nmol·L-1Rap進(jìn)行進(jìn)一步研究。CCK-8結(jié)果顯示,3-MA+TP組細(xì)胞活力高于TP組(Fig 5C),而Rap+TP組細(xì)胞活力低于TP組(Fig 5D)。此外,我們通過AO/EB染色和Annexin V-FITC/PI雙染法檢測3-MA和Rap分別與TP聯(lián)用后細(xì)胞凋亡水平的變化情況。結(jié)果顯示,3-MA可減少TP誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞凋亡,Rap增加TP誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞凋亡(Fig 5E-F)。最后,本研究檢測了3-MA和Rap分別與TP聯(lián)用后cleaved caspase 9和caspase 9蛋白表達(dá)水平變化。3-MA+TP組中cleaved caspase 9/caspase 9比值低于單獨(dú)TP組,而Rap+TP組cleaved caspase 9/caspase 9比值高于TP組(Fig 5G-H)。

Fig 5 Effects of 3-MA and Rap on TP-induced

4 討論

藥理學(xué)研究表明,TP具有腎毒性,可導(dǎo)致HK-2細(xì)胞存活率下降,凋亡水平升高[7]。細(xì)胞凋亡的主要調(diào)節(jié)因子包括Bax、Bcl-2、caspase 9和caspase 3等。其中,Bax和Bcl-2可獨(dú)立調(diào)節(jié)凋亡,也可通過形成二聚體調(diào)節(jié)凋亡[11]。Bax表達(dá)的上調(diào)和Bcl-2表達(dá)的下調(diào)可刺激線粒體向細(xì)胞質(zhì)釋放細(xì)胞色素C,進(jìn)而激活caspase 9和caspase 3,最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[12]。本研究結(jié)果表明,TP顯著降低HK-2細(xì)胞的存活率并誘導(dǎo)其凋亡。為進(jìn)一步探討TP調(diào)控細(xì)胞凋亡的可能機(jī)制,本文檢測MMP和凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2、cleaved caspase 9和caspase 9。HK-2細(xì)胞經(jīng)TP處理后,MMP下降、cleaved caspase 9/caspase 9和Bax/Bcl-2比值上升,表明線粒體凋亡通路可能參與了TP誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞凋亡(Fig 3)。

自噬是促進(jìn)異常細(xì)胞凋亡和維持正常細(xì)胞穩(wěn)態(tài)必不可少的動態(tài)過程。LC3、Beclin 1和p62(SQSTM1)均是細(xì)胞內(nèi)重要的自噬標(biāo)志蛋白[13]。本研究發(fā)現(xiàn),p62(SQSTM1)的表達(dá)水平隨著TP濃度的增加而下降,25和50 nmol·L-1TP上調(diào)細(xì)胞中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值,并使Beclin 1表達(dá)水平升高;但在100 nmol·L-1TP作用時,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值和Beclin 1表達(dá)水平與空白對照組相比無顯著性差異。結(jié)果表明TP在一定濃度范圍內(nèi)(50 nmol·L-1以內(nèi))可促使HK-2細(xì)胞自噬水平升高。

Liu等[13]研究表明,自噬水平升高可以減少尿蛋白對腎小管上皮細(xì)胞的損傷。與之相反,Melk等人研究表明β-淀粉樣肽通過激活自噬促進(jìn)神經(jīng)元PC12細(xì)胞凋亡[14]。因此,本研究采用自噬抑制劑3-MA和激動劑Rap探索自噬對TP誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞凋亡的影響。研究發(fā)現(xiàn),與TP組相比,3-MA+TP組HK-2細(xì)胞的損傷減弱;而Rap+TP組HK-2細(xì)胞的損傷增強(qiáng)(Fig 5)。本研究結(jié)果與趙林等[15]研究報道一致,TP可誘導(dǎo)人結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞自噬水平升高,進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生,其原因可能為自噬和凋亡間具有協(xié)同關(guān)系。此外,白利平等[16]研究發(fā)現(xiàn),TP與表皮生長因子受體單克隆抗體西妥昔單抗單獨(dú)或聯(lián)合作用于SW480細(xì)胞株時,TP可通過抑制mTOR通路誘導(dǎo)細(xì)胞自噬性凋亡的發(fā)生。本研究表明,自噬和凋亡共同參與TP對HK-2細(xì)胞的毒性作用機(jī)制,自噬對TP誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞凋亡具有促進(jìn)作用。另外,本研究中,100 nmol·L-1TP誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞凋亡率較25和50 nmol·L-1TP處理組高(Fig 2-3),而100 nmol·L-1TP組自噬水平低于25和50 nmol·L-1TP處理組(Fig 4),這一現(xiàn)象可能由于高濃度(100 nmol·L-1)TP通過影響細(xì)胞損傷相關(guān)機(jī)制,最終導(dǎo)致HK-2凋亡水平升高,確切機(jī)制并不十分清楚,有待進(jìn)一步研究。

綜上所述,TP可通過線粒體途徑介導(dǎo)HK-2細(xì)胞凋亡,誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞自噬水平升高,并且,抑制自噬可降低TP導(dǎo)致的HK-2細(xì)胞損傷。因此,抑制自噬是緩解TP腎毒性的潛在治療策略。