棕櫚酸誘導(dǎo)小鼠精原細(xì)胞株GC-1細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制

鄧 何, 趙海霞, 周本文, 常言語, 陳思敏, 楊焱娜, 付國慶, 張長城

(1. 三峽大學(xué)國家中醫(yī)藥管理局中藥藥理科研三級(jí)實(shí)驗(yàn)室,2.三峽大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,3.三峽大學(xué)健康醫(yī)學(xué)院,湖北 宜昌 443002)

臨床研究發(fā)現(xiàn),肥胖可導(dǎo)致男性精子濃度和活力下降、精子DNA損傷以及性腺功能減退,從而對(duì)男性生殖功能產(chǎn)生負(fù)面影響[1]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)亦表明,高脂飲食可誘導(dǎo)大鼠[2]和小鼠[3]睪丸生精細(xì)胞凋亡,精子數(shù)量減少,進(jìn)而導(dǎo)致生殖功能障礙,甚至不育。因此,抑制高脂所致生精細(xì)胞凋亡是治療肥胖男性不育的重要措施之一。

研究證實(shí)[5],內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress,ERS)是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵因素[4]。ERS激活會(huì)觸發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum,ER)未折疊蛋白質(zhì)反應(yīng)(unfolded protein response,UPR),細(xì)胞通過減少蛋白質(zhì)翻譯、降解錯(cuò)誤折疊蛋白以及促進(jìn)錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)重新折疊以緩解ER壓力,恢復(fù)ER功能。然而,持續(xù)或嚴(yán)重的ERS會(huì)激活細(xì)胞凋亡通路,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。研究證實(shí),高脂誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞凋亡與ERS直接相關(guān)[6]。但高脂所致的生精細(xì)胞凋亡是否與ERS相關(guān),目前未見研究報(bào)道。

在肥胖人群中,游離脂肪酸(free fatty acid,FFA)的水平異常升高,棕櫚酸(palmitic acid,PA)作為血漿中最常見的一種FFA,被廣泛應(yīng)用于高脂細(xì)胞模型的建立[7]。本研究采用PA處理小鼠精原細(xì)胞株GC-1細(xì)胞模擬體外高脂損傷模型,觀察PA對(duì)精原細(xì)胞凋亡蛋白以及ERS相關(guān)蛋白表達(dá)的影響,初步探討ERS在高脂所致的GC-1細(xì)胞凋亡中的作用機(jī)制。

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞系 GC-1細(xì)胞購自湖南豐暉生物科技有限公司。

1.1.2試劑 PA(P5585)購自Sigma-Aldrich;不含脂肪酸的牛血清白蛋白-V(BSA-V,A8850)購自Solarbio;DMEM/F12培養(yǎng)基(C11330500BT)購自Thermo Fisher Scientific;caspase-3活性檢測(cè)試劑盒(C1115)、RIPA裂解液(P0013B)購自Beyotime;AnnexinⅤ-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(KGA106)購自KeyGEN;ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(G2014)、蛋白上樣緩沖液(G2013-1ML)購自Servicebio;MTT(M8180)購自Solarbio;Bax(50599-2-ig)、BCL2(26593-1-AP)購自Proteintech;cleaved caspase-3(MAB835)購自R&D Systems;GRP78(abs130538)、p-PERK(abs137056)購自Absin;CHOP(sc-56107)、ATF6(sc-166659)購自Santa Cruz;caspase-12(#35965)、IRE1(#3294)、PERK(#3192)購自Cell Signaling Technology;p-IRE1(ab48187)、XBP1(ab37152)、ATF4(ab184909)、eIF2α(ab5369)、p-eIF2α(ab32157)購自Abcam;Goat anti-Mouse IgG(115-035-003)購自Jackson Immunoresearch;Goat anti-Rabbit IgG(KR0023)購自武漢科瑞生物技術(shù)有限公司。

1.1.3儀器 生物潔凈工作臺(tái)購自Airtech,CO2培養(yǎng)箱購自Thermo Fisher Scientific,臺(tái)式冷凍離心機(jī)購自上海天美科學(xué)儀器,光學(xué)倒置顯微鏡購自O(shè)lympus,電泳儀購自Bio-Rad,全波長酶標(biāo)儀購自Tecan,化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)購自上海勤翔科學(xué)儀器,流式細(xì)胞儀購自常州必達(dá)科生物科技,搖床購自海門其林貝爾。

1.2 方法

1.2.1PA的配制 在70 ℃水浴鍋中,將PA溶解在0.1 mmol·L-1的NaOH中,制成40 mmol·L-1PA皂化液。在50 ℃水浴鍋中溶解BSA-V制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的BSA溶液。將上述PA皂化液與BSA溶液配制成8 mmol·L-1的PA母液,過濾、分裝,將母液用培養(yǎng)基稀釋。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng) GC-1細(xì)胞使用含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基,在37 ℃,5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.3實(shí)驗(yàn)分組 將細(xì)胞分為Control組(正常培養(yǎng),不給予任何試劑干預(yù))、Vehicle組(僅含BSA,作為溶劑對(duì)照組)、PA組(100、150、200、250 μmol·L-1),各組細(xì)胞均處理48 h。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)

1.3.1MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖活力 GC-1細(xì)胞接種于96孔板(細(xì)胞數(shù)量:1×104個(gè)/孔),培養(yǎng)24 h后,不同濃度PA處理48 h,加入10 μL MTT,37 ℃下孵育4 h,棄上清,加入200 μL DMSO,震蕩10 min,使用酶標(biāo)儀在490 nm處檢測(cè)每孔的吸光度值,計(jì)算各組細(xì)胞活力。

1.3.2流式細(xì)胞術(shù)Annexin V-FITC/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 GC-1細(xì)胞接種于6孔板(細(xì)胞數(shù)量:3×105個(gè)/皿),培養(yǎng)24 h后,不同濃度PA處理48 h,按Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說明處理細(xì)胞,使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè),圖中:左上/Q1-1代表壞死的細(xì)胞,右上/Q1-2代表晚期凋亡的細(xì)胞,左下/Q1-3代表正常細(xì)胞,右下/Q1-4代表早期凋亡的細(xì)胞,右上/Q1-2和右下/Q1-4之和在所有細(xì)胞中的占比即為細(xì)胞凋亡率,檢測(cè)三批細(xì)胞并計(jì)算各組細(xì)胞的平均凋亡率。

1.3.3caspase-3活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)caspase-3活性 GC-1細(xì)胞接種于6孔板,(細(xì)胞數(shù)量:3×105個(gè)/皿),培養(yǎng)24 h后,不同濃度PA處理48 h,按caspase-3活性檢測(cè)試劑盒說明處理細(xì)胞,使用酶標(biāo)儀在405 nm處檢測(cè)每孔的吸光度值。

1.3.4Western blot檢測(cè) GC-1細(xì)胞接種于6孔板,(細(xì)胞數(shù)量:3×105個(gè)/皿),培養(yǎng)24 h后,不同濃度PA處理48 h,預(yù)冷的PBS清洗殘余培養(yǎng)基,吸干殘余液體,每孔加入100 μL RIPA裂解液,裂解30 min,收集細(xì)胞,冰上繼續(xù)裂解15 min,4 ℃、12 000 r·min-1離心10 min,將上清轉(zhuǎn)入1.5 mL EP管中,BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒檢測(cè)蛋白濃度,蛋白中加入1/5體積Loading Buffer于70～100 ℃水浴鍋中變性10～15 min,SDS-PAGE蛋白電泳,250 mA轉(zhuǎn)膜,封閉液封閉1 h,一抗4 ℃孵育過夜,洗膜,二抗室溫孵育1 h,洗膜,ECL化學(xué)發(fā)光液浸潤條帶,化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)顯影。

2 結(jié)果

2.1 PA對(duì)GC-1細(xì)胞增殖活力的影響MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與Vehicle組相比,PA處理GC-1細(xì)胞48 h后,細(xì)胞增殖活力呈濃度依賴性下降,在PA濃度達(dá)到250 μmol·L-1及以上時(shí),細(xì)胞活力下降到50%以下(Fig 1)。

2.2 PA對(duì)GC-1細(xì)胞凋亡率的影響流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示,與Vehicle組相比,當(dāng)PA濃度上升到200 μmol·L-1時(shí),細(xì)胞凋亡明顯升高,當(dāng)PA濃度達(dá)到250 μmol·L-1時(shí),細(xì)胞凋亡接近50%(Fig 2)。

2.3 PA對(duì)GC-1細(xì)胞凋亡蛋白caspase-3活性的影響Fig 3結(jié)果表明,與Vehicle組相比,凋亡蛋白caspase-3的活性在PA處理后表現(xiàn)出濃度依賴性上升的趨勢(shì),當(dāng)PA濃度上升到150 μmol·L-1時(shí),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.4 PA對(duì)GC-1細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)的影響Western blot結(jié)果表明,與Vehicle組相比,GC-1細(xì)胞在150、200、250 μmol·L-1PA處理后,BAX/BCL2及cleaved-caspase-3的表達(dá)明顯上調(diào),且呈濃度依賴性(Fig 4)。

Fig 1 Effect of PA on cell viability of GC-1 n=6)

Fig 2 Effect of PA on apoptosis rate of GC-1 n=3)

2.5 PA對(duì)GC-1細(xì)胞ERS信號(hào)通路相關(guān)蛋白GRP78、CHOP及caspase-12表達(dá)的影響Western blot結(jié)果表明,與Vehicle組相比,PA可誘導(dǎo)GC-1細(xì)胞ERS標(biāo)志物蛋白GRP78以及ERS相關(guān)的凋亡標(biāo)志物蛋白CHOP表達(dá)上調(diào),ERS凋亡的關(guān)鍵蛋白cleaved-caspase-12/caspase-12比值上升(Fig 5)。

Fig 3 Effects of PA on activity of caspase-3

Fig 4 Effects of PA on expression of apoptosis pathway related proteins in GC-1 n=3)

2.6 PA對(duì)GC-1細(xì)胞PERK-eIF2α-ATF4及ATF6信號(hào)通路的影響Western blot結(jié)果表明,PA處理后,各組細(xì)胞PERK-eIF2α-ATF4信號(hào)通路蛋白p-PERK/PERK、p-eIF2α/eIF2α相較于Vehicle組無明顯變化,ATF4在PA濃度上升至250 μmol·L-1時(shí)表達(dá)下調(diào),ATF6信號(hào)通路蛋白ATF6的表達(dá)無顯著變化(Fig 6)。

Fig 5 Effects of PA on expression levels of ERS pathway related proteins GRP78, CHOP and caspase-12 in GC-1 n=3)

2.7 PA對(duì)GC-1細(xì)胞IRE1-XBP1信號(hào)通路的影響Fig 7結(jié)果表明,與Vehicle組相比,PA處理誘導(dǎo)了GC-1細(xì)胞IRE1-XBP1信號(hào)通路蛋白p-IRE1/IRE1、XBP1(Fig 7)的表達(dá)明顯上調(diào)。

3 討論

肥胖通常伴隨著脂肪酸代謝失調(diào),包括血漿中飽和脂肪酸水平升高[7]。臨床研究表明,膳食中PA的攝入量過多會(huì)引發(fā)弱精子癥[8],提示PA在肥胖相關(guān)的男性不育中起重要作用。在睪丸組織中過量的PA會(huì)引起脂毒性引起細(xì)胞功能障礙,進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[9]。

PA可通過激活HepG2肝細(xì)胞[6]的ERS誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果顯示,隨著PA濃度的升高,GC-1細(xì)胞凋亡蛋白caspase-3,活性上升、細(xì)胞凋亡率升高、凋亡蛋白cleaved caspase-3表達(dá)上調(diào),BCL2表達(dá)下調(diào)。以上結(jié)果說明,PA處理誘導(dǎo)了GC-1細(xì)胞的凋亡。

研究發(fā)現(xiàn),ERS與細(xì)胞凋亡直接相關(guān),在ERS發(fā)生時(shí),GRP78顯著上調(diào),并通過觸發(fā)UPR進(jìn)而導(dǎo)致促凋亡轉(zhuǎn)錄因子CHOP水平升高,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[5]。在毒胡蘿卜素(thapsigargin,TG)誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞[10]ERS模型中,GRP78與CHOP顯著上調(diào),細(xì)胞凋亡增多。本研究結(jié)果顯示,PA處理48 h后,GRP78與CHOP表達(dá)均顯著上調(diào)。以上結(jié)果表明,PA處理激活了GC-1細(xì)胞的ERS,這也許是PA誘導(dǎo)GC-1細(xì)胞凋亡可能的作用機(jī)制。因此,本研究隨后探討了ERS信號(hào)通路的變化情況。

ERS激活會(huì)觸發(fā)UPR,GRP78與PERK、IRE1、ATF6解離,并通過以下3條不同的通路緩解ERS,PERK-eIF2α-ATF4是UPR中最經(jīng)典的途徑,當(dāng)PERK與GRP78解離時(shí)會(huì)發(fā)生自磷酸化,從而使eIF2α失活,抑制大部分蛋白質(zhì)的合成從而緩解ER壓力,然而p-eIF2α可特異性上調(diào)ATF4的表達(dá)。在UPR早期,ATF4上調(diào)ER分子伴侶蛋白的轉(zhuǎn)錄表達(dá)以恢復(fù)ER穩(wěn)態(tài),而在長期的UPR狀態(tài)下,ATF4可以與UPR元件結(jié)合,促進(jìn)CHOP的表達(dá),誘導(dǎo)ATP耗竭、氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡[11];IRE1-XBP1是UPR中最保守的途徑,當(dāng)IRE1與GRP78解離時(shí)會(huì)發(fā)生自磷酸化,IRE1可通過IRE1依賴的降解(RIDD)減少蛋白質(zhì)的合成以緩解ER壓力,然而長期的UPR狀態(tài)下,p-IRE1可將XBP1剪切,剪切后的XBP1易位到細(xì)胞核中,上調(diào)CHOP的表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞凋亡[12];ATF6是UPR中很重要的一條途徑,當(dāng)ATF6與GRP78解離時(shí)會(huì)被高爾基體蛋白酶體剪切并激活,激活后的ATF6進(jìn)入細(xì)胞核后可促進(jìn)ER分子伴侶基因的轉(zhuǎn)錄,調(diào)節(jié)UPR以緩解ER壓力。同時(shí),ATF6也可以增強(qiáng)XBP1和CHOP的轉(zhuǎn)錄[13]。綜上,在UPR早期,ATF4與ATF6的功能相似,均通過調(diào)控ER分子伴侶基因的轉(zhuǎn)錄以緩解ER壓力,與之不同的是,IRE1則通過RIDD減少蛋白質(zhì)的合成以緩解ER壓力。而在長期的UPR狀態(tài)下,三條通路則發(fā)揮著類似的作用,均可通過上調(diào)CHOP的表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

Fig 7 Effects of PA on expression levels of IRE1-XBP1 pathway related proteins in GC-1 n=3)

短時(shí)間(24 h)PA誘導(dǎo)的GC-1細(xì)胞凋亡模型中,GRP78、CHOP表達(dá)上升,PERK-eIF2α-ATF4信號(hào)通路以及IRE1-XBP1通路被激活,提示PA通過PERK-eIF2α-ATF4和IRE1-XBP1兩條通路激活ERS,誘導(dǎo)GC-1細(xì)胞凋亡[14]。本研究結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道存在差異,ATF4變化的趨勢(shì)不一致,可能是因?yàn)楸狙芯恐蠵A作用的時(shí)間過長(48 h)而導(dǎo)致的。

ATF4是哺乳動(dòng)物應(yīng)激反應(yīng)的主要調(diào)節(jié)因子,包括ERS和線粒體應(yīng)激等。ATF4可通過上調(diào)ER分子伴侶蛋白的轉(zhuǎn)錄表達(dá)以恢復(fù)ER穩(wěn)態(tài);同時(shí),ATF4可通過激活綜合應(yīng)激反應(yīng)(ISR)重新編程細(xì)胞代謝,通過減少線粒核糖體蛋白、抑制線粒體翻譯維持線粒體蛋白穩(wěn)態(tài)[15]。本研究結(jié)果顯示,250 μmol·L-1PA處理48 h后,ATF4的蛋白表達(dá)水平顯著下降,提示在該條件下,GC-1細(xì)胞無法通過ATF4維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)。

IRE1與脂質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)直接相關(guān)[16],RIDD是脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵調(diào)控機(jī)制,IRE1可有效降低血漿脂質(zhì)水平,同時(shí)IRE1可有效防止肝細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)積累[17]。本研究結(jié)果顯示,PA處理48 h后,IRE1-XBP1信號(hào)通路顯著激活,提示在PA誘導(dǎo)的高脂條件下,細(xì)胞通過IRE1-XBP1信號(hào)通路調(diào)控脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)。如前所述,當(dāng)脂質(zhì)長時(shí)間過度累積時(shí),ERS被激活,進(jìn)而觸發(fā)UPR,細(xì)胞通過IRE1-XBP1信號(hào)通路促進(jìn)CHOP表達(dá)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

綜上所述,48 h PA處理誘導(dǎo)GC-1細(xì)胞凋亡,其誘導(dǎo)凋亡的機(jī)制可能與ERS相關(guān),起主導(dǎo)作用的可能是IRE1-XBP1信號(hào)通路。