紅景天苷對LPS誘導的腦內炎癥反應的抑制作用機制研究

周彬彬,鄭雪蕊,謝志揚,余正雙,吳青青,吳慧玲,賴文芳,洪桂祝

(福建中醫藥大學藥學院,福建 福州 350122)

中樞神經系統中的神經炎癥是神經免疫學研究的重要課題。新出現的證據表明,神經炎癥是各種神經系統疾病的關鍵因素,包括神經退行性疾病和中樞神經系統損傷[1-3]。

紅景天為景天科紅景天屬多年生草本植物,生長在海拔1 800～2 700 m高寒無污染地帶,具有很強的生命力和特殊的適應性,是我國珍貴的傳統中藥。根據醫書古籍記載,紅景天具有益氣活血,通脈平喘的功能,主治氣虛血瘀,胸痹心痛,中風偏癱,倦怠氣喘。其中紅景天苷(salidroside,sal )為紅景天屬植物的共有成分,也是紅景天的主要有效成分及其在《中國藥典》規定的含量測定指標成分[3-4],課題組前期研究[5-7]sal能夠穿透血腦屏障,對大腦中動脈閉塞(MCAO)大鼠具有較寬的治療時間窗,能夠降低腦梗死體積,改善神經功能損傷[8-9],這與sal的抗炎作用密切相關。且目前針對sal對中樞神經系統炎癥反應的研究較少,因此本文主要通過研究sal對脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)誘導的腦內炎癥反應的抑制作用,進一步探討其作用機制,為sal的藥物研發提供理論和實驗依據。

1 材料

1.1 實驗動物100只SPF級健康♂SD(Sprague Dawley)大鼠,體質量(270～280)g,于上海斯萊克實驗動物有限公司購買[許可證號SCXK(滬)2014-0002,合格證號:2015000518015],并于福建中醫藥大學實驗動物中心飼養[許可證號:SYXK(閩)2014-0005]。

1.2 實驗藥物與試劑sal(福建中醫藥大學,純度>98%);LPS(Sigma公司,貨號L2880);LY294002(Sigma公司,貨號:L9908);檸檬酸鹽緩沖液粉末(貨號:17021404);cDNA逆轉錄試劑盒(美國Thermo公司,貨號:K1622);β-actin 抗體(貨號:H015)、NF-κB p50 抗體(貨號:#3035)、Akt 抗體(貨號:#2920)、p-Akt 抗體(貨號:#4060),PCNA 抗體(貨號:#13110),TRIzol(貨號:AN51L758);蘇木精染色液(20181204)。

1.3 實驗儀器酶標儀(TECAN,InfiniteM 200Pro);熒光顯微鏡(德國Leica公司,型號:DMI8);石蠟切片機(Thermo Fisher公司,型號:HM325);電泳儀(美國Bio-Rad公司);RT-qPCR儀(美國Applied Biosystems公司,型號:7900H-PCR)。

2 方法

2.1 LPS造模大鼠經適應性喂養后,腹腔注射2%戊巴比妥鈉(2 mg·kg-1)進行麻醉,待大鼠無腳板反應后將其固定于腦立體定位儀,剪開頭皮使顱骨充分暴露,用棉球擦開黏膜使視野清晰,標記前囟位置,定位側腦室(前囟-0.8 mm,中線外側1.5 mm,硬腦膜下3.5 mm),埋入側腦室注射導管,經導管注射2 μL LPS(1 g·L-1),大鼠緩沖5 min后對其傷口進行縫合。

2.2 實驗動物分組與給藥40只SPF級大鼠隨機分為假手術組(sham組),假手術+紅景天苷組(sham+sal組),模型組(LPS組),模型組+紅景天苷組(LPS+sal組),sham組除不注射LPS外其余操作相同,sham組與LPS組腹腔注射0.9%生理鹽水(10 mL·kg-1·d-1),sal與LPS+sal組腹腔注射sal(50 mg·kg-1·d-1)。給藥1 d后取材。

60只SPF級大鼠隨機分為假手術組(sham組),假手術+抑制劑組(sham+LY294002組),模型組(LPS組),模型+抑制劑組(LPS+LY294002組),模型+紅景天苷組(LPS+sal組),模型+紅景天苷+抑制劑組(LPS+sal+LY294002組),經2%戊巴比妥鈉(2 mg·kg-1)麻醉,腦立體定位儀定位側腦室注射10 μL 10 mmol·L-1的PI3K抑制劑LY294002(用含25%DMSO的PBS溶解),30 min后經側腦室注射導管注射2 μL LPS(1 g·L-1),LPS+sal組和LPS+sal+LY294002組腹腔注射sal(50 mg·kg-1·d-1),其余組腹腔注射生理鹽水(10 mL·kg-1·d-1),給藥1 d后取材。

2.3 中性粒細胞染色將切片烘干進行脫蠟復水,檸檬酸進行抗原修復后去離子水清洗,然后將組織切片靜置,待其干燥無水后,將組織片放入配置好的中性粒細胞染色液中,于37 ℃水浴鍋中避光染色5 min,去離子水洗凈染色液,帶組織片干燥后伊紅染色5 min,于光學顯微鏡下觀察中性粒細胞陽性表達情況。

2.4 Western blot檢測p-Akt、Akt及NF-κB核蛋白的表達提取組織總蛋白并使用BCA進行蛋白濃度測定,電泳將蛋白分離后,轉移至PVDF膜上,室溫封閉2 h,加入稀釋好的一抗:NF-κB(1 ∶1 000)、Akt(1 ∶2 000)、p-Akt(1 ∶2 000)、PCNA(1 ∶1 000)。4 ℃孵育過夜,TBST洗3次,10 min/次,加入含HRP標記1 ∶1 000稀釋的二抗,室溫孵育2 h,TBST洗3次,10 min/次,于凝膠成像分析系統檢測,分析目標條帶的灰度值,并統計各組差異及顯著性。

2.5 RT-PCR檢測TNF-α、IL-1B、CD14、iNOS mRNA的影響TRIzol法提取組織RNA,檢測濃度及純度,調齊濃度,逆轉錄成cDNA,以cDNA為模版,通過RT-qPCR檢測IL-1β,TNF-α,CD14,iNOS mRNA的表達。GAPDH的上游引物序列為5′-ACGGCAAGTTCAACGGCACAG-3′,下游引物序列為5′-GAAGACGCCAGTAGACTCCACGAC-3′;TNF-α的上游引物序列為5′-ACTGAACTTCGGGGTGATCG-3′,下游引物序列為5′-GCTTGGTGGTTTGCTACGAC-3′;IL-1β的上游引物序列為5′-TCCTGAAGCATATAACCAGTACC-3′,下游引物序列為5′-TGCGCTCTGTGTGGTCTCGTACTTAG-3′;CD14的上游引物序列為5′-TGGGCAACAACGGATACCTG-3′,下游引物序列為5′-GAACTTGGAGGGTCGGGAAT-3′;iNOS的上游引物序列為5′-CCTCCTTGTTCAACTCACCTTC-3′,下游引物序列為5′-CAATCCACAACTCGCTCCAA-3′。所用引物均由尚亞生物技術有限公司提供,以GAPDH為內參校正樣品的CT值,計算2-ΔΔCT值用于基因表達的定量分析。

3 結果

3.1 中性粒細胞染色側腦室注射LPS誘導炎癥模型,給藥1 d后,中性粒細胞染色結果顯示,sham組大鼠細胞邊緣規則,結構清晰。LPS組大鼠皮層則出現核染色加深增多,細胞邊緣模糊,而經sal給藥后細胞形態有所恢復,核染色總體變淺。見Fig 1。

Fig 1 Neutrophil infiltration after rhodiola glucoside role

3.2 sal對LPS誘導炎癥大鼠腦內Akt磷酸化、NF-κB核蛋白表達的影響Western blot結果顯示,LPS組Akt蛋白磷酸化水平降低,NF-κB蛋白表達升高;經sal作用后,與LPS模型組比較大鼠腦組織中Akt蛋白磷酸化水平明顯升高,NF-κB蛋白的表達則明顯降低,差異具有統計學意義(P<0.01或P<0.05)。結果表明,sal能夠促進炎癥大鼠腦內Akt磷酸化、抑制NF-κB核蛋白表達。見Fig 2。

Fig 2 Effect of salidroside on Akt phosphorylation and NF-κB nuclear protein expression n=6)

3.3 sal對LPS誘導炎癥大鼠腦內IL-1β,TNF-α,CD14,iNOS mRNA的表達影響RT-PCR結果顯示,與sham組比較,LPS造模組中IL-1β,TNF-α,CD14,iNOS mRNA的表達均明顯升高(P<0.01或P<0.05);經sal作用后,與LPS組相比,TNF-α,IL-1β,CD14,iNOS mRNA的表達明顯降低(P<0.01或P<0.05),差異具有統計學意義,見Fig 3。

3.4 LY294002作用后,sal對LPS誘導大鼠Akt磷酸化、NF-κB核蛋白及炎癥因子表達的影響為了進一步探討sal的抗炎作用是否與PI3K/Akt信號通路密切相關,本研究采用側腦室預埋注射導管,先注射PI3K抑制劑LY294002,30 min后,再側腦室注射LPS造模。經sal給藥1 d后,與LPS+LY294002組比較,LPS+sal+LY294002組TNF-α,IL-1β,CD14,iNOS mRNA、及核蛋白NF-κB水平無顯著性差異;與LPS+sal組比較,LPS+sal+LY294002組以上各指標水平較高,且具有顯著性差異,表明LY294002能夠阻斷sal對LPS誘導大鼠腦內炎癥模型的抑制作用。見Fig 4,5。

Fig 3 Effect of salidroside on expression of TNF-α, IL-1β, CD14, iNOS mRNA n=6)

4 討論

脂多糖可以激活免疫系統,導致過度炎癥,通常用于建立各種炎癥模型,技術簡單,容易測量和識別,具有高重現性[10]。LPS處理后不久,便會釋放高水平的促炎細胞因子,并且可以在循環血清中進行測量。本實驗中LPS造模后各項炎癥指標上升明顯且可以看到中性粒細胞浸潤情況,核染色加深,細胞形態變形,而經sal給藥1 d后,能夠明顯改善上述情況。

PI3K/Akt是細胞中一個經典的信號通路,它的激活可導致各種自身免疫、炎癥和過敏過程。研究表明,炎癥反應發生后p-Akt/Akt蛋白水平顯著下降[9]。LY294002是一種PI3K抑制劑[11],已廣泛用于多種疾病的研究。NF-κB是一種反轉錄因子,對免疫和炎癥反應同樣至關重要,NF-κB可以被多種因素激活,其中就包括PI3K/Akt信號通路,NF-κB被激活后,與I-κB解離后進入細胞核,與κB位點結合,調控下游基因表達從而參與炎癥反應[12]。結果顯示,LPS造模后,AKT蛋白磷酸化表達減少,NF-κB表達升高,經sal給藥1 d后可以逆轉上述情況,但當我們使用抑制劑LY294002干預后,再sal給藥則無上述逆轉作用,表明sal可以抑制炎癥反應,且是通過激活PI3K/Akt信號通路發揮作用。

TNF-α、IL-1β是典型的促炎細胞因子。TNF-α是在急性炎癥期間產生的炎癥細胞因子,負責細胞內的信號傳導事件,導致壞死或凋亡[7]。而IL-1β參與調節宿主的先天免疫反應,可以使小膠質細胞和星形膠質細胞活化,致使中樞神經系統內其他促炎和趨化介質的下游合成[8]。CD14是免疫系統中的一種白細胞分化抗原,LPS可與CD14特異性結合,使其激活,使細胞活化,促進炎性細胞因子的產生[13-15],如TNF-α、IL-1、IL-6等,在機體免疫、防御系統引起的一系列病理反應中起關鍵作用。iNOS則可以通過加速NO的產生加劇炎癥性反應。根據RT-PCR結果分析sal可以明顯減少TNF-α、IL-1β、CD14及iNOS的表達,發揮抗炎作用。

綜上所述,sal通過激活PI3K/Akt信號通路,抑制TNF-α、IL-1β、CD14、iNOS等炎癥因子的表達,促進Akt蛋白的磷酸化,減少核蛋白NF-κB表達,從而發揮抗炎作用,為sal治療神經系統炎癥奠定基礎。