二甲雙胍通過miR-129-5p緩解膿毒癥相關肺損傷

袁 媛, 劉金虹, 袁江漢, 周發春

(1.重慶醫科大學附屬第一醫院重癥醫學科,重慶 400016;2.天津市寶坻區人民醫院藥劑科,天津醫科大學寶坻臨床學院,天津 301800)

膿毒癥是由宿主對感染反應失調所引起的危及生命的器官功能障礙,其死亡率可高達25%～30%[1]。膿毒癥發病機制極其復雜,包括炎癥失衡、免疫功能障礙、細胞自噬等[2]。膿毒癥伴隨的多器官功能障礙是重癥患者死亡的重要原因。盡管目前膿毒癥治療已取得較大進展,但膿毒癥合并急性肺損傷(acute lung injury, ALI)患者的死亡率仍高達30%～40%[3],遠遠高于其他有ALI因素的患者。促炎和抗炎細胞因子的相互作用和隨后的級聯激活引起的全身炎癥反應失衡被認為是ALI發病的關鍵。失衡的炎癥反應,導致膿毒癥相關肺損傷,血管通透性增加,肺組織水腫、結構破壞,從而引發功能障礙[4]。因此,研究膿毒癥相關肺損傷中有效的抗炎藥物治療具有重要意義。

MET因具有安全性高、價格低廉以及出色的降糖能力,被推薦為2型糖尿病( type 2 diabetes mellitus, T2DM)治療的首選用藥。除了降糖作用外,二甲雙胍還被證實具有抑炎作用。MET還可通過激活磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K)/蛋白激酶(B protein kinase B, AKT)通路,抑制膿毒癥大鼠體內炎癥反應,減少神經元細胞凋亡達到腦保護作用[5]。

微小RNA(microRNAs, miRNA)是一類重要的非編碼小RNA,在多種疾病的發生發展過程中扮演重要角色。miRNA已被證實參與膿毒癥調控,miR-129-5p作為miRNA一員被證實可減輕過氧化氫誘導的細胞自噬和凋亡[6]。在膿毒癥小鼠模型中,miR-129-5p還可通過調節肺表面活性蛋白D(surfactant protein D, Sp-D)表達減輕膿毒癥引起的急性腸道功能損傷[7]。二甲雙胍已被證實可通過調節miRNA表達,起到器官功能保護作用,在糖尿病視網膜血管病變中,MET可通過與miRNA的結合減緩疾病進展,并可通過調節miR-138-5p表達,參與炎癥調控,緩解肺損傷[8]。然而,MET在膿毒癥相關肺損傷中的作用是否與miR-129-5p相關尚未報道,本研究擬通過觀察MET對膿毒癥中miR-129-5p水平、炎性因子表達和肺損傷的影響,來初步判斷MET和miR-129-5p的關系及可能機制研究。

1 材料與方法

1.1 主要材料小鼠肺泡巨噬細胞(mouse alveolar macrophages, MHS)購于美國ATCC公司,LPS(Sigma, 美國),MET(麥克林,上海),Lipofectamine 6000促轉劑、CCK-8試劑盒、RIPA裂解液、BCA試劑盒(碧云天,中國),miR-129-5p模擬物(mimic)、抑制劑(inhibitor)和陰性對照(NC)由上海吉瑪公司構建,SPF級雄性C57BL/6小鼠,購于重慶醫科大學實驗動物中心,TRIzol試劑 (Ambion, 美國),cDNA 逆轉錄試劑盒(Accurate, 中國) ,SYBR Green Master Mix (TaKaRa, 日本),ELISA檢測試劑盒(Thermo,美國),PI3K抗體(48184)、p-PI3K(12057)、AKT抗體(33224)以及p-AKT(13357)抗體均購自(SAB,美國)、流式細胞儀(Becton-Dickinson, 美國)、Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒(碧云天,中國)。

1.2 細胞復蘇與造模MHS細胞加入培養基,置于孵箱培育。分3組:對照組,無LPS及MET處理;LPS組,加入LPS(100 μg·L-1);LPS+MET組,加入MET,培育2 h后,加入LPS,繼續培育。

1.3 細胞轉染以2×105個細胞/孔的密度將細胞接種于6孔板, 孵箱中培育,當細胞增殖達70%～80% 時,使用促轉劑轉染,孵育48 h, 收集用于后續實驗。

1.4 CCK-8檢測以3×104個細胞/孔的密度將細胞接種于96孔板,24 h后,將細胞與不同濃度(1、2、3、4、5、6 μmol·L-1)MET一起孵育2 h,然后用或不用LPS繼續處理6 h,最后在每孔中加入CCK-8溶液,孵育2 h,450 nm處測量A值。計算細胞存活率。

1.5 流式細胞術以4×105個細胞/孔的密度將細胞接種于6孔板,貼壁24 h后,加入MET(4 μmol·L-1)孵育,2 h后加入LPS繼續處理6 h。干預結束后,同時收集培養基中懸浮細胞及貼壁細胞,其中貼壁細胞以0.25%胰酶(不含EDTA)消化變圓則終止。1 000 r·min-1離心5 min,洗滌2次,以500 μL Annexin V-PI結合液調至濃度1×109L-1單細胞懸液,加入5 μL Annexin V-FITC,混勻,后加入10 μL PI染色液混勻,室溫避光孵育20 min,冰浴上機待用。

1.6 動物和造模SPF級雄性C57BL/6J小鼠60只(鼠齡6～8周,體質量為18～23 g),動物使用許可證號:SCXK-(渝)2018-0003。小鼠隨機分為3組(n=20)。盲腸結扎穿孔(Cecal ligation and puncture,CLP)手術組[9]:小鼠戊巴比妥鈉(40 mg·kg-1)腹腔注射麻醉,剃毛,消毒,沿腹中線垂直切開,找到盲腸,在其末端1/3處結扎,2 mm三棱針穿刺盲腸末端2孔,后還納。假手術(Sham)組:不進行盲腸結扎穿孔;CLP+MET組:術前給予小鼠MET(200 mg·kg-1)腹腔內注射,30 min后進行造模。3組小鼠術后均進行常規復蘇。

1.7 動物取材造模成功24 h后行動物取材,小鼠麻醉,眼球取血,離心取上清,采血后脫頸處死小鼠,手術分離肺組織,洗凈吸干水分,多聚甲醛固定。

1.8 肺組織HE染色固定備用的肺組織,經乙醇梯度脫水,常規石蠟包埋切片,病理HE染色后,在低倍鏡下觀察各組小鼠肺組織的病理變化。

1.9 肺組織濕干比(W/D)左肺洗凈后用濾紙吸干,稱量濕重。然后置于80 ℃烤箱48 h至恒重后再次稱量干重,計算W/D值。

1.10 RT-qPCR檢測TRIzol法從肺組織和細胞中分離總RNA,cDNA逆轉錄。使用SYBR Green Master Mix在實時PCR系統上進行RT-qPCR,U6為內參,反應體系10 μL,擴增條件為:95 ℃預變性30 s,然后95℃變性5 s,60 ℃退火20 s,共40個循環。miRNA-129-5p引物序列為: 5′-GCGGTCTGGGC-3′(前引物),3′-CGGGTCTGGCG-5′(后引物)。每個樣本設置3個復孔。利用2-ΔΔCT公式計算miR-129-5p的表達水平。

1.11 ELISA實驗酶聯免疫吸附法(ELISA)測定細胞及小鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-1β含量,實驗步驟嚴格按ELISA檢測試劑盒說明操作。測450 nm處A值,做標準曲線,根據標準曲線方程計算濃度。

1.12 Western blot檢測RIPA裂解液裂解肺組織和細胞,離心,取上清,BCA法檢測蛋白濃度。加入蛋白上樣緩沖液,100 ℃孵育使蛋白變性,電泳、轉膜,室溫下封閉膜1.5 h后。加入配好的一抗,4 ℃孵育搖床過夜,TBST反復洗滌3次。然后將膜與二抗室溫下孵育1 h后,洗膜,顯影,ImageJ軟件通過灰度掃描分析蛋白質印跡結果。

2 結果

2.1 MET可增強細胞活力LPS處理后,MHS細胞的活力明顯降低,不同濃度MET處理(1、2、3、4、5、6 μmol·L-1)后的細胞活力沒有明顯變化。然而,MET干預后LPS誘導的細胞模型其活力不同程度增強,以4 μmol·L-1時最明顯。

2.2 MET下調LPS誘導的促炎因子表達LPS可以刺激巨噬細胞產生促炎因子,誘發炎癥反應。將MHS細胞暴露于LPS,IL-6、TNF-α和IL-1β的表達增加,以6 h時最明顯(Fig 2)。然而,這些促炎因子在MET干預后被明顯抑制。

2.3 MET可抑制LPS誘導的細胞凋亡LPS干預后可見細胞凋亡明顯增加,而MET(4 μmol·L-1)干預后可逆轉LPS誘導的細胞凋亡。

2.4 MET可逆轉LPS所致的miR-129-5p低表達檢測發現LPS誘導的MHS細胞miR-129-5p的表達降低,以6h降低最明顯。而MET干預后細胞內miR-129-5p的表達可顯著升高。

2.5 下調miR-129-5p逆轉MET在細胞中的抗炎及細胞保護作用miRNA在膿毒癥的發生發展中起著重要作用,課題組前期研究發現,miR-129-5p在膿毒癥患者體內表達呈低水平[10]。為了進一步驗證,分別轉染miR-129-5p mimic和inhibitor。如Fig 5A所示,轉染后,miR-129-5p的表達顯著升高或降低,表明轉染成功。同時miR-129-5p inhibitor可促進LPS誘導的TNF-α、IL-6、IL-1β的表達,miR-129-5p mimic則下調促炎因子的表達。且miR-129-5p inhibitor可逆轉MET的抗炎效應。同樣,miR-129-5p水平可影響細胞活力,抑制miR-129-5p可逆轉MET對細胞的保護作用。

2.6 MET可上調LPS干預后的PI3K/AKT信號通路各蛋白的水平如Fig 6所示,敲低miR-129-5p時,p-PI3K、p-AKT的蛋白水平下調。MET干預后p-PI3K、p-AKT的蛋白水平升高。而下調miR-129-5p的表達可逆轉MET對PI3K、AKT的磷酸化。

Fig 1 Viability of MHS cells after MET

Fig 2 LPS-induced inflammatory response down-regulated by

Fig 3 Cell apoptosis after MET **P<0.01 vs Control group; ##P<0.01 vs LPS group.

Fig 4 Expression of miR-129-5p after MET

Fig 5 Anti-inflammatory and cytoprotective effects of MET reversed by inhibition of

2.7 MET可減輕膿毒癥相關肺損傷,提高小鼠存活率如Fig 7A所示,MET可明顯提高小鼠存活率,并減輕其肺水腫。HE染色根據Smith評分進行炎癥結果判讀[11],發現Sham組組織結構清晰,肺泡及肺間質未見滲出,無明顯炎癥細胞浸潤;CLP組組織結構不清,肺泡及間質內大量滲出,伴較多炎癥細胞浸潤;MET干預后,肺泡及肺間質滲出及炎性細胞浸潤程度較CLP組明顯減輕。

2.8 MET可減輕體內膿毒癥誘導的炎癥反應,上調miR-129-5p的表達CLP小鼠中IL-6、TNF-α和IL-1β的水平上調,miR-129-5p呈低表達。而MET干預后,促炎細胞因子被明顯抑制,miR-129-5p水平明顯上調。

2.9 MET可上調CLP小鼠體內PI3K/AKT信號通路各蛋白的水平與體外結果相似,CLP組PI3K、AKT蛋白磷酸化水平降低,與CLP組相比,CLP+Met組p-PI3K、p-AKT蛋白的水平顯著增加。

3 討論

膿毒癥具有高發病率、高死亡率及進展迅速等特點,其本質是由感染引起的免疫反應失衡,導致的多器官功能障礙。膿毒癥相關ALI發生率高達40%,臨床表現為呼吸窘迫及進行性、頑固性低氧血癥,其病理特征為肺上皮及血管內皮細胞的受損及大量炎性細胞的浸潤[12]。

MET可增強胰島素敏感性,研究表明,在LPS誘導的膿毒癥中,MET通過抑制心肌Toll樣受體4(Toll-like recetor 4, TLR 4)活性,發揮心臟保護作用,并可緩解膿毒癥所致的肺損傷,其機制可能是通過抑制炎癥反應、氧化應激和細胞凋亡而實現[13]。我們的研究結果提示,MET可以在體內外模型中下調膿毒癥中促炎因子的水平,起到器官功能保護作用。

miR-129-5p作為非編碼RNA的一員,與多種正常或異常的病理生理過程密切相關。據報道,miR-129-5p在膿毒癥小鼠中低表達,通過調控miR-129-5p水平,可抑制炎癥反應,減輕肺損傷[14]。本課題前期研究發現,在膿毒癥患者血清中,miR-129-5p水平顯著下調,提示其可能參與調控膿毒癥進程。在本研究中,我們發現LPS干預后細胞內miR-129-5p的表達水平降低,TNF-α、IL-6、IL-1β水平呈高表達伴隨細胞活力降低及凋亡增加。通過MET干預后細胞miR-129-5p表達增加,炎癥因子水平下調,細胞活力增強。但敲低miR-129-5p可逆轉MET的積極作用。為了進一步驗證,我們建立了膿毒癥小鼠模型,發現CLP組小鼠肺組織充血水腫明顯并大量炎性細胞浸潤。且miR-129-5p的表達較對照組下調,伴隨TNF-α、IL-6、IL-1β水平增高。MET干預則可減輕肺水腫及炎性細胞浸潤,并下調促炎因子的表達。從而起到肺保護作用,提高小鼠存活率。PI3K/AKT信號通路在膿毒癥中起關鍵作用[15],PIK3激活導致AKT磷酸化,促進細胞抵抗炎癥和氧化應激誘導的損傷。通過Western blot檢測發現,LPS誘導細胞中p-AKT、p-PI3K蛋白表達降低,而MET干預或過表達miR-129-5p可增加p-AKT、p-PI3K蛋白的表達水平。敲低miR-129-5p則呈現出相反的結果,且可逆轉MET的作用。同樣,在小鼠模型中,MET干預可上調AKT、PI3K蛋白磷酸化水平。上述結果表明,miR-129-5p在膿毒癥的發生、發展過程中發揮重要作用,且MET可能通過上調miR-129-5p的表達,激活PI3K/AKT通路,調控膿毒癥炎癥反應,減少細胞凋亡,緩解肺損傷。

Fig 6 Effect of MET on expression of PI3K, p-PI3K, AKT and

Fig 7 Effects of MET on survival rate and lung injury in sepsis

Fig 8 Effects of MET on expression of IL-1β, IL-6, TNF-α and miR-129-5p in serum of sepsis

Fig 9 Effect of PI3K, p-PI3K, AKT and p-AKT in lung tissue of septic mice after MET

綜上,MET可能通過激活miR-129-5p/PI3K/AKT軸來抑制炎癥反應,減少細胞凋亡,減輕膿毒癥相關肺損傷。