吸入胰島素通過NLRP3炎癥小體改善散發性阿爾茨海默病小鼠的認知功能

陶舒琪,范雯媛,鄭昊寧,王 通,陳燕春,周 進,丁小娣,周風華,郭章玉

(1. 濰坊醫學院基礎醫學院臨床病理系,2. 山東省神經疾病與再生修復重點實驗室,山東 濰坊 261053;3. 濰坊市人民醫院神經外科,山東 濰坊 261000;濰坊醫學院 4.基礎醫學院組織學與胚胎學教研室、5.藥學院,山東 濰坊 261053)

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)作為最常見的神經退行性病變,其病因及發病機制尚未完全闡明。近年來研究發現,持續過度的炎癥反應在AD等退行性疾病發病機制中發揮著至關重要的作用[1-2]。而小膠質細胞作為腦內的免疫效應細胞,是神經炎癥最重要的介導者[3]。活化的小膠質細胞產生各種細胞因子導致神經元變性甚至死亡[2]。NLRP3炎癥小體作為中樞神經系統最具特征的炎性小體,在小膠質細胞的表達量最高,并與AD的炎癥反應有密切關系[4-5]。因此,作為炎癥反應的重要參與者,靶向NLRP3炎癥小體可能為AD治療開辟新的途徑。

研究表明,吸入胰島素可以改善輕度認知功能障礙和AD患者的認知功能[6]。課題組前期研究也發現,吸入胰島素可以改善APP/PS1轉基因小鼠的學習和記憶能力[7],但這種保護作用的具體機制仍有待闡明。本研究采用鏈脲佐菌素(streptozotocin, STZ)側腦室注射的散發性AD(sporadic AD, sAD)小鼠模型以及脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)刺激BV2細胞活化的神經炎癥模型,探討胰島素對sAD小鼠模型認知功能以及小膠質細胞內NLRP3炎癥通路的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及細胞36只SPF級C57BL/6 J雄性小鼠,12周齡,體質量(24～28) g,購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司,動物許可證編號:SCXK(魯)2019-0003。飼養于恒溫恒濕環境,并維持12 h明/暗周期,自由飲水與攝食。實驗過程均符合動物倫理要求。BV2細胞來源于C57BL/6 J小鼠小膠質細胞,由美國哈佛大學王欣實驗室饋贈。

1.2 主要試劑與儀器STZ(Sigma, S0130)、LPS(Solarbio, L8880)、DMEM高糖培養基(HyClone公司)、FBS(Gibco公司)、CD11b抗體(Cell Signaling Technology, 49420)、 Iba1抗體(Wako公司, 016-20001)、GFAP抗體(Cell Signaling Technology, 80788)、NLRP3抗體(Proteintech, 19771-1-AP)、ASC抗體(Proteintech,10500-1-AP)、Caspase-1抗體(Proteintech,22915-1-AP)、IL-1β抗體(Proteintech, 16806-1-AP)、HRP 標記的二抗(Proteintech)、Alexa fluor 488(Jackson ImmunoResearch Laboratoris)、腦立體定位儀(深圳瑞沃德)、Morris水迷宮(Panlab)、 冰凍切片機(Leica)、激光共聚焦顯微鏡(Leica)。

1.3 方法

1.3.1實驗小鼠分組及處理 小鼠隨機分為3組:對照組(Con),模型組(STZ-NS)和胰島素治療組(STZ-INS),每組12只。按參考文獻[8]方法建立sAD小鼠模型。小鼠給予戊巴比妥鈉(40 mg·kg-1)腹腔注射,頭部固定于腦立體定位儀,暴露前囟,于前囟后0.3 mm,正中線右側1.0 mm,距腦表面深度2.5 mm處,向右側側腦室緩慢注入3 μL STZ或等體積生理鹽水,注射時間5 min,留針3 min,緩慢退針,消毒并縫合傷口。小鼠行STZ注射2周后,治療組經鼻吸入胰島素0.87 U·d-1,對照組和模型組吸入同體積生理鹽水,給藥4周后進行水迷宮實驗。

1.3.2細胞培養及處理 按照參考文獻[9]方法培養BV2細胞,將生長至對數期的BV2細胞以合適密度接種于6孔板。以不同濃度的胰島素(0、1、10、100、500、1 000 nmol·L-1)預處理各組細胞1 h,然后給予LPS(1 mg·L-1)刺激BV2細胞,對照組給予正常培養基,24 h后收集細胞。所有細胞置于37 ℃、5% CO2培養箱孵育。

1.3.3水迷宮實驗(Morris water maze,MWM) 給藥4周后,采用MWM實驗評價各組小鼠的空間學習與參考記憶能力。水迷宮水池直徑1.2 m,平均分為4個象限,10 cm的平臺隨機固定于其中1個象限。前4 d,每只小鼠面向池壁從4個不同的入水點入水,記錄小鼠60 s內找到水下平臺的時間(逃避潛伏期)。第5天,移走平臺。將小鼠從原平臺象限的對側放入水中。記錄其在60 s內在原平臺象限時間和進入該象限次數。

1.3.4免疫熒光 行為學結束后,小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉 (40 mg·kg-1) 麻醉,心臟灌注后取腦,取出腦組織依次進行后固定及蔗糖梯度脫水沉底后,OCT包埋行冰凍切片。取切片室溫下晾片2 h,PBS清洗3次,3%Triton X-100 37 ℃孵育15 min,PBS清洗。10%羊血清封閉后滴加一抗Iba 1 (1 ∶100) ,4 ℃孵育過夜。PBS清洗后滴加Alexafluor 488標記的熒光二抗,室溫孵育1 h。滴加DAPI染核,封片后于激光共聚焦顯微鏡下掃描觀察。

1.3.5Western blot檢測 提取各組小鼠海馬組織、BV2細胞蛋白,BCA法檢測蛋白濃度。根據分子量大小配制不同濃度凝膠,經SDS-PAGE電泳后進行轉膜,后用5%脫脂牛奶封閉2 h。孵育一抗GFAP(1 ∶5 000)、CD11b(1 ∶1 000)、NLRP3(1 ∶1 000)、ASC(1 ∶1 000)、Caspase-1(1 ∶1 000)、IL-1β(1 ∶1 000)及GAPDH(1 ∶5 000),4 ℃過夜。HRP標記的二抗(1 ∶5 000)室溫孵育2 h,滴加ECL顯影液,采用化學發光成像系統Chemi DocTM顯影。

2 結果

2.1 胰島素對sAD小鼠認知功能的影響水迷宮結果顯示,小鼠的游泳速度無明顯差異(Fig 1A),表明胰島素對小鼠的運動能力沒有明顯影響。3組小鼠的逃避潛伏期隨天數變化逐漸縮短,并且模型組小鼠的逃避潛伏期較對照組明顯延長,提示這些小鼠的學習能力受損(Fig 1B)。而治療組與對照組相比沒有明顯差異,表明吸入胰島素對sAD小鼠的學習能力有一定的改善作用(Fig 1B)。此外,模型組小鼠在原平臺象限的時間和穿越原平臺次數明顯減少(Fig 1C,D),提示這些小鼠的空間記憶能力受損。吸入胰島素能夠明顯增加sAD小鼠的停留時間和穿越次數(Fig 1C,D),表明吸入胰島素可以改善sAD小鼠的空間記憶損害。

2.2 吸入胰島素對小鼠海馬CD11b和GFAP蛋白表達水平的影響為了研究吸入胰島素對ICV-STZ小鼠腦內神經炎癥的影響,我們用Western blot檢測了CD11b(小膠質細胞的標記物)和GFAP(星形膠質細胞標記物)的表達水平。結果顯示,與對照組相比,模型組小鼠海馬內CD11b和GFAP表達明顯升高,而胰島素治療可以降低CD11b和GFAP表達水平(Fig 2)。

2.3 吸入胰島素對小鼠海馬小膠質細胞活化的影響為了研究胰島素對sAD小鼠腦內小膠質細胞活化的影響,我們采用免疫熒光實驗檢測了海馬CA1、CA3及DG區Iba1的表達。結果顯示,與對照組相比,模型組小鼠海馬CA1、CA3及DG區小膠質細胞數量明顯增加,而吸入胰島素能夠明顯降低模型組小鼠海馬各區小膠質細胞數量(Fig 3A-D)。

Fig 2 Effect of intranasal insulin on expression of CD11b and GFAP in hippocampus of mice

2.4 吸入胰島素對小鼠海馬NLRP3炎癥小體通路相關蛋白表達的影響為了研究吸入胰島素對sAD小鼠海馬NLRP3炎癥小體通路相關蛋白表達的影響,我們用Western blot檢測了NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β的表達。結果顯示,與對照組相比,模型組小鼠海馬內NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β表達升高(Fig 4)。吸入胰島素能夠顯著降低NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β表達水平(Fig 4)。

Fig 4 Effect of intranasal insulin on expression of NLRP3 inflammasome pathway related proteins in hippocampus of mice

2.5 胰島素對BV2細胞NLRP3炎癥小體通路相關蛋白表達的影響為了在體外實驗進一步驗證胰島素對小膠質細胞NLRP3炎癥小體的影響,我們以LPS刺激BV2細胞使其活化誘導神經炎癥模型,觀察不同濃度胰島素預處理對活化的BV2細胞內NLRP3炎癥小體通路相關蛋白表達的影響。Western blot結果顯示,與對照組相比,LPS刺激后,BV2細胞內NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β表達明顯升高,而胰島素(100 nmol·L-1)處理組可顯著降低BV2細胞內NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β表達水平(Fig 5)。

3 討論

研究發現,AD患者腦內胰島素信號通路調節異常[10]。因此,靶向胰島素信號通路治療AD成為近年來的研究熱點[11]。本實驗采用的吸入給藥方式,可以使胰島素通過嗅黏膜直接進入腦脊液,而對外周血糖和胰島素水平幾乎沒有影響[6]。盡管已有臨床實驗證實,吸入胰島素對AD患者認知功能的保護作用,但潛在的具體機制仍不清楚。本研究采用的ICV-STZ小鼠模型可表現為認知功能受損和AD樣的病理改變,如神經炎癥、腦代謝降低、胰島素抵抗和tau蛋白過度磷酸化等,被認為是研究散發性AD發病機制及藥物研發的重要動物模型之一[8]。我們的研究結果表明,ICV-STZ小鼠出現了學習能力和空間記憶損害;而吸入胰島素后,ICV-STZ小鼠學習能力和空間記憶損害得到明顯改善。我們前期發現吸入胰島素也可以改善 APP/PS1轉基因小鼠模型的認知功能[7],這也更加證明了胰島素具有改善AD認知功能的保護作用。

Fig 5 Effect of insulin on expression of NLRP3 inflammasome pathway related proteins in BV2 cells

越來越多的研究表明,神經炎癥在AD的發生發展過程中起著至關重要的作用。小膠質細胞和星形膠質細胞作為神經炎癥重要的介導者,其活化和增生在AD病理發展進程中早于Aβ和神經原纖維纏結形成[12]。本實驗發現,ICV-STZ小鼠腦內GFAP、CD11b和Iba1表達明顯升高,說明STZ注射可導致小鼠腦內星形膠質細胞增生和小膠質細胞過度激活,而吸入胰島素可以明顯降低GFAP、CD11b和Iba1表達水平。這些結果表明,吸入胰島素可有效抑制ICV-STZ小鼠腦內星形膠質細胞和小膠質細胞介導的神經炎癥。

NLRP3炎癥小體是由核苷酸結合寡聚化結構域樣受體3(NLRP3)、凋亡相關斑點樣蛋白(ASC)和半胱氨酸蛋白酶Caspase-1前體蛋白組成的大分子多蛋白復合體。損傷、刺激(如Aβ)等因素可以誘導NLRP3 結合ASC并招募 pro-caspase-1形成復合體。并依次活化Caspase-1和IL-1β,引發神經炎癥級聯反應,導致神經元死亡。NLRP3炎癥小體激活在小膠質細胞激活中發揮核心作用。研究發現,NLRP3炎癥小體可調控海馬小膠質細胞表型轉化從而參與小膠質細胞活化[13]。NLRP3炎癥小體在Aβ 誘導的小膠質細胞增生和Aβ 病理中的重要作用已明確[14-15]。最近又有研究者發現,NLRP3炎癥小體通路在tau轉基因小鼠內源性和外源性tau病理播散過程中發揮重要作用[16]。由此可見,NLRP3炎癥小體在AD相關神經炎癥的發展過程中發揮著至關重要的作用。我們的研究發現ICV-STZ小鼠海馬NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β 表達明顯升高,表明STZ可以使小鼠腦內NLRP3炎癥小體激活。而吸入胰島素可以明顯降低NLRP3炎癥小體通路相關蛋白表達水平,表明吸入胰島素可抑制ICV-STZ小鼠腦內NLRP3炎癥小體激活。研究表明,小膠質細胞的過度激活在認知障礙的發生發展中扮演重要角色,而NLRP3炎癥小體激活在小膠質細胞活化中發揮核心作用[12]。因此,我們推測胰島素可能是通過減輕NLRP3炎癥小體介導的神經炎癥改善散發性AD小鼠的認知功能。

Spielman等[17]為了觀察胰島素是否具有抗炎作用,將人膠質瘤來源的小膠質細胞加入IL-6, TNF-α和IL-1β的混合物,使用不同濃度的胰島素處理發現,低濃度的胰島素可表現為促炎作用;而高濃度的胰島素表現為抗炎作用。而另一項研究發現胰島素可顯著減少LPS刺激的BV2細胞內NO,ROS、TNF-α和誘導性一氧化氮合酶(iNOS)的產生,并增加BV2細胞的吞噬活性[18]。因此,為了進一步明確胰島素對小膠質細胞炎性改變的作用尤其是NLRP3炎癥小體的影響,我們以LPS刺激BV2細胞使其活化誘導神經炎癥模型,觀察胰島素預處理對活化的BV2細胞內NLRP3炎癥小體通路相關蛋白表達的影響。結果顯示,與對照組相比,LPS刺激后,BV2細胞內NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β表達明顯升高,而胰島素(100 nmol·L-1)處理組BV2細胞內NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β表達明顯降低。而胰島素濃度再提高時,對炎癥小體相關蛋白的抑制作用減弱,這種現象可能是由于胰島素受體(INSR)結合位點變得飽和,反過來可能導致受體位點之間的負協同效應。以上結果表明,適量濃度胰島素可發揮抗炎作用。小膠質細胞可以表達胰島素受體以及胰島素樣生長因子1受體,胰島素與相關受體結合后激活下游信號通路從而發揮神經保護作用[11], 但胰島素影響NLRP3炎癥小體通路的具體機制仍需進一步研究。

綜上所述,STZ可以導致小鼠認知功能下降,機制可能與NLRP3炎癥小體介導的神經炎癥有關。而胰島素能夠減輕NLRP3炎癥小體介導的神經炎癥,從而發揮神經保護作用,改善散發性AD小鼠的認知功能損害。本研究從神經炎癥這一新的角度闡明胰島素在AD治療中的作用及機制,為AD治療提供了理論依據。