枸杞糖肽通過抑制鐵死亡減輕高血糖大鼠腦缺血/再灌注損傷

李 鵬,楊 晶,馬艷梅,張建忠,景 麗

(寧夏醫(yī)科大學 1. 基礎醫(yī)學院病理學系、2. 總醫(yī)院放射科,寧夏 銀川 750004)

高血糖是急性缺血性卒中(acute ischemic stroke,AIS)的獨立危險因素[1]。與正常血糖水平患者相比,高血糖對卒中患者的影響體現(xiàn)在疾病診療的全過程,包括更嚴重的臨床表現(xiàn)、更廣泛的梗死面積和更高的病死率、致殘率及復發(fā)率[2]。研究高血糖狀態(tài)下腦缺血/再灌注損傷(cerebral ischemia/reperfusion injury,CIRI)的發(fā)病機制及其有效的防治策略對于合并高血糖AIS患者的綜合管理具有重要意義。近年來,越來越多的研究發(fā)現(xiàn),鐵死亡在CIRI中發(fā)揮重要作用,抑制鐵死亡可能減輕CIRI[3-4]。

枸杞具有抗氧化應激、抗炎、抗腫瘤、抗衰老、免疫調節(jié),以及保護心腦血管疾病等作用[5]。枸杞糖肽(Lyciumbarbarumglycopeptide,LbGp)是從枸杞多糖中進一步分離出的一種具有免疫活性的糖綴合物,包含5種組分,其分子量為88 ku。研究顯示,枸杞多糖通過提高超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶的活力,降低丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量,進而抑制氧化應激發(fā)揮CIRI后的腦保護作用[6]。由于鐵死亡是由氧化應激誘導的一種獨特的程序性細胞死亡形式,我們推測LbGp可能具有調控鐵死亡的作用。然而,LbGp是否能夠通過抑制鐵死亡減輕高血糖狀態(tài)下的CIRI,目前尚不清楚。因此,本研究采用線栓法建立體內慢性高血糖大鼠左側短暫性大腦中動脈栓塞再灌注(transient middle cerebral artery occlusion/reperfusion,tMCAO/R)模型,模擬臨床高血糖狀態(tài)下AIS患者機械取栓手術后的腦缺血/再灌注病理生理過程,并使用鐵死亡抑制劑去鐵酮(deferiprone,DFP)作為陽性對照藥物,探討LbGp是否通過調控鐵死亡的相關靶點抑制鐵死亡,減輕高血糖大鼠CIRI,以期為高血糖狀態(tài)下CIRI的診治提供新的思路和方向。

1 材料與方法

1.1 實驗動物SD大鼠,♂,體質量(240～270) g,購自寧夏醫(yī)科大學實驗動物中心[生產(chǎn)許可證號:SCXK(寧)2020-0001]。大鼠飼養(yǎng)于實驗動物中心SPF級動物房,室溫(21～23) ℃,12 h/12 h光/暗交替,自由獲取水和食物。本研究所有實驗操作均經(jīng)寧夏醫(yī)科大學實驗動物中心實驗動物福利倫理委員會批準(編號:IACUC-NYLAC-2021-047)。

1.2 主要試劑與儀器LbGp粉末(中寧枸杞院士工作站寧夏天仁枸杞生物科技股份有限公司);去鐵酮片(Apotex Inc., Etobicoke site);組織鐵測定試劑盒(貨號:A039-2-1),購自南京建成生物工程研究所;還原型谷胱甘肽(reduced glutathione,GSH)和氧化型谷胱甘肽(oxidized glutathione disulfide,GSSG)檢測試劑盒、總SOD活性檢測試劑盒、脂質氧化(MDA)檢測試劑盒、總抗氧化能力(total antioxidant capacity,T-AOC)檢測試劑盒(貨號分別為S0053、S0101S、S0131S、S0121),均購自上海碧云天生物技術有限公司;轉鐵蛋白受體1(transferrin receptor 1,TFR1)抗體(貨號:TA5343),購自Abmart;二價金屬離子轉運體1(divalent metal transporter 1,DMT1)抗體、膜鐵轉運蛋白1(ferroportin 1,FPN1)抗體(貨號分別為20507-1-AP、26601-1-AP),均購自Proteintech公司;脂酰輔酶A合成酶長鏈家族成員4(acyl-CoA synthetase long-chain family member 4,ACSL4)抗體、二抗(貨號分別為ab155282、ab6721),均購自Abcam公司;谷胱甘肽過氧化物酶4(glutathione peroxidase 4,GPX4)抗體(貨號:NBP2-75511),購自Novus;β-actin抗體(貨號:#4970S),購自Cell Signaling Technology公司。大鼠專用線栓(北京西濃科技有限公司);Amersham Imager 600化學發(fā)光成像系統(tǒng)、Signa Architet 3.0T MRI掃描儀(美國通用電氣公司);石蠟切片機(德國Leica公司);光學及熒光顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.3 大鼠高血糖模型的建立各組大鼠置于籠盒中預適應3 d,禁食12 h,稱體質量,以60 mg·kg-1腹腔注射冰上現(xiàn)配的含鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)的檸檬酸緩沖液,之后放回籠盒,自由進食和飲水。分別于3 d、7 d后,取大鼠尾靜脈血,檢測血糖值,以血糖值 >16.8 mmol·L-1為建立高血糖模型成功。

1.4 大鼠tMCAO/R模型的建立建立經(jīng)左側頸外動脈(external carotid artery,ECA)—頸內動脈(internal carotid artery,ICA)—大腦中動脈(middle cerebral artery,MCA)途徑的tMCAO/R模型。首先,腹腔注射1%戊巴比妥鈉(40 mg·kg-1)麻醉大鼠,麻醉后大鼠仰臥位固定;然后,頸部正中線略偏左側行手術切口,依次鈍性分離并暴露左側頸總動脈(common carotid artery,CCA)、ICA和ECA,用小型動脈夾暫時夾閉CCA遠端和ICA近端,在ECA兩結之間用眼科剪剪一小口,并將適合體質量的線栓緩慢插入ECA,后經(jīng)ICA入顱至MCA開口處,固定線栓;最后,在缺血30 min后將線栓輕輕拔出,確保拔出的線栓頭部完整,結扎ECA,消毒并逐層縫合皮膚。假手術組除不插栓線外,其余步驟同tMCAO/R模型。

1.5 動物分組與給藥大鼠隨機分為高血糖假手術組(Sham,n=6)、高血糖tMCAO/R組(HG,n=8)、高血糖枸杞糖肽預處理tMCAO/R組(LbGp,n=8)、高血糖去鐵酮陽性藥物對照tMCAO/R組(DFP,n=8)。每組各有3只大鼠用于Western blot實驗。本研究LbGp和DFP的給藥時間點選擇在注射STZ后的第8天,以更真實地模擬臨床實際,大鼠每天灌胃1次,連續(xù)灌胃3周。每次灌胃前,將LbGp和DFP充分溶于大鼠無菌飲用水中。參照文獻及預實驗,LbGp的給藥劑量為20 mg·kg-1·d-1[7],DFP的給藥劑量為75 mg·kg-1·d-1[8]。

1.6 神經(jīng)功能缺損評分采用改良的神經(jīng)功能缺損評分(modified neurological severity score,mNSS)法[9],全面評價大鼠的神經(jīng)功能缺損情況。mNSS項目主要包括運動實驗(提尾實驗和行走實驗)、感覺實驗(本體感覺實驗和放置實驗)、平衡木實驗和反射實驗4個方面。mNSS總分18分,0分為神經(jīng)功能正常,18分為神經(jīng)功能缺損最嚴重。tMCAO/R模型成功的判定標準為mNSS≥4分,且同時具備4個方面評分項目神經(jīng)功能均有缺損。

1.7 腦組織鐵含量、GSH/GSSG比值、SOD活性、T-AOC及MDA含量的檢測均使用相應試劑盒檢測,各實驗步驟均嚴格按照說明書操作。

1.8 腦梗死體積測量采用磁共振T2加權成像(T2-weighted imaging,T2WI)法和TTC染色法測定腦梗死體積,通過ImageJ軟件計算腦梗死體積百分比。T2WI檢查:大鼠麻醉后,俯臥位固定于大鼠專用頭部線圈內,行T2WI冠狀位掃描,掃描范圍包括嗅球至上段頸髓;掃描參數(shù)重復時間2 257 ms,回波時間84.6 ms,層厚2 mm,層數(shù)12,視野80 mm×80 mm,矩陣288×192;腦梗死區(qū)表現(xiàn)為異常高信號,正常腦實質表現(xiàn)為等信號。TTC染色:MRI檢查后麻醉處死,迅速取腦,去除嗅球和小腦,-20 ℃冷凍20 min,行冠狀面薄層切片后,放于新鮮配制的TTC溶液中,避光37 ℃孵育30 min,期間翻動2次,然后4%多聚甲醛溶液固定,過夜后拍照;TTC染色腦梗死區(qū)表現(xiàn)為白色,非梗死區(qū)表現(xiàn)為紅色。

1.9 HE染色大鼠取材后,經(jīng)固定、脫水、透明、浸蠟、包埋后制作成石蠟切片(厚約4 μm)。然后,依次經(jīng)烘烤、脫蠟和水化,蘇木精染色、鹽酸乙醇分化、伊紅染色,最后脫水、透明、封片,并于光學顯微鏡下觀察腦組織病理學形態(tài)改變。

1.10 普魯士藍染色(增強型)切片依次經(jīng)脫蠟、水化、Perls染色工作液、孵育工作液、增強工作液、復染、脫水、透明、封片后,于光學顯微鏡下觀察。

1.11 免疫組織化學(immunohistochemistry,IHC)染色切片依次經(jīng)脫蠟、水化、高壓抗原修復、阻斷內源性過氧化物酶和山羊血清封閉后,分別加入一抗TFR1、DMT1、FPN1(均1 ∶200),然后孵育二抗,最后顯色、復染、脫水、透明和封片。置于400倍光學顯微鏡下觀察,采用ImageJ軟件測量目的蛋白的平均光密度值。

1.12 Western blot檢測提取大鼠大腦缺血側皮質總蛋白,并定量、變性。以10 μL體系上樣,依次經(jīng)電泳、轉膜、封閉后,分別加入一抗TFR1(1 ∶1 000)、DMT1(1 ∶800)、FPN1(1 ∶1 000)、ACSL4(1 ∶10 000)、GPX4(1 ∶1 000)、β-actin(1 ∶1 000),然后二抗(1 ∶5 000)孵育、曝光。采用ImageJ軟件分析目的蛋白的相對表達量。

2 結果

2.1 LbGp對高血糖tMCAO/R大鼠神經(jīng)功能缺損和氧化應激損傷的影響大鼠腦缺血30 min,再灌注24 h后,Tab 1檢測結果表明,Sham組大鼠mNSS為0,HG組大鼠mNSS明顯升高(P<0.01);與HG組相比,LbGp組和DFP組大鼠mNSS均明顯降低(P<0.01)。此外,與Sham組相比,HG組大鼠GSH/GSSG比值、SOD活性和T-AOC均明顯降低(P<0.01),MDA含量明顯升高(P<0.01);與HG組相比,LbGp組和DFP組大鼠GSH/GSSG比值、SOD活性和T-AOC均明顯升高(P<0.05,P<0.01),MDA含量明顯降低(P<0.01)。

2.2 LbGp對高血糖tMCAO/R大鼠腦梗死體積的影響基于動物福利,最大化減少動物實驗數(shù)量。實驗前先選擇3只正常血糖大鼠,通過磁共振T2WI法和病理TTC染色法,觀察腦梗死范圍。結果顯示(Fig 1),T2WI法和TTC染色法測量的腦梗死體積差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),因此后續(xù)實驗選擇磁共振T2WI法測量腦梗死體積。如Fig 2所示,Sham組大鼠T2WI左右兩側大腦半球腦實質信號正常,未見異常高信號,且中線結構居中,兩側側腦室對稱、無擴張表現(xiàn);與Sham組相比,HG組、LbGp組和DFP組大鼠T2WI左側大腦半球腦實質均出現(xiàn)不同程度的異常高信號,并以HG組信號強度最高(提示血管源性腦水腫最嚴重),且HG組伴有左側腦室受壓變窄、右側腦室擴張積水及中線結構局部右偏。與HG組相比,LbGp組和DFP組腦梗死體積百分比均減小(P<0.01,P<0.05)。

2.3 LbGp對高血糖tMCAO/R大鼠腦組織病理學變化的影響如Fig 3所示,Sham組HE染色神經(jīng)元核呈圓形,核仁居中,胞質豐富,胞質著色均勻;HG組神經(jīng)元胞質染色變淺,大部分神經(jīng)元呈空泡樣改變,間質水腫明顯;LbGp組和DFP組較HG組神經(jīng)元形態(tài)改變和間質水腫程度有所緩解。與Sham組相比,HG組皮質缺血半暗帶區(qū)核固縮神經(jīng)元數(shù)量明顯增多(P<0.01);與HG組相比,LbGp組和DFP組核固縮神經(jīng)元數(shù)量均明顯減少(P<0.01,P<0.05)。

Tab 1 Effects of LbGp on mNSS, GSH/GSSG ratio, SOD activity, T-AOC and MDA contents in hyperglycemic rats

Fig 1 Comparison of T2WI and TTC staining for showing cerebral infarction volume in normoglycemic rats ( n=3)

Fig 2 Effect of LbGp on cerebral infarction volume in hyperglycemic rats n=3～5)

2.4 LbGp對高血糖tMCAO/R大鼠腦組織鐵含量及鐵代謝相關蛋白的影響普魯士藍染色結果(Fig 4A)顯示,Sham組大鼠腦皮質區(qū)可見散在分布的點片狀棕褐色染色,HG組大鼠缺血皮質區(qū)可見多發(fā)點片狀或小片狀棕褐色染色,LbGp組和DFP組缺血皮質區(qū)均未見異常的棕褐色染色。各組大鼠腦組織鐵含量測定結果(Fig 4B)顯示,與Sham組相比,HG組腦組織鐵含量明顯增加(P<0.01);與HG組相比,LbGp組和DFP組腦組織鐵含量均明顯降低(P<0.01)。

IHC結果顯示(Fig 5),與Sham組相比,HG組TFR1、DMT1表達量均明顯升高(P<0.05,P<0.01),FPN1表達量明顯下降(P<0.01);與HG組相比,LbGp組和DFP組TFR1、DMT1表達量均明顯下降(P<0.01,P<0.05),FPN1表達量均明顯升高(P<0.01)。Western blot結果顯示(Fig 6),各組TFR1、DMT1和FPN1蛋白的表達趨勢與IHC結果基本一致。

2.5 LbGp對高血糖tMCAO/R大鼠ACSL4和GPX4蛋白表達的影響Western blot檢測結果顯示(Fig 7),與Sham組相比,HG組大鼠ACSL4蛋白表達明顯升高,GPX4蛋白表達明顯降低(P<0.01);與HG組相比,LbGp組和DFP組ACSL4蛋白表達明顯降低,GPX4蛋白表達明顯升高(P<0.05,P<0.01)。

3 討論

本研究采用從ECA插線栓的路徑,能夠最大化比擬臨床機械取栓手術。結果表明,高血糖大鼠腦缺血30 min再灌注24 h出現(xiàn)了占位性腦水腫征象,而經(jīng)LbGp干預后,腦水腫程度明顯減輕。組織病理學結果也證實,LbGp能夠通過減少核固縮神經(jīng)元數(shù)量、減輕細胞及間質水腫,改善高血糖大鼠腦缺血/再灌注誘導的神經(jīng)元損傷。

氧化應激是導致AIS神經(jīng)元功能紊亂和死亡的主要誘發(fā)因素。鐵死亡作為一種由氧化應激誘導的獨特程序性細胞死亡,其特點是脂質過氧化和GSH耗竭[10]。本研究結果顯示,LbGp通過提高GSH/GSSG比值、SOD活性和T-AOC,減輕高血糖腦缺血/再灌注誘導的氧化應激損傷。正常情況下,細胞外游離的Fe3+與轉鐵蛋白(transferrin,TF)結合形成復合物,被細胞膜上的TFR1識別,并進一步形成TF-TFR1復合物。TF-TFR1內吞入細胞后,Fe3+從TF中釋放出來,被前列腺跨膜上皮3抗原抗體還原為Fe2+。隨后,Fe2+通過DMT1運輸?shù)郊毎|中的不穩(wěn)定鐵池[11]。細胞內的Fe2+可通過細胞膜上的FPN1外排輸出細胞,FPN1是目前唯一已知的鐵外排蛋白[11]。細胞內過量的Fe2+可以催化H2O2生成羥自由基,并可通過芬頓反應和鐵依賴性酶產(chǎn)生大量的活性氧,造成細胞膜的氧化損傷[12]。此外,鐵是脂氧合酶催化亞基的重要組成部分,脂氧合酶活性的增加可介導脂質過氧化[13]。因此,過量的鐵可誘導鐵死亡的發(fā)生。本研究結果提示,高血糖腦缺血/再灌注大鼠腦組織出現(xiàn)了鐵超載和鐵代謝紊亂,而LbGp能夠改善高血糖腦缺血/再灌注誘導的鐵超載和鐵代謝紊亂。為了進一步驗證鐵死亡是否參與了高血糖狀態(tài)下腦缺血/再灌注誘導的腦損傷,本研究檢測了鐵死亡的其他重要調控因子——ACSL4和GPX4。ACSL4被認為是決定鐵死亡敏感性的一個關鍵因子,其可調節(jié)多不飽和脂肪酸的合成,催化花生四烯酸或腎上腺酸酯化為磷脂酰乙醇胺[14],再經(jīng)過一系列的生化反應,氧化為親鐵性的脂質過氧化物而激活細胞發(fā)生鐵死亡[15]。研究顯示,敲除ACSL4可以減輕小鼠CIRI,而過表達ACSL4則會通過誘導鐵死亡加重CIRI[16]。GPX4作為一種含硒蛋白,在調控鐵死亡方面起著關鍵作用,它能將有毒的膜脂H2O2還原成無毒的脂質醇[17]。Hu等[18]研究顯示,β-石竹烯通過下調ACSL4的表達、上調GPX4的表達,抑制鐵死亡,從而發(fā)揮對大鼠CIRI的腦保護作用。本研究結果顯示,LbGp能夠通過抑制鐵死亡,減輕高血糖大鼠CIRI。

Fig 6 Effects of LbGp on TFR1, DMTI and FPN1 protein expressions in hyperglycemic rats n=3)

Fig 7 Effects of LbGp on protein expressions of ACSL4 and GPX4 in hyperglycemic rats n=3)

綜上所述,本研究通過建立體內CIRI動物模型,證實LbGp能夠減輕高血糖大鼠CIRI。之后通過檢測氧化應激、鐵含量和鐵代謝相關蛋白,以及ACSL4、GPX4蛋白表達等多種鐵死亡關鍵指標,證實LbGp可通過調節(jié)氧化應激、鐵穩(wěn)態(tài)和鐵死亡相關蛋白的表達,抑制高血糖大鼠腦缺血/再灌注誘導的鐵死亡。但本研究未能進一步探討LbGp抑制鐵死亡,減輕高血糖大鼠CIRI的具體作用機制,今后應從體內和體外兩個實驗水平進行深入研究。