人參皂苷Rg1通過抑制MAPK-NLRP1通路減輕2型糖尿病誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷

黃 蕾,汪燕燕,孫 冉,周慧敏,姬朋敏,孔亮亮,李衛(wèi)平,李維祖

(1.安徽醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室,2.安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科,安徽 合肥 230032)

2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)可由多種原因引起,其病理生理過程是胰島素相對(duì)分泌不足或胰島素抵抗導(dǎo)致葡萄糖利用障礙,而后期則會(huì)出現(xiàn)胰島素絕對(duì)分泌不足,從而導(dǎo)致血糖水平持續(xù)升高[1]。糖脂代謝紊亂是T2DM的重要特征,該病可以導(dǎo)致包括眼睛、腎臟、心臟和血管等多個(gè)組織器官的損害,產(chǎn)生慢性病變并逐漸加重,且該病還能引起神經(jīng)系統(tǒng)病變?nèi)缟窠?jīng)元損傷以及出現(xiàn)認(rèn)知功能障礙,增加患阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease,AD)的概率。越來越多研究表明,AD和T2DM之間有比以前認(rèn)為的更強(qiáng)的相似性[2-3],部分學(xué)者甚至將該神經(jīng)疾病理解為3型糖尿病[4]。胰島素影響著腦內(nèi)的糖代謝,其受體廣泛存在于海馬神經(jīng)元,而海馬體是邊緣系統(tǒng)調(diào)節(jié)學(xué)習(xí)、記憶、行為功能的重要組織之一,海馬結(jié)構(gòu)和功能的損傷可能影響著T2DM患者的學(xué)習(xí)記憶能力?？傮w來說,T2DM患者會(huì)增加患AD的概率,其機(jī)制可能是T2DM引起糖脂代謝障礙導(dǎo)致神經(jīng)元的炎癥和損傷,進(jìn)而引起和促進(jìn)AD的發(fā)生發(fā)展。因此,闡明T2DM導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶和神經(jīng)元損傷的機(jī)制及尋找能改善T2DM導(dǎo)致的神經(jīng)元損傷的藥物具有至關(guān)重要的意義。

人參皂苷Rg1(Rg1)能夠抗衰老、改善記憶和提高學(xué)習(xí)能力,它提取于人參,是其活性成分之一。研究發(fā)現(xiàn),Rg1能降低糖代謝,調(diào)節(jié)由胰島素誘導(dǎo)的肝糖原的生成[5]。絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPKs)由p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)、C-Jun N末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)和細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)這3個(gè)亞家族組成,在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用[6]。神經(jīng)元炎癥在神經(jīng)變性的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用,眾所周知,在機(jī)體細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)存在一種受體NLRP1,是炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵組成部分。我們前期研究發(fā)現(xiàn),Rg1通過NLRP1炎癥小體明顯減輕SAMP8小鼠的大腦受損[7]。另外,人參皂苷Rg1在不同的細(xì)胞系和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型中,通過其下調(diào)MAPK信號(hào)的能力顯示出巨大的治療潛力[8]。然而,人參皂苷Rg1通過介導(dǎo)MAPK通路治療糖尿病引起的神經(jīng)炎癥的機(jī)制尚不清楚?；诖?本研究以MAPK-NLRP1通路為切入點(diǎn),研討Rg1對(duì)高脂所致T2DM鼠的神經(jīng)細(xì)胞受損和記憶力下降的作用。

1 材料

1.1 動(dòng)物8周齡C57BL/6小鼠(雄性,18～22 g)被飼養(yǎng)在光/暗周期為12 h、溫度(22～24 ℃)和濕度(40%～70%)適宜的動(dòng)物房中,可以自由攝取食物和水。本實(shí)驗(yàn)所有程序均按照安徽醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)的規(guī)程進(jìn)行。

1.2 藥物與試劑人參皂苷Rg1(貨號(hào):DR0009)由德思特公司生產(chǎn);免疫染色封閉液(貨號(hào):P0102)、Hoechst 33258(貨號(hào):C1018)、細(xì)胞衰老β-gal染色試劑盒(貨號(hào):C0602)均由碧云天公司生產(chǎn); PrimeScript RT Master Mix(貨號(hào):RR036A)由TaKaRa公司生產(chǎn);高脂飼料(貨號(hào):XTHF45-1)由協(xié)同生物公司生產(chǎn);鏈脲霉素(貨號(hào):S8050)由索萊寶公司生產(chǎn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器CFX96 Touch PCR System(美國(guó)Bio-Rad公司);Morris water maze(上海軟隆科技公司);血糖儀(長(zhǎng)沙Sinocare公司);組織包埋機(jī)、組織脫水機(jī)、冰凍組織切片機(jī)、全自動(dòng)輪轉(zhuǎn)切片系統(tǒng)(德國(guó)萊卡公司);自動(dòng)數(shù)字玻片掃描儀(匈牙利3D HISTECH公司)。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組及造模小鼠被分為7組(n=12):空白對(duì)照(Control)組、高脂(HFD)對(duì)照組、模型(HFD+STZ)組、人參皂苷Rg1(1,5,10 mg·kg-1)組、二甲雙胍(Metformin,200 mg·kg-1)組,在進(jìn)行7 d的適應(yīng)性喂養(yǎng)后開始實(shí)驗(yàn)。在前8周里,從所有的小鼠中隨機(jī)地選擇12只小鼠作為空白對(duì)照組,給予它們正常的飲食,其他的則高脂喂養(yǎng),兩個(gè)月后從高脂飲食鼠中任意選12只為高脂組,剩下的在禁食8 h后腹腔注射110 mg·kg-1(0.1 mL·10g-1)的STZ(鏈脲霉素,溶于枸櫞酸緩沖液)溶液,空白對(duì)照組和已選出的高脂飲食組腹腔注射相同量的溶劑,72 h后,測(cè)量空腹血糖值(fast blood glucose, FBG) (測(cè)量前禁食8 h,水正常給予), 若FBG≥16.8 mmol·L-1,則說明T2DM小鼠模型制造成功,若FBG<16.8 mmol·L-1,則再次注射鏈脲霉素溶液,直到剩下的所有小鼠造模成功。將T2DM小鼠隨機(jī)分到剩下5組中,按以下要求給藥8周:Rg1(1、5、10 mg·kg-1)組和二甲雙胍組給予相應(yīng)劑量藥物,其他3組給予等量的0.5% CMC-Na溶液(0.1 mL·10 g-1,灌胃)。

2.2 造模期間體質(zhì)量和空腹血糖濃度的測(cè)定每半個(gè)月測(cè)量體質(zhì)量,造模成功后每半個(gè)月鼠尾取血檢測(cè)FBG。

2.3 Morris水迷宮(MWM)半徑和高度均為0.6 m的圓形黑水桶和頂部的視頻跟蹤系統(tǒng)組成了Morris水迷宮,里面裝有適量的水。用兩條相互垂直的線將游泳池分成4個(gè)象限,在第三象限距離水面下方2 cm處固定直徑為10 cm的圓形逃生平臺(tái)。MWM測(cè)試包括連續(xù)4日每日在固定時(shí)間進(jìn)行訓(xùn)練實(shí)驗(yàn)。在此期間,將小鼠輪流放置在四個(gè)象限且頭朝壁,讓它們1 min找到平臺(tái)并記下平均逃避潛伏期(MEL,s),若找不到就幫助其到平臺(tái)并讓它們對(duì)平臺(tái)的位置記憶10 s。第5天進(jìn)行探測(cè)實(shí)驗(yàn),移除平臺(tái),將小鼠放到第一象限,給予小鼠1 min的時(shí)間去找前4天第三象限里逃生平臺(tái)的位置,ANY-maze跟蹤軟件記錄和分析鼠在平臺(tái)位置所在象限內(nèi)的游水時(shí)長(zhǎng)(STP,s)、第一次找到并經(jīng)過原來平臺(tái)所在位置的潛伏期(LFP,s)和通過的次數(shù)(NCP)等,以評(píng)估記憶能力。

2.4 HE染色取小鼠腦組織浸泡于4%多聚甲醛中,1 d后脫水包埋并切割成5 μm的切片脫蠟水合后用蘇木精-伊紅(HE)染色技術(shù)處理,仔細(xì)觀察皮層和海馬CA1和CA3區(qū)域的病理情況并進(jìn)行比較。

2.5 β-半乳糖苷酶(β-Gal)染色取小鼠左側(cè)半腦,用 OCT包埋、冷凍,用冷凍切片機(jī)制備10 μm 腦組織切片,滴加β-Gal染色固定液蓋住組織15 min,PBS將切片稍微潤(rùn)洗后滴加數(shù)滴現(xiàn)配的染色工作液,放在避光切片盒里蓋上蓋子37 ℃孵育過夜,盒子里可裝有少量水以防止切片上的染液蒸發(fā)。第2天去染液后潤(rùn)洗并封片,使用自動(dòng)數(shù)字玻片掃描儀拍攝,評(píng)估 β-Gal 活性以指示小鼠腦衰老情況。

2.6 普魯士藍(lán)染色切片脫蠟后用普魯士藍(lán)染色液覆蓋組織,室溫染1 h后洗3遍,每遍數(shù)分鐘,用核固紅染液染色5 min后洗去染液,將洗好的切片依次放在梯度酒精中靜置幾分鐘后用C6H4(CH3)2透明,蓋上蓋玻片后用玻片掃描儀拍照。

2.7 免疫熒光檢測(cè)T2DM小鼠腦內(nèi)NEUN和NLRP1的共定位及表達(dá)石蠟切片脫蠟至水,隨后用0.25% TritonX-100滲透半小時(shí),用1% BSA包裹切片1 h后稍微抖干,用一抗NEUN(1 ∶200)或NLRP1 (1 ∶200)覆蓋組織,于4 ℃避光的條件下孵育,24 h后用PBS溶液將切片上的一抗洗干凈,滴加相應(yīng)二抗覆蓋組織,室溫遮光孵育1 h,1 h后洗去二抗,覆蓋上Hoechest 33258染液,室溫遮光孵一刻鐘后洗去染液,抗熒光封片,并使用智能組織切片成像分析系統(tǒng)進(jìn)行觀察和記錄。

2.8 RT-PCR檢測(cè)組織內(nèi)mRNA取20 mg小鼠的腦組織和裂解液充分研磨,結(jié)束后混勻勻漿液,14 000g離心2 min,加入等體積結(jié)合液到裂解液中,混合液經(jīng)純化柱,12 000g離30 s,棄濾液。用600 μL洗滌液Ⅰ 12 000g離心30 s來洗滌純化柱。棄廢液后用600 μL洗滌液Ⅱ洗滌純化柱 2 次,16 000g離心2 min,棄廢液。將RNA純化柱放入RNA洗脫管中,加入50 μL洗脫液放置3 min,16 000g離心30 s,最終得到即為RNA。制備PCR反應(yīng)液,使用熒光定量PCR儀進(jìn)行檢測(cè),反應(yīng)條件為:95 ℃ 3 s后接著60 ℃ 30 s(40 cycles)。分析各分子mRNA相對(duì)表達(dá)水平。各引物序列見Tab 1。

Tab 1 primer sequences for PCR

2.9 Western blot稱取0.05 g腦組織,加入0.6 mL預(yù)冷的現(xiàn)配裂解液,用冷凍研磨機(jī)將組織磨碎,裂解、離心后,上清液即為總蛋白。在進(jìn)行蛋白質(zhì)濃度定量和蛋白變性后,用10% SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白,隨后用200 mA的電流轉(zhuǎn)膜適當(dāng)時(shí)間。用TBST配制5%脫脂奶粉,將膜放進(jìn)奶粉中常溫浸泡2 h,接著用 TBST將膜搖床上搖洗數(shù)次,總計(jì)時(shí)間約為0.5 h 即可,最后將膜放入一抗,4 ℃慢搖18 h左右后洗膜,將膜放進(jìn)一抗相應(yīng)的二抗孵1 h后顯影,使用 ImageJ分析蛋白條帶。

3 結(jié)果

3.1 Rg1治療對(duì)T2DM小鼠體質(zhì)量、血糖的影響Fig 2A結(jié)果顯示,HFD組小鼠體質(zhì)量明顯高于control組(P<0.01),說明高脂飼料喂養(yǎng)能夠明顯增加小鼠體質(zhì)量,T2DM小鼠出現(xiàn)了體質(zhì)量下降的情況,Rg1 10 mg·kg-1治療組能夠改善T2DM小鼠體質(zhì)量下降,但效果不如Metformin組(P<0.01)。Fig 2B的FBG結(jié)果顯示,HFD組出現(xiàn)了較為明顯的胰島素抵抗(P<0.01),血糖的變化說明了Rg1 5和10 mg·kg-1都有減緩T2DM小鼠血糖增加的作用,但效果不如Metformin組(P<0.01)。

Fig 2 Regulation of body weight and blood glucose in T2DM mice by Rg1

3.2 人參皂苷Rg1對(duì)T2DM小鼠學(xué)習(xí)、探索和記憶的調(diào)節(jié)作用相較于空白對(duì)照組,高脂對(duì)照組小鼠的平均逃逸潛伏期沒有明顯區(qū)別,T2DM模型組小鼠明顯延長(zhǎng),而所有治療組都有所減少,特別是Rg1 10 mg·kg-1最明顯(Fig 3A-D,P<0.05或P<0.01)。在d 1-4的訓(xùn)練中,小鼠的平均逃逸潛伏期隨著訓(xùn)練時(shí)間增加而下降,說明訓(xùn)練有效(Fig 3A-D,P<0.05或P<0.01)。Fig 3E表示d 5的水迷宮實(shí)驗(yàn)中典型軌跡圖,由圖中結(jié)果可得,相較于空白對(duì)照組小鼠,高脂對(duì)照組沒有明顯區(qū)別,而T2DM模型組小鼠第一次經(jīng)過平臺(tái)的潛伏期明顯延長(zhǎng),在平臺(tái)所在象限的存在時(shí)長(zhǎng)以及經(jīng)過次數(shù)明顯下降,(Fig 3F-H,P<0.01)。在經(jīng)過Rg1不同劑量治療后的小鼠在平臺(tái)所在象限存在的時(shí)間有所延長(zhǎng),經(jīng)過平臺(tái)所在象限的次數(shù)有所增加,第一次經(jīng)過平臺(tái)的潛伏期也縮短了(Fig 3F-H,P<0.01)。灌胃給藥二甲雙胍的小鼠的表現(xiàn)也有所好轉(zhuǎn),但其療效仍然不及Rg1 10 mg·kg-1組(Fig 3F-H,P<0.05或P<0.01)。這些結(jié)果表明,Rg1治療能明顯提高T2DM鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。

Fig 3 Effects of Rg1 treatment on cognitive function in T2DM

3.3 Rg1治療對(duì)T2DM小鼠海馬神經(jīng)元病理形態(tài)的作用空白對(duì)照組和高脂對(duì)照組呈現(xiàn)小鼠皮層和海馬神經(jīng)元數(shù)目較多,形態(tài)飽滿,多數(shù)細(xì)胞都偏圓,沒有明顯的核固縮,細(xì)胞構(gòu)造完好,核仁分明。T2DM模型組小鼠顯現(xiàn)明顯的病理?yè)p傷,胞體形狀不規(guī)則,細(xì)胞之間排列繁雜混亂,呈梭形,出現(xiàn)核固縮及深染。所有的治療組都能夠明顯改善患病小鼠海馬、皮質(zhì)部位的核固縮等神經(jīng)元損傷的現(xiàn)象(Fig 4)。

Fig 4 The morphological changes in cortical and hippocampal pathology after Rg1 treatment in T2DM mice(×400)

3.4 Rg1治療對(duì)T2DM小鼠海馬神經(jīng)元衰老的影響高脂對(duì)照組小鼠大腦內(nèi)衰老的神經(jīng)細(xì)胞與空白對(duì)照組數(shù)量相似。T2DM模型組小鼠與空白對(duì)照組相比,其皮層和海馬相同位置中表達(dá)β-半乳糖苷酶的神經(jīng)細(xì)胞明顯增多,進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)顯示,對(duì)于糖尿病導(dǎo)致的神經(jīng)細(xì)胞衰老,Rg1 10 mg·kg-1在所有治療組中效果最佳(Fig 5A,B,P<0.05或P<0.01)。

3.5 Rg1治療對(duì)T2DM小鼠大腦微血管出血的影響普魯士藍(lán)染色結(jié)果顯示,空白對(duì)照組和高脂對(duì)照組小鼠大腦皮質(zhì)、海馬CA1區(qū)和CA3區(qū)幾乎沒有出血點(diǎn)(黑色箭頭指示的藍(lán)色斑點(diǎn))。而相較于空白對(duì)照組,T2DM模型組小鼠皮質(zhì)、海馬CA1區(qū)和CA3區(qū)則出現(xiàn)了一些的出血點(diǎn),Rg1和二甲雙胍治療能夠改善T2DM小鼠皮質(zhì)、海馬CA1區(qū)和CA3區(qū)出血現(xiàn)象,且Rg1 10 mg·kg-1的效果優(yōu)于二甲雙胍(Fig 6A-B,P<0.05或P<0.01)。

3.6 Rg1治療對(duì)T2DM小鼠大腦內(nèi)NEUN和NLRP1共定位及表達(dá)的影響免疫熒光染色結(jié)果顯示,NEUN在細(xì)胞核中表達(dá),細(xì)胞共同表達(dá)NEUN和NLRP1。NLRP1主要在T2DM小鼠的大腦皮質(zhì)和海馬神經(jīng)細(xì)胞中表達(dá)(Fig 7A),NLRP1在空白對(duì)照組和高脂對(duì)照組的小鼠皮層和海馬內(nèi)表達(dá)較少且兩組之間無顯著性差異(Fig 7B,P>0.05),在T2DM模型組中,可以觀察到NLRP1表達(dá)明顯增加(Fig 7B,P<0.01),在給予二甲雙胍和Rg1的治療組中均發(fā)現(xiàn)NLRP1的表達(dá)減少,其中Rg1 10 mg·kg-1組在所有用藥組中降低NLRP1表達(dá)的程度最明顯。

3.7 Rg1治療對(duì)T2DM鼠腦內(nèi)NLRP1炎癥小體相關(guān)信號(hào)分子的影響PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)出高脂飲食組相比于空白對(duì)照組caspase-1, NLRP1, ASC相應(yīng)mRNA的表達(dá)程度上無明顯的差異,T2DM模型組相比于空白對(duì)照組其相應(yīng)的mRNA明顯增加,且所有的治療組其相應(yīng)mRNA的表達(dá)均有所減少(Fig 8 A-C,P<0.05或P<0.01)。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,與空白對(duì)照組小鼠相比,高脂對(duì)照組小鼠大腦內(nèi)NLRP1相關(guān)的炎癥蛋白的表達(dá)沒有明顯變化,T2DM模型組相比于空白對(duì)照組,caspase-1,NLRP1,IL-1β,ACS蛋白有著更多的表達(dá),而藥物治療都能夠有效減少患病鼠腦內(nèi)這些蛋白的表達(dá)量。(Fig 8 D-H,P<0.05或P<0.01)

Fig 6 Effects of Rg1 treatment on cerebral cortex and hippocampal vascular lesions in T2DM

3.8 人參皂苷Rg1對(duì)T2DM小鼠腦中MAPK有關(guān)蛋白質(zhì)的作用Western blot實(shí)驗(yàn)表明,高脂對(duì)照組小鼠腦內(nèi)p-ERK、ERK、p-JNK、JNK、p-P38、P38、p-GSK-3β和GSK-3β蛋白的表達(dá)與和空白對(duì)照組無明顯差別。T2DM模型組小鼠腦內(nèi)p-ERK、p-JNK、p-P38和p-GSK-3β蛋白的表達(dá)相較于對(duì)照組明顯升高,而Rg1與二甲雙胍治療能夠降低這些蛋白在腦內(nèi)的表達(dá)(Fig 9A-I,P<0.05或P<0.01)。

4 討論

眾所周知,T2DM是代謝異常綜合征的一種,具體來說主要是由胰島素相對(duì)缺乏造成的,通常伴有體質(zhì)量減輕、高脂血癥和持續(xù)性高血糖等癥狀[9]。而持續(xù)性高血糖的并發(fā)癥其中之一就是高血糖誘導(dǎo)的認(rèn)知功能障礙[10]。本研究觀察到,在HFD喂養(yǎng)8周后的小鼠體質(zhì)量明顯高于對(duì)照組,在注射STZ后T2DM小鼠FBG也明顯升高,而體質(zhì)量減輕,這些結(jié)果表明成功建立了T2DM小鼠模型。然而,用Rg1治療明顯逆轉(zhuǎn)了T2DM引起的小鼠體質(zhì)量減輕和糖脂代謝功能障礙,表明Rg1在高血糖治療中具有一定的積極作用。與上述結(jié)果一致,T2DM模型組的小鼠在HE、MWM實(shí)驗(yàn)中也有神經(jīng)元明顯受損的情況和認(rèn)知功能障礙的行為表現(xiàn),Rg1治療可以逆轉(zhuǎn)神經(jīng)元細(xì)胞的變性損傷,恢復(fù)T2DM模型組小鼠的探索和記憶能力。

細(xì)胞衰老源于細(xì)胞受到應(yīng)激,據(jù)報(bào)道,糖尿病和細(xì)胞衰老會(huì)導(dǎo)致惡性循環(huán),從而促進(jìn)T2DM及其并發(fā)癥的發(fā)展[11]。Senolytic是近年來進(jìn)入臨床試驗(yàn)一種藥物,通過靶向清理機(jī)體中衰老凋亡的細(xì)胞,解決衰老導(dǎo)致的一些生理問題,包括T2DM導(dǎo)致的認(rèn)知問題[12]。此外,有研究顯示,T2DM由于持續(xù)性高血糖和高血脂等糖脂代謝障礙導(dǎo)致腦血管破裂的風(fēng)險(xiǎn)很高,這可能加劇神經(jīng)元變性和認(rèn)知功能障礙[13]。在本研究中我們發(fā)現(xiàn)T2DM模型組小鼠相比于空白對(duì)照組小鼠腦內(nèi)神經(jīng)元β-gal的活性和出血區(qū)域明顯增加,表明T2DM模型組小鼠出現(xiàn)了明顯的神經(jīng)元老化損傷和腦內(nèi)微血管的破裂出血等變化。而用Rg1治療則明顯降低了T2DM模型小鼠腦中神經(jīng)元β-gal的活性及微血管破裂出血病變的發(fā)生率。這些研究結(jié)果進(jìn)一步解釋了Rg1恢復(fù) T2DM模型小鼠的行為功能也許與減緩微血管病變和神經(jīng)元衰老有關(guān)。

除了上述的腦血管病變外,現(xiàn)有研究還證實(shí)神經(jīng)炎癥和氧化應(yīng)激是導(dǎo)致T2DM病人認(rèn)知障礙的重要原因[14]。另有研究說到,有一種機(jī)制是大量促炎因子分泌引起的持續(xù)性炎癥[15]。NLRP1是一種NOD樣受體家族蛋白,在外部刺激時(shí)被激活,并招募下游ASC和caspase-1以形成炎性小體。然后,caspase-1通過自我裂解激活,產(chǎn)生成熟的IL-1β,從而啟動(dòng)炎癥反應(yīng)[16]。實(shí)驗(yàn)中,相比于模型組,Rg1治療抑制了NLRP1小體的活化。免疫熒光實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)也顯示,相較于空白對(duì)照組,模型組小鼠大腦中NLRP1蛋白明顯增多,而Rg1用藥后能夠明顯降低它的表達(dá)。其中,在炎癥、胰島素抵抗和T2DM的過程中,絲裂原激活蛋白激酶(MAPK)信號(hào)通路起著關(guān)鍵作用。Zu等[17]證明了T2DM和AD的共享關(guān)鍵通路是“MAPK”,并推測(cè)槲皮素通過靶向MAPK信號(hào)傳導(dǎo)在T2DM中具有治療作用。因此,我們推測(cè)Rg1可能通過作用于MAPK通路來抑制T2DM誘發(fā)的NLRP1炎癥體的活化從而改善神經(jīng)元損傷和學(xué)習(xí)記憶。本研究進(jìn)一步檢測(cè)了T2DM鼠腦內(nèi)MAPK相關(guān)蛋白的表達(dá),結(jié)果表明,T2DM明顯激活了腦組織中MAPK信號(hào)通道,而Rg1減少了患T2DM小鼠腦內(nèi)的p-ERK等蛋白。上述結(jié)果意味著MAPK-NLRP1通路可能在T2DM導(dǎo)致的小鼠認(rèn)知能力下降和神經(jīng)細(xì)胞受損中意義重大,而Rg1可以通過抑制T2DM導(dǎo)致的MAPK-NLRP1信號(hào)激活,改善認(rèn)知能力下降和神經(jīng)細(xì)胞衰老損傷等情況。

Fig 7 Effects of Rg1 treatment on colocalization and expression of NEUN and NLRP1 in cerebral

綜上所述,人參皂苷Rg1對(duì)T2DM誘導(dǎo)的學(xué)習(xí)記憶和神經(jīng)元損傷有明顯減輕作用,其機(jī)制是人參皂苷Rg1抑制 MAPK通路的磷酸化,減少腦內(nèi)NLRP1炎癥體活化,減輕神經(jīng)細(xì)胞的炎癥,從而減小T2DM對(duì)神經(jīng)元的損傷,提高小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。

Fig 8 Role of Rg1 on expression of IL-1β, ASC, caspase-1 and NLRP1 in brain of

Fig 9 Effects of Rg1 on expressions of p-ERK, p-JNK, p-P38 , p-GSK-3β in brain tissue of T2DM