高效液相色譜法同時測定小麥粉中乙二胺四乙酸二鈉、曲酸和間苯二酚

姜志遠，馬可佳，王 緣，王曉婧，趙 嵐

（黑龍江省疾病預防控制中心，黑龍江哈爾濱 150030）

小麥粉中含有豐富的淀粉、蛋白質、脂肪及膳食纖維等營養成分，是北方居民餐桌上重要的主食來源，因此市售小麥粉的品質受到食品監管部門的高度重視。但有些不法商販通過向劣質小麥粉中添加防腐劑、抗生素和增白劑等非食品原料，掩蓋小麥粉質量低劣的事實，使市售小麥粉的感官性狀達到出廠標準，這種行為存在很大的食品安全風險，嚴重危害了廣大消費者的身體健康。在這些添加劑中，乙二胺四乙酸二鈉屬于超范圍使用的食品添加劑[1-2]，曲酸、間苯二酚是國家食藥總局明令禁止使用的化學成分[3-4]。市售小麥粉中是否添加乙二胺四乙酸二鈉、曲酸和間苯二酚等非法添加劑，是評價小麥粉安全性的主要依據，因此研究市售小麥粉中多種非食品原料檢測方法非常重要。

本實驗采用高效液相色譜法同時對市售小麥粉中乙二胺四乙酸二鈉、曲酸和間苯二酚這3 種化合物進行檢測分析，探索同時測定小麥粉中多種非法添加劑的方法，為小麥粉的安全性評價及質量監督提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小麥粉樣品48批次，購自哈爾濱市、齊齊哈爾市、綏化市等地的糧油市場。

乙二胺四乙酸二鈉（含量：99.0%；批號：20200701），國藥集團化學試劑有限公司；曲酸（含量：100.0%；批號：CCFD200382），德國卡特化工有限公司；間苯二酚（含量：99.9%；批號：21071189），壇墨質檢-標準物質中心；甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純），美國Merck 公司；甲酸（色譜純），DIKMA 公司。

1.2 儀器與設備

2695 型高效液相色譜儀；Watere 2489 型檢測器；GP324S 電子天平，Sartorius 公司；DC24H 氮吹儀，安譜科學儀器公司；KQ500VDE 型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器；3K15 型高速冷凍離心機，SIGMA公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 標準溶液的配制

稱取乙二胺四乙酸二鈉、曲酸標準物質適量，分別用30%甲醇溶液配制成50.0 μg·mL-1的標準儲備液；稱取間苯二酚標準物質適量，用80%甲醇溶液配制成50.0 μg·mL-1的標準儲備液。移取上述標準溶液適量，用50%乙腈溶液稀釋成濃度為0.5 μg·mL-1、1.0 μg·mL-1、2.0 μg·mL-1、4.0 μg·mL-1、6.0 μg·mL-1和10.0 μg·mL-1的系列混合標準溶液。

1.3.2 樣品前處理

稱取市售小麥粉樣品5.0 g，置于聚丙烯離心管中，加入乙腈-甲醇-水溶液（5 ∶4 ∶1）10 mL，振搖混勻后，渦旋混勻10 min，超聲處理15 min，8 000 r·min-1離心10 min，獲取上清液并置于另一離心管中；再次加入乙腈-甲醇-水溶液（5 ∶4 ∶1）10 mL，重復提取一次，合并兩次小麥粉提取液。移取10 mL 提取液，置于帶刻度的離心管中，在40 ℃水浴下氮吹至近干，使用50%乙腈溶液復溶以后，定容至2 mL，過0.22 μm 濾膜后進樣檢測[5-9]。

1.3.3 色譜條件

DiamonsiL-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱 溫：40 ℃； 流 速：1.0 mL·min-1； 進 樣 體 積：20 μL；流動相：A 為乙腈，B 為0.1%甲酸溶液；檢測波長：275 nm；梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫條件

1.3.4 樣品測定

小麥粉樣品經過前處理后，注入液相色譜分析并計算乙二胺四乙酸二鈉、曲酸和間苯二酚的峰面積，以濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，建立3 種化合物的標準曲線，將樣品峰面積代入到標準曲線中，計算小麥粉樣品溶液中的化合物含量。

2 結果與分析

2.1 流動相的優化

參考文獻[10-12]中的色譜條件，改變流動相中乙腈、0.1%甲酸溶液的比例，研究了不同梯度下乙二胺四乙酸二鈉、曲酸和間苯二酚的理論塔板數和分離度，結合3 種化合物的保留時間，確定了最佳流動相比例。在這種流動相條件下，3 種化合物的理論塔板數均不小于5 000，各個色譜峰的分離度均不小于1.5，具體結果見圖1、圖2、圖3。

圖1 混合標準溶液色譜圖

圖2 空白樣品加標色譜圖

圖3 空白樣品（小麥粉）色譜圖

2.2 檢測波長的選擇

乙二胺四乙酸二鈉、曲酸和間苯二酚的紫外吸收峰值不同。間苯二酚和曲酸的最大吸收波長在260 ～280 nm，乙二胺四乙酸二鈉的最大吸收波長在250 ～280 nm，為兼顧各個成分的靈敏度，并能實現同時測定的目的，選擇275 nm 作為3 種化合物共有的檢測波長。

2.3 提取溶劑的選擇

根據3 種化合物的溶解性和相關文獻資料的報道，選擇常用試劑甲醇、50%甲醇、乙醇、50%乙醇、50%乙腈、乙腈-甲醇-水溶液（5 ∶4 ∶1）作為提取溶劑進行比較。結果表明，選擇甲醇、乙醇提取小麥粉樣品，乙二胺四乙酸二鈉的回收率低于70%；選擇50%甲醇、50%乙醇和50%乙腈提取小麥粉樣品，進樣后獲得的色譜圖中干擾峰較多，專屬性不強；選擇乙腈-甲醇-水溶液（5 ∶4 ∶1）提取小麥粉樣品，離心后上清液清澈透明，色譜圖中沒有干擾峰，3 種化合物均能獲得良好的回收率，可以滿足定量檢測要求。

2.4 線性范圍分析

準確移取3 種化合物的標準系列濃度溶液各20 mL，按照由低到高的濃度依次進樣檢測，將峰面積（Y）作為縱坐標，將濃度（X）作為橫坐標，繪制標準曲線，結果表明，乙二胺四乙酸二鈉、曲酸和間苯二酚3 種化合物在0.50 ～10.00 μg·mL-1時，線性關系良好（表2）。

表2 線性范圍及檢出限結果

2.5 最低檢出限

在“1.3.3”的色譜條件下，將標準混合使用液用50%乙腈溶液逐級稀釋進樣，以3 倍信噪比估算乙二胺四乙酸二鈉、曲酸和間苯二酚的最低檢出限。由表2 可知，乙二胺四乙酸二鈉、曲酸和間苯二酚這3 種化合物的檢出限分別為0.006 μg·kg-1、0.005 μg·kg-1、0.003 μg·kg-1，方法的檢出限滿足質量分析的要求。

2.6 加標回收率實驗

為了確定檢測方法的回收率，選擇清洗后干燥麥粒經粉碎獲得的小麥粉作為加標回收率實驗的空白基質。分別移取“1.3.1”項下的標準儲備液，依次加入5.0 g 空白基質中，按“1.3.2”方法制備濃度為1.0 mg·kg-1、2.0 mg·kg-1、4.0 mg·kg-1的加標樣品溶液，每個濃度水平設置6 個平行樣。如表3 所示，小麥粉中乙二胺四乙酸二鈉、曲酸和間苯二酚3 種化合物的平均回收率在97.2%～99.7%，平均相對標準偏差在1.06%～1.79%，說明回收率良好。

表3 小麥粉中3 種化合物的加標回收率（n=6）

2.7 市售樣品測定

采用本方法對市售48 種小麥粉中的乙二胺四乙酸二鈉、曲酸和間苯二酚3 種化合物進行測定，結果未檢出這3 種化合物，說明檢測的小麥粉中不存在乙二胺四乙酸二鈉、曲酸和間苯二酚3 種非食品原料的問題。本方法可用于小麥粉樣品的快速定量檢測。

3 結論

本文建立的高效液相色譜方法可以實現乙二胺四乙酸二鈉、曲酸和間苯二酚3 種化合物的有效分離，靈敏度高，線性關系良好，回收率高，且成功應用于市售48 種小麥粉中3 種化合物的分離測定。