元寶楓種子生活力TTC 法檢測技術研究

馬 鑫，張俊杰，孫延國，魯儀增，李 猛，宋福榮，趙云朝，許慶標，劉金錦，張連合，仝伯強，穆艷娟*

（1.興林（北京）林業工程設計研究院有限公司，北京 100091；2.山東農業工程學院，山東 濟南 250100；3.國家林業和草原局元寶楓工程技術研究中心暖溫帶林草種質資源保存與利用國家林業和草原局重點實驗室 山東省林草種質資源中心，山東濟南 250102；4.菏澤市林業局，山東 菏澤 274000；5.成武縣國有林場，山東 成武 274200）

元寶楓（Acer truncatum Bunge）又名元寶槭、平基槭等，為我國無患子科（Sapindaceae）槭屬（Acer Linn.）植物，其分布范圍廣、栽培歷史悠久，是我國特有的觀賞樹種、木本油料樹種[1,2]。元寶楓葉中含有多種與人體健康有關的活性成分，元寶楓的果皮、果翅和種皮含有大量的優質縮合性單寧，而單寧具有抗氧化、抗血栓、降低膽固醇等功效，有益于心臟血管疾病的預防。而且元寶楓油是植物源神經酸的重要來源，進一步促進了元寶楓藥用價值的開發利用。尤其近10 多年來，元寶楓產業基礎研究與培育技術開發縱深發展，并且在槭屬植物源神經酸開發[3]、元寶楓籽油列入新資源食品[4]以及元寶楓葉、樹皮、枝條等利用研究[5-8]等方面取得了突破，陸續測序組裝了元寶楓的葉綠體基因組[9-11]、全基因組[12]并挖掘了神經酸的生物合成調控基因等，報道了元寶楓嫁接育苗技術[13,14]、扦插育苗技術[15-18]、組培快繁技術[19-23]等無性繁育技術和結實規律[24]，元寶楓的全株開發利用前景越來越廣闊[25,26]。最新研究還發現神經酸可以通過發芽刺激富集在元寶楓的種子中[27]。但是，元寶楓種子生物學研究薄弱[28]，元寶楓種子萌發率不高（66%）[29]，元寶楓的機理研究[30]及繁育研究[31]均基于發芽法，易造成不可控的經濟損失。《GB2772-1999 林木種子檢驗規程》[32]也只采用發芽法進行元寶楓種子生活力測定，常規檢測法下的元寶楓發芽率低而且檢測周期長，遠遠滿足不了現代育苗、生產對元寶楓種子生活力快速檢測的需求。2,3,5-氯化三苯基四氮唑法（TTC 法）是國際上檢測木本油料樹種種子生活力的通用快速、高效方法[36]。本研究以元寶楓家系種子為材料，探索建立元寶楓種子生活力TTC 快速檢測方法，以期為元寶楓產業發展提供一定支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究以國家林業草原元寶楓工程技術研究中心于2020 年秋季采集的元寶楓種子為材料，采種后室溫自然晾干，去除果皮后備用。其中，正交試驗中每處理的種子數量為10 個；最佳染色溫度篩選所用種子為2 個河北省種源的元寶楓單株種子（單株編號HB060 和HB067）和1 個山東省種源的單株種子（單株編號SD001），正交試驗中每處理的種子數量為20 個。

1.2 試驗方法

1.2.1 種子處理方法

將元寶楓種子置于20～25℃的水中浸泡18h，隨后放置3～5℃的環境中預處理10～14 d。按照向振勇等提供的方法[33]配置TTC 濃度梯度為0.5%、0.75%、1%，置4℃冰箱備用。染色處理溫度為20℃、25℃、30℃、35℃、40℃。

1.2.2 染色方法

按照正交設計進行染色試驗。將處理完畢的元寶楓種子置于暗盒內進行TTC 染色，每盒10 粒，參照《GB2772-1999 林木種子檢驗規程》[32]茶條槭（A.ginnala Maxim.）TTC 處理時間，分別將含有元寶楓種子的暗盒放置于培養箱中避光加熱48h。隨后，按照向振勇等提供的方法[33]從元寶楓種子中取出胚，檢測元寶楓胚的染色程度判斷元寶楓種子的生活力，計算具種子生活力（Seed viability，SV）的百分比：SV=（有生活力的種子數量/供試種子總數）×100%。具最佳染色效果（The best dyeing effect，BDE）的所占百分比，BDE=（具最佳染色的種子數量/供試種子總數）×100%。

1.2.3 數據處理方法

利用Microsoft Office Excel 2013 和SPSS 18.0 軟件進行數據統計分析。

2 結果與分析

2.1 元寶楓種子生活力對不同處理的響應

TTC 濃度和不同處理染色溫度，對元寶楓種子的染色效果均有一定影響（表1），其中SV 為50%～95%，平均為76.17%；BDE 為22.5%～75%，平均為53.33%。由表1 進一步分析表明，隨著TTC 濃度由0.5%升高至1%，SV 和BDE 均逐漸增高，分別為71%和50.5%、74.5%和51.5%、83%和58%；隨著染色處理溫度由20℃升高至40℃，SV 和BDE 的變化也基本一致，呈現先增高后降低的趨勢，分別為59.17%和32.5%、75.83%和41.67%、79.17%和64.17%、84.17 和59.17、82.5%和69.17%，TTC 的濃度越高元寶楓種子中具活力種子的檢出比例越高，而染色溫度以35℃～40℃為宜。

表1 不同處理下元寶楓種子染色情況

SV 與BDE 呈極顯著正相關（相關系數為0.817），具生活力的元寶楓種子所占比例越高，相關處理的染色率越高，具最佳染色效果元寶楓種子所占的比例也越高。

元寶楓SV 最低的組合為處理1（表1），TTC 濃度為0.5%，染色溫度20℃；元寶楓SV 最高的組合為處理14（表1），TTC 濃度為1%，染色溫度35℃。

2.2 正交試驗結果的極差分析

TTC 濃度和染色溫度對元寶楓種子生活力影響的極差分析（表2）表明，染色溫度的極差R2 （25） 大于TTC 濃度的極差R1（12），表明染色溫度對元寶楓SV 的影響大于TTC 濃度對其SV 的影響。TTC 濃度中，K3 最大，濃度為1%；染色溫度中，K4 最大，染色溫度為35℃。極差分析表明，元寶楓種子TTC 檢測的最佳條件為TTC 濃度為1%；染色溫度為35℃。

表2 不同處理對元寶楓種子生活力影響的極差分析

2.3 不同處理的主效應檢驗

TTC 濃度和染色溫度處理的交互效應檢驗結果（表3）表明，TTC 濃度及其與染色溫度互作對SV 的影響均較小，均未達到顯著水平； 溫度0.05 水平上對SV 的影響較大，達到顯著差異水平。說明與極差分析結果一致，染色溫度對SV 的影響較大，需要進一步篩選出最佳處理溫度。

表3 元寶楓種子不同處理的主效應檢驗

2.4 元寶楓種子生活力TTC 法最佳檢測處理因子驗證與篩選

2.4.1 TTC 最佳濃度驗證與篩選

不同單株元寶楓種子的生活力檢測結果（表4）進一步表明，不同TTC 濃度梯度下，檢測出具有活力的種子數量為16.89～17.78 個，平均為17.22 個，變異系數為2.3%；SV 為84.44%～88.89%，平均為86.11%，變異系數為2.3%。BDE 為72.22%～73.33%，平均為72.78%，變異系數為0.62%。以上說明，在TTC 濃度0.5%～1%變化時，TTC 法用于元寶楓種子生活力檢測時的檢出能力均較強，不同單株之間的變化不大。從具有生活力的元寶楓種子檢出數量、SV 以及BDE 來看，均以TTC 濃度1%時最為理想。綜合選擇以1%TTC濃度最佳。

表4 不同家系元寶楓種子生活力對TTC 濃度處理的響應

2.4.2 TTC 最佳染色溫度驗證與篩選

不同家系元寶楓種子生活力檢測結果（表5）進一步表明，不同染色溫度梯度下，檢測出具有活力的種子數量范圍為17～17.67個，平均為17.22 個，變異系數為1.82%；SV為85%～88.33%，平均為86.11%，變異系數為1.82%。BDE 為68.89%～76.67%，平均為72.78%，變異系數為4.36%。以上說明，在染色溫度35℃～40℃梯度下，TTC 法用于元寶楓種子生活力檢測時的檢出能力也均較強，不同單株之間的SV 變化相對較小，BDE 的變化相對較大。從具有生活力的元寶楓種子檢出數量、SV 以及BDE 來看，綜合以37.5℃染色溫度下，SV（91.67%）和BDE（81.67%）的結果均最佳。

表5 不同家系元寶楓種子生活力對不同溫度處理的響應

3 結論與討論

3.1 結論

染色溫度顯著影響元寶楓種子的染色效果，隨溫度升高染色效果先逐漸增強再稍微減弱；染色效果隨TTC 濃度升高而逐漸增強，但TTC 濃度及其與染色溫度的交互作用對元寶楓種子染色效果的影響均未達到顯著水平。TTC 濃度0.5%～1%，染色溫度為35℃～40℃時，TTC 法在不同單株之間的檢驗能力基本相當，適用于元寶楓種子生活力檢測。其中，以TTC 濃度為1%、37.5℃染色處理條件下開展元寶楓種子生活力檢測最為理想。

3.2 討論

TTC 法在植物種子檢驗中具有簡便、快捷、有效、準確等優點[33,34]。其中，TTC 濃度決定了染色效果的深淺，而溫度影響到染色效果的呈現速度，二者綜合決定了TTC 法檢測的效果和靈敏程度。但是近年來，一直沒有建立起元寶楓種子生活力快速檢測方法體系，傳統方法耗時長、效果差，不利于元寶楓種子調撥及育種評估。本研究通過對元寶楓種子生活力檢驗的TTC 濃度和溫度梯度處理，進行正交分析及其在不同單株間進行重復驗證篩選，從中得出的最佳TTC 濃度和最佳溫度，研建了元寶楓種子TTC 快速檢驗方法，為元寶楓相關科研生產提供了技術支撐。