革蘭染色與基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜應(yīng)用于鑒定兒童陽性血培養(yǎng)病原菌種類中的價(jià)值

白 羽

福建省泉州市第一醫(yī)院檢驗(yàn)科 362000

血流感染是臨床常見的感染性疾病,有較高的發(fā)病率和致死率,全球每年發(fā)生血液感染的近20萬患兒中,病死率可達(dá)10%～20%,給患兒的生命安全帶來極大威脅[1]。因此當(dāng)患兒出現(xiàn)疑似血流感染時(shí),需要盡快明確病原菌種類,根據(jù)藥敏的不同特點(diǎn)給予其相對應(yīng)的抗菌藥物,不僅能夠控制血流感染速度,挽救患兒生命,同時(shí)能夠降低患兒家庭經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)提高生存率。臨床常以轉(zhuǎn)種培養(yǎng)后的鑒定結(jié)果作為血流感染的金標(biāo)準(zhǔn),但由于培養(yǎng)較困難,同時(shí)培養(yǎng)報(bào)陽后傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)種和生化表型鑒定方法至少需要48h,結(jié)果判定耗時(shí)長等原因受到諸多限制,無法做到快速評估。革蘭染色方法是基于細(xì)菌細(xì)胞壁中肽聚糖之間的反應(yīng),用染劑固定顏色,使細(xì)胞脫色,并進(jìn)行復(fù)染。但脫色過度或不足時(shí),可能會(huì)改變結(jié)果,同時(shí)脫色時(shí)間的長短還受涂片厚薄及乙醇用量多少等因素的影響,難以嚴(yán)格規(guī)定[2]。基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜在細(xì)菌不經(jīng)過前處理的情況下直接檢測細(xì)菌[3],以上兩種方式在臨床應(yīng)用較為廣泛,因此本研究旨在分析革蘭染色及基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜在檢測兒童陽性血培養(yǎng)病原菌中的價(jià)值,現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2021年1月1日—2022年12月31日期間在我院送檢的兒童陽性血培養(yǎng)瓶153例作為研究對象,所收集標(biāo)本由我院工齡滿5年的檢驗(yàn)技師根據(jù)雙盲法閱片并進(jìn)行病原菌判斷。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。家屬簽署知情同意書。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)本研究所納入的患兒在臨床中均診斷為血流感染;(2)兒童年齡在3～10歲;(3)所納入的標(biāo)本均為陽性血培養(yǎng)。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)患兒合并其他基礎(chǔ)性疾病;(2)陽性血培養(yǎng)瓶污染;(3)合并其他免疫系統(tǒng)疾病者。

1.2 方法 轉(zhuǎn)種培養(yǎng):使用1ml的無菌注射器抽取0.5ml兒童血培養(yǎng)瓶中的液體,將其接種于血瓊脂平板中,放置于36℃,5%的CO2培養(yǎng)箱中,培養(yǎng)24h,再使用質(zhì)譜儀對單個(gè)菌落進(jìn)行鑒定,其中儀器的使用按照說明書進(jìn)行。

革蘭染色:使用1ml的無菌注射器抽取0.5ml兒童需氧血培養(yǎng)瓶中的液體涂片固定,通過草酸結(jié)晶紫初染1min,用水沖洗。加碘液覆蓋樣本涂面媒染1min,用水沖洗,滴加95%乙醇,輕輕搖動(dòng)脫色30s,用水沖洗,用吸水紙將水吸干,復(fù)紅染液復(fù)染1min,用水沖洗,用吸水紙將水吸干,最后行鏡檢觀察。

基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜培養(yǎng):使用1ml的無菌注射器抽取0.5ml兒童需氧血培養(yǎng)瓶中的液體,前期處理通過運(yùn)用Sepsityper Kit試劑盒。具體操作:將1ml的陽性血培養(yǎng)瓶中的液體放入eppendorf管中,再加入200μl的Buffer,通過渦旋震蕩10s,混勻離心2min,棄去上清,在沉淀中再加入1ml的洗滌緩沖液,渦旋震蕩30s直至沉淀完全溶解,離心1min,棄去上清,取沉淀,并在沉淀中加入MS-DS靶板,再加入1μl的MSCHCA基質(zhì),靜置至表面干燥,上機(jī)鑒定。結(jié)果的判定:綠色為唯一鑒定結(jié)果,可行度為60%～99%,黃色為低分辨結(jié)果可行度為>60%,紅色表示無法鑒定,可信率<60%,與數(shù)據(jù)庫的質(zhì)譜數(shù)據(jù)不匹配,重新檢測。

1.3 觀察指標(biāo) 以轉(zhuǎn)種培養(yǎng)后的鑒定結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn),均采用革蘭染色與基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜培養(yǎng),分析革蘭染色與基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜對陽性血培養(yǎng)病原菌的檢出率、兩種方式單獨(dú)與轉(zhuǎn)種培養(yǎng)后鑒定結(jié)果的一致性以及對兒童陽性血培養(yǎng)病原菌種類的診斷效能(靈敏度、特異度、準(zhǔn)確度)。(1)轉(zhuǎn)種培養(yǎng)后的鑒定結(jié)果對兒童陽性血培養(yǎng)病原菌種類的檢出率。(2)革蘭染色與基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜與轉(zhuǎn)種培養(yǎng)后的鑒定結(jié)果診斷的一致性:Kappa值<0.4表示檢測方式與金標(biāo)準(zhǔn)的診斷一致性較差,0.4≤Kappa值<0.75表示檢測方式與金標(biāo)準(zhǔn)的診斷一致性尚可,0.75≤Kappa值≤1.0表示檢測方式與金標(biāo)準(zhǔn)的診斷一致性較好。(3)革蘭染色與基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜對兒童陽性血培養(yǎng)病原菌種類的診斷價(jià)值:以轉(zhuǎn)種培養(yǎng)后的鑒定結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn),分析兩種方式對兒童陽性血培養(yǎng)病原菌種類的診斷符合率、靈敏度、特異度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,計(jì)數(shù)資料以率表示,采用χ2檢驗(yàn);一致性分析采用Kappa檢驗(yàn);P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 單一菌樣本革蘭染色與基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜檢測鑒定結(jié)果比較 共收集153例陽性兒童血培養(yǎng)樣本,其中單一菌樣本143例(93.46%),兩種菌樣本10例(6.54%)。153例樣本中,檢出革蘭陽性菌133株(86.93%)中以金黃色葡萄球菌最多(61.1%);革蘭陰性菌20株(13.07%)中以腸桿菌科細(xì)菌最多(60.00%)。

2.2 革蘭染色與基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜對病原菌種類的診斷效能對比 153例兒童陽性血培養(yǎng)病原菌中以轉(zhuǎn)種培養(yǎng)后的鑒定結(jié)果為判斷標(biāo)準(zhǔn),確定133例兒童陽性血培養(yǎng)病原菌為革蘭陽性菌,20例為革蘭陰性菌,其中革蘭染色檢測與轉(zhuǎn)種培養(yǎng)結(jié)果診斷標(biāo)準(zhǔn)一致性尚可(Kappa=0.501);基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜與轉(zhuǎn)種培養(yǎng)結(jié)果診斷標(biāo)準(zhǔn)一致性好(Kappa=0.826),見表1。

表1 革蘭染色與基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜對病原菌種類的診斷效能對比(n)

2.3 革蘭染色與基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜檢測對單一病原菌種類的診斷價(jià)值對比 基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜診斷病原菌種類的特異度、敏感度及診斷準(zhǔn)確率高于革蘭染色診斷(P<0.05),見表2。

表2 革蘭染色與基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜檢測對單一病原菌種類的診斷價(jià)值對比(%)

3 討論

血流感染作為嚴(yán)重的感染性疾病,死亡率較高,對于血流感染患兒而言,推遲1h使用抗生素進(jìn)行合理治療,會(huì)降低患兒的存活率[4]。因此對血培養(yǎng)結(jié)果監(jiān)測,了解血液感染病原菌分布,可以更好地幫助和指導(dǎo)臨床科學(xué)合理用藥,保障患兒的生命安全。臨床通常選擇轉(zhuǎn)種培養(yǎng)后的鑒定結(jié)果作為血流感染的金標(biāo)準(zhǔn),但因其培養(yǎng)耗費(fèi)時(shí)間較長,同時(shí)從血液中所分離的病原菌在后期形成可視菌落過程較慢,無法作為臨床快速判斷的檢測方法[5]。目前隨著檢測技術(shù)的發(fā)展,分子生物等檢測方式相對簡單,檢測時(shí)長較短,逐漸得到檢驗(yàn)科及門診工作者的重視。革蘭染色可以觀察到細(xì)菌的形態(tài)、排列及結(jié)構(gòu)特征,但分辨度較低,操作煩瑣,不能準(zhǔn)確區(qū)分細(xì)菌種屬,無法完全準(zhǔn)確指導(dǎo)臨床抗生素的合理使用[6]。基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜在操作上簡便、大規(guī)模、并行化和高度自動(dòng)化處理待檢生物樣品,在測定生物大分子和合成高聚物應(yīng)用方面有特殊的優(yōu)越性[7]。

本文收集153例陽性兒童血培養(yǎng)樣本,其中單一菌樣本143例(93.46%),兩種菌樣本10例(6.54%)。153例樣本中,革蘭陽性菌中以金黃色葡萄球菌最多(61.1%);革蘭陰性菌中以腸桿菌科細(xì)菌最多(60.00%);153例兒童陽性血培養(yǎng)病原菌中以轉(zhuǎn)種培養(yǎng)后的鑒定結(jié)果為判斷標(biāo)準(zhǔn),確定133例兒童陽性血培養(yǎng)病原菌為革蘭陽性菌,20例為革蘭陰性菌,其中革蘭染色檢測與轉(zhuǎn)種培養(yǎng)結(jié)果診斷標(biāo)準(zhǔn)一致性尚可(Kappa=0.501);基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜與轉(zhuǎn)種培養(yǎng)結(jié)果診斷標(biāo)準(zhǔn)一致性好(Kappa=0.826);基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜診斷病原菌種類的特異度、敏感度及診斷準(zhǔn)確率均高于革蘭染色診斷(P<0.05),說明基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜檢測診斷價(jià)值更高。可能的原因是基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜不僅能鑒定區(qū)分臨床中速分離出的菌落,同時(shí)也能夠?qū)εR床中未經(jīng)分離的標(biāo)本進(jìn)行鑒定,相較于常規(guī)鑒定方法此種方法能夠縮短細(xì)菌鑒定時(shí)間。其次,基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜是通過判斷分子量的差異進(jìn)行感染細(xì)菌的檢測,將瓊脂板中生長的黨菌落點(diǎn)涂在靶板上,在基質(zhì)溶液充分混勻后,在質(zhì)譜儀內(nèi)接受多次激光照射,在電荷解離的過程中,基質(zhì)能夠吸收激光并與菌體共同解吸,對菌株的鑒定率可達(dá)66%～97%,但處理陽性血培養(yǎng)液通常需要較為煩瑣的人工操作才能獲得足量、純化的病原菌蛋白[8]。再次,通過病原菌富集技術(shù)處理陽性血培養(yǎng)樣本后直接用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜進(jìn)行鑒定,將極大地提高鑒定速度,縮短報(bào)告時(shí)間,滿足臨床快速診斷的需求。同時(shí),質(zhì)譜技術(shù)能夠鑒定出復(fù)數(shù)菌中一種,未發(fā)現(xiàn)有鑒定錯(cuò)誤的情況。傳統(tǒng)的生化檢測方法或基因測序方法在實(shí)驗(yàn)整體操作中對于無菌要求較高,污染對結(jié)果的影響較大,而基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜則能保證一定的“容錯(cuò)性”[9]。有研究發(fā)現(xiàn)[10],當(dāng)感染多種菌且革蘭染色無法分辨時(shí),兩種評分較高的不同種類菌群的質(zhì)譜鑒定結(jié)果是一個(gè)寶貴的提示。這在本研究中也得到了同樣的印證。曹敬榮等人研究表明[11],通過運(yùn)用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜鑒定固體培養(yǎng)基短期培養(yǎng)后的血流感染病原菌,僅需2.5h即可鑒定且準(zhǔn)確率可達(dá)到58.3%,通過5.5h的培養(yǎng)鑒定準(zhǔn)確率能達(dá)82.3%,表明基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜在鑒定血培養(yǎng)陽性方面較有優(yōu)勢,培養(yǎng)時(shí)間短,節(jié)省了檢測時(shí)間,利于早期診斷。

綜上所述,革蘭染色與基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜檢查均可對兒童陽性血培養(yǎng)病原菌進(jìn)行檢出,且革蘭染色與基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜檢測診斷價(jià)值更高。