單核銦配合物的合成和抗腫瘤活性研究

蓋爽爽,藍峻峰,甘慶藍,蔣才云

(廣西科技師范學院 食品與生化工程學院,廣西 來賓 545004)

癌癥嚴重危害著人類的生命安全。化療是最常用的治療方案之一,50%以上的化療方案都包含鉑類藥物如順鉑、卡鉑和奧沙利鉑等,然而鉑類藥物因耐藥性和對腎臟等臟器的毒副作用而導致治療失敗[1-2]。因此,越來越多的研究開發其他金屬配合物用以治療惡性腫瘤。

銦配合物(Indium complexes)在臨床中有許多種應用,比如作為診斷試劑,但尚未有用作化療藥物[3]。然而,在之前的報道顯示銦配合物具有良好的抗腫瘤活性[4-6]。有趣的是,銦配合物與轉鐵蛋白具有良好的親和力,而更易被腫瘤細胞(腫瘤細胞表面比正常細胞表達更多的轉鐵蛋白)攝取,繼而產生更高的抗腫瘤活性[3]。縮氨基硫脲是具有多種生物活性,如抗菌、抗病毒和抗腫瘤等。同時,縮氨基硫脲由于其結構含有N,N,S-供體,因而是一類優秀的金屬螯合劑[7-8]。縮氨基硫脲金屬配合物作為潛在的抗癌藥物已被廣泛研究[8-9]。因此,本文擬以縮氨基硫脲為配體合成銦配合物,研究其體外的抗腫瘤活性,并初步探索其誘導腫瘤細胞死亡的機制。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Bruker APEX-II CCD單晶衍射儀,Perkin-Elmer240Q元素分析儀。三氯化銦四水合物、硫代氨基脲和2-噻唑甲醛購自北京伊諾凱試劑公司,甲醇等常用溶劑購自西隴化工廠。

1.2 銦配合物的合成

稱取硫代氨基脲(4.6 mg,0.05 mmol)、2-噻唑甲醛(5.7 mg,0.05 mmol)和三氯化銦四水合物 (14.7 mg,0.05 mmol)加入20 mL甲醇于65 ℃回流5 h后,過濾至燒杯內,在室溫條件下揮發,7 d在燒杯底部得到淡黃色晶體,圖1為銦配合物的合成路線。配合物1:產率75.8%;元素分析(%):C5H7Cl2InN4OS2:理論值:C,15.44;H,1.81;N,14.40;O,4.11;實測值:C,15.48;H,1.78;N,14.31;O,4.15。CCDC號:2171366。

圖1 銦配合物(配合物1)的合成路線

1.3 X-射線單晶衍射分析

應用X-射線單晶衍射技術檢測銦配合物的結構。挑選一顆晶體,在Bruker APEX-II CCD 單晶衍射儀于296.15 K的溫度下收集晶體數據。將收集的數據應用Olex 2 軟件解析結構。晶體數據見表1和部分鍵長、鍵角見表2。

表1 配合物1的晶體數據

表2 配合物1部分鍵長(?)和鍵角(°)

1.4 細胞毒性測試

在96孔板內加入180 μL含1×104個細胞的培養基,繼續培養6 h至細胞貼壁。加入20 μL 不同濃度的配合物1,繼續在恒溫箱內培養48 h。用排槍吸取10 μL噻唑藍(5 mg /mL) 溶液加至每孔內。4 h后,去除培養基后加入100 μL DMSO,振蕩10 min后,用酶標儀檢測吸光值。

1.5 線粒體膜電位實驗

將HepG2細胞種至6孔內,置入在恒溫箱培養內至細胞貼壁。然后在培養基中繼續加入配合物1。24 h后,用PBS洗滌細胞,繼續加入JC-1染色工作液于恒溫培養箱內染色20 min。染色結束后用熒光倒置顯微鏡觀察和拍照。

1.6 細胞內ATP檢測

細胞內ATP的檢測根據pCMV-Mito-AT1.03 Kit試劑盒 (碧云天生物技術有限公司,上海)的說明書操作。先將HepG2細胞種至6孔板內,細胞貼壁后加入配合物1繼續培養24 h。用PBS洗滌后,用pCMV-Mito-AT1.03轉染。最后,在共聚焦顯微鏡觀察細胞的熒光強度并拍照。

1.7 細胞凋亡檢測

通過Acridine Orange/ Ethidium Bromid(AO/EB)雙染法檢測配合物1對細胞凋亡的影響。將HepG2細胞種至6孔板內,培養至細胞貼壁。隨后加入配合物1繼續培養24 h。PBS洗滌后,用AO和EB染色。20 min后用PBS洗滌,最后用熒光倒置顯微鏡觀察和拍照。

2 結果與討論

2.1 配合物1的晶體結構

利用X-射線單晶衍射檢測得到了銦配合物的晶體結構。如圖2A所示,銦配合物的分子結構由一個配體、一個In3+、一個水分子和兩個Cl-組成。中心In3+處于六配位的配位環境中,分別與兩個Cl-(In1-Cl1 2.246 ?,In1-Cl2 2.516 ?)、水分子(In1-O1 2.287 ?)及配體上的兩個N原子(In1-N1 2.75 ?,In1-N2 2.23 ?)和一個S原子(In1-S2 2.526 ?)形成配位鍵,形成了略微扭曲的八面體(圖2B)。

圖2 (A)配合物1X-射線晶體結構圖;(B)銦離子的配位多面體圖

2.2 配合物1的抗腫瘤活性

應用MTT法檢測配合物1對不同癌細胞株(HepG2、MGC803和SKOV3)和正常肝細胞株HL-7702的細胞毒性。如表3所示,配體和銦離子的IC50值均大于30 μmol/L,表明二者對癌細胞株的毒性非常低。與其相反的是,配體與銦離子形成配合物之后展現出了良好的抗腫瘤活性,其IC50值為(1.43±0.15)～(4.97±0.24) μmol/L。其中,配合物對肝癌細胞株HepG2的活性優于胃癌細胞株MGC-803和卵巢癌細胞株SKOV3。與陽性對照順鉑相比,配合物1的體外抗腫瘤活性更優。此外,配合物1對正常細胞株HL-7702細胞毒性要低于三種癌細胞,這也表明配合物1在體外實驗中具有一定的選擇性。

表3 配合物1對不同細胞株48 h的IC50 值

2.3 配合物1誘導線粒體功能障礙

線粒體是內源性和外源性凋亡的重要靶點之一。各種死亡途徑的觸發始于線粒體功能障礙和死亡因子的釋放。許多金屬配合物已被證明會引起可測量的線粒體功能障礙并導致腫瘤細胞死亡[10-11]。基于此,配合物1孵育HepG2細胞24 h后,其線粒體膜電位的變化被檢測。如圖3所示,配合物1能夠有效引起線粒體膜電位下降,且呈劑量依賴關系,這表明線粒體功能障礙可能是配合物1誘導細胞死亡的重要通路之一。

(A)對照;(B)配合物1 (1.5 μmol/L);(C)配合物1 (3 μmol/L)。圖3 配合物1對線粒體膜電位的影響

2.4 配合物1降低HepG2細胞內ATP的含量

線粒體是細胞的能量工廠,對ATP的產生至關重要[12]。調節線粒體代謝是治療惡性腫瘤的一個潛在的靶點[13]。用pCMV-AT1.03(ATP熒光探針)轉染配合物1孵育后的HepG2細胞來觀察配合物1對癌細胞內ATP產生的影響。如圖4所示,配合物1孵育過的細胞熒光比對照明顯減弱,隨著配合物1的濃度增加熒光強度明顯減弱。這些結果表明配合物1可以有效地削弱HepG2細胞的線粒體能量代謝,進一步證實了線粒體功能障礙參與了配合物1的細胞毒性。

(A)對照;(B)配合物1 (1.5 μmol/L);(C)配合物1 (3 μmol/L)。圖4 配合物1降低HepG2細胞內ATP水平

2.5 配合物1誘導HepG2細胞凋亡

通過AO/EB雙染法檢測配合物1誘導HepG2細胞凋亡能力。結果如圖5所示,與對照組相比,配合物1處理組綠色熒光減弱,紅色熒光增加,且配合物1的濃度升高,紅色熒光增加更明顯,這表明配合物1能夠誘導HepG2細胞凋亡,且呈濃度依賴關系。

圖5 配合物1對HepG2細胞凋亡的影響

3 結論

以縮氨基硫脲和2-噻唑甲醛為配體合成并一個銦配合物,并通過X-射線單晶衍射儀解析了其結果,中心銦離子與配體中的N、S原子、H2O及2個Cl離子以六配位的方式形成配位。銦配合物在體外實驗中對三種不同的癌細胞株展現出了良好的抗腫瘤活性,其體外活性優于順鉑。此外,銦配合物通過誘導線粒體功能障礙并抑制細胞內ATP的產生,這很可能是銦配合物誘導腫瘤細胞的死亡的重要途徑之一。本文的研究為尋找下一代金屬抗腫瘤藥物提供了一定的理論基礎。