Lnc46198半番鴨胚胎期特異性表達及對鴨胚成纖維細胞增殖和凋亡的影響

李 麗 章琳俐 辛清武 繆中緯 朱志明 朱春紅 邱君志 黃勤樓 鄭嫩珠*

(1.福建省農業科學院 畜牧獸醫研究所/福建省畜禽遺傳育種重點實驗室,福州 350013;2.福建省農業科學院,福州 350013;3.中國農業科學院 家禽研究所,江蘇 揚州 225125;4.福建農林大學 生命科學學院,福州 350002)

半番鴨又稱騾鴨,是家鴨與番鴨的屬間雜交產物,具有很強的雜種優勢,如抗逆性強、生長速度快等,但半番鴨不育,沒有實際種用價值。若想獲得半番鴨苗,只能飼養其父母本并采用人工授精技術,但親本間自然交配受精率低,僅為15%～45%,極大限制了半番鴨產業發展。屬間雜交不育是一個非常復雜的性狀,其中雄性不育可表現為性腺發育缺陷,如精索或睪丸發育不全。除了父母本染色體差異及生理生化影響,半番鴨性腺發育可能由多個基因控制。因此半番鴨性腺發育異常研究可為探究屬間雜交不育機理提供理論參考依據。

長鏈非編碼RNA(Long non-coding RNA,lncRNA)雖未直接編碼蛋白,但可在多種生物學過程中發揮作用[1-4],并主要通過靶基因或miRNA途徑影響多種生物學過程,如Wang等[5]研究了雞卵巢中與性成熟雜種優勢相關的lncRNA和mRNA的系統圖譜。Jiang等[6]發現lncPGCR/miR-6577-5p/Btrc途徑可促進雞原始生殖細胞(Primordial germ cells,PGCs)生長發育。lncPGCAT-1靶向ILF3激活JNK信號通路可促進雞PGCs形成[7]。

前期研究中,李麗等[8]通過測序發現TCONS_00246198(簡稱lnc46198)在不育半番鴨性腺中特異性高表達,推測lnc46198可能靶向17β-HSD3基因抑制生殖細胞發育進而影響半番鴨胚胎期性腺發育。然而,尚未有lnc46198對鴨細胞分化發育調控機制的相關研究。因此,本研究擬測定lnc46198在半番鴨不同發育時期胚胎性腺中的表達規律及在半番鴨不同組織中表達情況,同時構建過表達載體初步分析lnc46198對鴨胚成纖維細胞的增殖和凋亡的影響,旨在探索lncRNA功能及對半番鴨性腺發育的影響,可為半番鴨生殖細胞發生機制提供基礎資料,為半番鴨種質創新提供指導。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

鴨胚成纖維細胞購自湖南豐暉生物科技有限公司,過表達載體(pcDNA3.1-3 Flag質粒)和MEM α購自美國英杰生命技術有限公司,Trypsin-EDTA(0.25%)、PlatinμmTMPCR SμperMix High Fidelity、GeneArt?Seamless Cloning and Assembly Enzyme Mix、LipofectamineTM 3000 Transfection Reagent、TRIzol?Plus RNA Purification Kit和SuperScriptTMIII First-Strand Synthesis SuperMix均購自美國賽默飛世爾科技公司,QIAqμick PCR &Gel Cleanμp Kit購自德國凱杰公司,感受態細胞DH5α購自上海唯地生物技術有限公司。

Power SYBR?Green PCR Master Mix購自德國應用生物系統公司,Cell Counting Kit-8購自日本同仁化學研究所,Annexin-V-FITC Apoptosis Detection Kit購自sigma-aldrich(上海)貿易有限公司,PowerUpTMSYBRTMGreen Master Mix購自德國應用生物系統公司,TUNEL BrightRed Apoptosis Detection Kit購自美國諾唯贊生物科技股份有限公司。

1.2 半番鴨鴨胚lnc46198特異性表達分析

收集番鴨和北京鴨人工授精獲得的半番鴨鴨胚,雌雄鑒定后選擇雄性樣本,在體視顯微鏡下采集雄性半番鴨10、15、20和25 d不同胚齡的性腺組織,同時采集12.5 d胚齡大腦、心臟、肝臟、肺臟、肌肉、腎臟和睪丸。提取總RNA,逆轉錄后cDNA貯存在-20 ℃備用。利用RT-qPCR技術測定半番鴨不同組織和不同時期lnc46198相對表達量。根據lnc46198測序序列,內參基因為GAPDH,引物序列:F:GGAGCTGCCCAGAACATTATC,R:GCAGGTCAGGTCCACGACA。采用Primer Premier 6.0和Beacon designer 7.8軟件設計定量PCR引物,由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。lnc46198引物序列:F1:CGGCTGATTCCGTTATGGGTAT,R1:CAGGGCTTCCTCCACCTTT,擴增長度98 bp,退火溫度60 ℃。20 μL反應體系:cDNA 1.0 μL,SDW 8.0 μL,Power SYBR?Green Master Mix 10.0 μL,正向引物/10 μmol/L 0.5 μL,反向引物/10 μmol/L 0.5 μL,反應條件:95 ℃ 1 min;95 ℃ 15 s,63 ℃ 25 s,40個循環。每個樣品重復3次,相對表達水平以2-ΔΔCt進行統計分析。

1.3 lnc46198-pcDNA3.1-3 Flag重組載體構建

以半番鴨性腺組織提取RNA,后逆轉錄成cDNA,以cDNA為模板設計引物,lncRNA-F和lncRNA-R為引物,引物序列:lncRNA-F:TTGGTACCGAGCTCGGATCCGTTAGATGATGTTTAGTTAGTTTAA,下劃線代表BamHI酶切位點,lncRNA-R:CTGTGCTGGATATCTGCAGAATTCCAGAAATAAGAGCCTGTTTAA,下劃線代表EcoRI酶切位點,擴增長度3 525 bp,退火溫度60 ℃。對lncRNA CDS序列進行PCR擴增獲得序列,50 μL擴增反應體系:SDW 1.0 μL,lncRNA-F (10 μmol/L) 1.0 μL,lncRNA-R (10 μmol/L) 1.0 μL,cDNA2.0 μL,Platinμm?PCR SμperMix,High Fidelity 45 μL,反應條件:預變性94 ℃,2 min,94 ℃,30 s,60 ℃,30 s,68 ℃,3.5 min,35個循環。In Fusion進行載體和目的片段的重組,PCR擴增產物采用QIAqμick PCR &Gel Cleanμp Kit進行切膠回收(具體參照試劑盒說明書),然后采用GeneArt?Seamless Cloning and Assembly Enzyme Mix進行重組載體的無縫克隆。lncRNA和pcDNA3.1-3 Flag融合10 μL反應體系:SDW 2.0 μL,lncRNA Purified product 2.0 μL,pcDNA3.1(BamHI/EcoRI)(50 ng)1.0 μL,GeneArt?2X Enzyme Mix 5.0 μL,反應條件:室溫放置20 min;冰上放置2～3 min,然后全部轉化感受態細胞DH5α,挑選單克隆菌落進行搖菌培養,篩選陽性菌液送生工生物工程(上海)股份有限公司進行重組載體測序。

1.4 鴨胚成纖維細胞轉染試驗

1.4.1鴨胚成纖維細胞培養和傳代

鴨胚成纖維細胞采用MEM α培養液(含10% FBS以及雙抗)進行復蘇,在37 ℃、5% CO2條件下進行培養至匯合度90%左右;加入Trypsin-EDTA(0.25%)進行消化,以5×105個/mL細胞密度接種6孔板進行傳代。

1.4.2lnc46198過表達質粒的細胞轉染

鴨胚成纖維細胞以5×105個/mL密度接種6孔板,在37 ℃、5% CO2孵育箱中過夜;待細胞匯合度約為70%時,換成新鮮完全培養液,按照LipofectamineTM 3000說明書分別轉染lnc46198-pcDNA3.1過表達質粒以及pcDNA3.1對照質粒,8 h后更換完全培養液;轉染48 h后收集細胞提取總RNA用于后續qPCR分析過表達效率。

1.5 RT-qPCR檢測lnc46198過表達效率

收集過表達后的DEF細胞和對照細胞,采用TRIzol?Plus RNA Purification Kit提取總RNA,由DNase I去除殘余的基因組DNA,然后按SuperScriptTMIII First-Strand Synthesis SuperMix說明書合成cDNA。以GAPDH為內參,采用PowerUp SYBRTM Green Master Mix試劑盒進行RT-qPCR擴增。引物序列:F2:CAAATCTAGGCAACACCACA,R2:CAGCAACAATCATAGGAGGC,擴增長度94 bp,退火溫度60 ℃。20 μL反應體系:cDNA 4.0 μL,SDW 5.0 μL,Power SYBR?Green Master Mix 10.0 μL,正向引物/10 μmol/L 0.5 μL,反向引物/10 μmol/L 0.5 μL,反應條件:95 ℃ 1 min;95 ℃ 15 s,63 ℃ 25 s,40個循環,每個試驗重復3次,每個樣品設置3個復孔,其相對表達量采用2-ΔΔCt法進行計算。

1.6 CCK8法檢測過表達lnc46198對鴨胚成纖維細胞增殖的影響

增殖和凋亡是細胞功能研究的2個基本的研究現象,且兩者也可以相互應驗。將轉染pcDNA3.1對照質粒以及lnc46198-pcDNA3.1過表達質粒24 h后的鴨胚成纖維細胞進行消化收集,細胞計數并調整細胞密度。按每孔2×103/100 μL細胞密度接種96孔板,待細胞貼壁后記為0 h,繼續培養48 h加入10 μL CCK8,在37 ℃、5% CO2條件下孵育2 h后用酶標儀檢測450 nm處的吸光值,每組均進行6復孔重復。

1.7 流式細胞術分析過表達lnc46198對鴨胚成纖維細胞細胞凋亡的影響

為確定過表達lnc46198對鴨胚成纖維細胞準確的凋亡率,本試驗將轉染pcDNA3.1對照質粒以及lnc46198-pcDNA3.1過表達質粒48 h后的鴨胚成纖維細胞進行消化收集,預冷PBS漂洗細胞2次。加入300 μL預熱的無EDTA-胰酶消化3～5 min,然后加入預熱 200 μL含血清培養基終止反應;同時加入500 μL PBS清洗殘余的細胞進入到2 mL離心管。離心(1 500 g,5 min),棄去上清;加入1 mL預熱PBS輕輕吹打重懸,離心同上;再次加入1 mL PBS重懸,離心同上。每管加入500 μL Binding Buffer,輕輕重懸細胞。先加入5.0 μL Annexin V-FITC和10 μL PI,顛倒混勻,室溫避光放置5～15 min,然后進行流式細胞分析。

2 結果與分析

2.1 lnc46198在半番鴨胚齡時期性腺和不同組織中的表達

lnc46198在半番鴨胚齡時期性腺中特異表達結果如圖1所示,結果表明,在所有檢測胚齡性腺中均出現表達,且隨著胚齡增加lnc46198在性腺中相對表達量有升高趨勢,表明lnc46198具有時間特異性。lnc46198在半番鴨12.5 d胚齡性腺和不同組織中特異性表達結果顯示(圖2),lnc46198在半番鴨12.5胚齡性腺中的表達量極顯著高于其他組織(P<0.01),推測lnc46198可能在鴨性腺中發揮作用。

(a)半番鴨不同胚齡性腺;(b)半番鴨不同組織。

M:DL5K DNA marker(100、250、500、750、1 000、2 000、3 000、5 000 bp)

2.2 lnc46198-pcDNA3.1-3 Flag重組載體構建

BamHI和EcoRI酶雙酶切割lncRNA片段,采用全基因合成,lnc46198全長插入到pcDNA3.1-3 Flag,lncRNA PCR擴增序列結果如圖2(a)所示,lnc46198 PCR擴增產物約3 525 bp。重組載體測序結果如圖2(b)所示,結果顯示重組載體含有序列與lnc46198一致,表明重組載體構建成功。

2.3 lnc46198過表達分析

對鴨胚成纖維細胞系進行培養和傳代,傳至第三代細胞。鴨胚成纖維細胞轉染lnc46198-pcDNA3.1-3 Flag過表達載體,轉染后48 h lnc46198過表達效率結果如圖3所示,與轉染對照組pcDNA3.1相比,lnc46198的表達水平上調了29.28倍(P<0.01),表明lnc46198過表達成功。

**P<0.01表示差異顯著。下同。

2.4 過表達lnc46198對鴨胚成纖維細胞增殖活力的影響

為探究lnc46198對鴨胚成纖維細胞的影響,轉染pcDNA3.1對照質粒以及lnc46198-pcDNA3.1過表達質粒,CCK8法檢測過表達lnc46198后鴨胚成纖維細胞的活力情況。結果顯示(圖4),與空白組以及pcDNA3.1組比較,過表達該lnc46198后,鴨胚成纖維細胞活力極顯著降低(P<0.01)。表明過表達lnc46198可抑制鴨胚成纖維細胞的增殖活力。

圖4 過表達lnc46198對鴨胚成纖維細胞增殖活力的影響

2.5 流式細胞分析過表達lnc46198對鴨胚成纖維細胞凋亡的影響

為探究lnc46198對鴨胚成纖維細胞凋亡的影響,鴨胚成纖維細胞轉染pcDNA3.1對照質粒以及lnc46198-pcDNA3.1過表達質粒,利用Annexin V-FITC流式檢測過表達lnc46198后鴨胚成纖維細胞的凋亡情況,結果顯示(圖5(a)),與pcDNA3.1對照組相比,過表達lnc46198后,鴨胚成纖維細胞凋亡增多,過表達組鴨胚成纖維細胞凋亡率是pcDNA3.1對照組的7.30倍(圖5(b),P<0.01),表明過表達lnc46198可促進鴨胚成纖維細胞凋亡。

(a)、(b)細胞凋亡散點圖;(c)細胞凋亡率。

3 討 論

大多數lncRNAs在組織分化發育過程中,都具有明顯的組織或時間表達特異性。Wichman等[9]研究表明lncRNA動態表達對小鼠精子發生和生育發揮潛在作用。lncRNAs失調可能造成雄性低精子數或不育癥。Liu等[10]研究發現lncRNA在城口山地雞胚胎中期E12的表達模式和其他時間點均不同。Bao等[11]發現雄性種系發育過程6個關鍵時間點lncRNA的動態表達調控。本研究對半番鴨胚胎不同發育時期性腺中lnc46198的表達量進行檢測分析,結果發現,在所有檢測胚齡性腺中lnc46198均有表達,且隨著胚齡增加lnc46198的表達量也逐漸升高,表明lnc46198具有較高的時間特異性。這與夏雪平等[12]研究一致,夏雪平等發現lncRNA 54770.30在黃鱔卵巢至精巢轉變過程中表達量呈上升趨勢,提示lncRNA 54770.30可能參與黃鱔性腺發育過程,lncRNA的表達規律可為研究其功能提供參考依據。同時,本研究還測定了lnc46198在半番鴨不同組織中的表達,結果顯示lnc46198在半番鴨性腺中的表達量極顯著高于其他組織,即在性腺中特異性表達,推測lnc46198可能在半番鴨性腺發育中發揮作用,這與前人的研究結果相近,如黃子妍等[13]認為MSTRG.15568.9與SPAG4基因具有較明顯的組織表達特異性,并靶向SPAG4基因參與雄性精子發生與精子活力調控;Jastrzebski等[14]則發現多個lncRNA在火雞輸精管、睪丸和附睪中表達,并認為其可能參與雄性性腺發育。以上研究結果提示lncRNA表達具有組織特異性。另外,本研究中lnc46198的時間和組織特異表達趨勢與繆中緯等[15]研究中17β-HSD3基因的組織特異性相近,二者表達模式一致,提示lnc46198可能與靶基因17β-HSD3共同參與生物學過程,如影響睪酮合成或睪丸間質細胞發育[16-18]。

Hu等[19]發現lncRNA TCONS_00814106可通過miR-1343調控豬顆粒細胞的增殖和凋亡,Wu等[20]認為lnc13814通過apla-miR-145-4途徑促進鴨顆粒細胞的凋亡,Liang等[21]研究也表明lncRNA在小鼠精子發生特定階段與基因表現出協同變化,上述研究均表明lncRNAs可通過miRNA或轉錄后水平調控基因功能。lncRNA可通過調控基因上游調控機制參與動物性腺或胚胎發育,Spga-lncRNA[22]和Gm2044[23]等研究發現關鍵lncRNA Gm2044可抑制小鼠精原細胞增殖進而參與小鼠精子發生過程。Zou等[24]認為lncRNAs的特異性劑量補償機制可能導致雞卵巢不對稱發育。Zhang等[25]發現lnc5926調控胚胎基因組激活基因(Embryonic genome activation,EGA)表達進而影響山羊早期胚胎發育。因lnc46198為新篩選的未知lncRNA,需根據靶基因功能預測lncRNA功能,本研究中lnc46198靶基因為17β-HSD3,研究表明17β-HSD3基因是類固醇激素合成途徑中的關鍵基因,其對睪丸激素合成和雄性繁育性狀至關重要[26-27],若缺陷可能造成性腺發育障礙[28-30],因而推測lnc46198靶向17β-HSD3基因參與半番鴨性腺發育。lncRNA異常表達則可影響細胞增殖、分化或凋亡作用,本研究過表達lnc46198后發現其可抑制鴨胚成纖維細胞增殖活力,并促進鴨胚成纖維細胞凋亡,進一步驗證了lnc4619抑制細胞增殖的作用。Hu等[31]認為lncRNA-Gm2044在轉基因小鼠精原細胞中過表達不會影響睪丸形態和生育能力,但會阻斷精子生成,并可作為診斷不育的分子靶標。Liang等[32]研究認為過表達lncRNA-Gm2044或敲除miR-335-3p可以降低轉錄因子A-MYB對突觸復合體蛋白1基因(Synaptonemal complex protein 1,SYCP1)表達和細胞增殖的影響。同時,lncRNA還可能影響其他類型細胞的增殖或凋亡活動,Sun等[33]研究表明lnc90386敲除可顯著抑制雞胚成纖維細胞凋亡和炎癥因子,并促進雞胚成纖維細胞增殖。楊光等[34]發現了一條新的lncRNA lncbMD,結果表明干擾lncbMD后能夠促進牛骨骼肌衛星細胞的增殖,孟珊等[35]通過干擾試驗發現豬肌肉組織中顯著高表達的lncRNA-6617可促進豬肌內前體脂肪細胞分化,上述研究與本研究結果均表明干擾、過表達或敲除lncRNA可影響細胞活動,但其作用方式不盡相同。本研究初步分析lnc46198對細胞增殖或凋亡的作用,然而,lnc46198對生殖細胞分化、精子發生及減數分裂的作用機制尚不清楚,后續將分析lnc46198表達水平與半番鴨胚胎性腺發育異常之間的效應關系,以進一步確定lnc46198靶向17β-HSD3在鴨生殖細胞增殖或分化過程中的功能,可為lncRNA對半番鴨生殖細胞分化發育作用機制提供參考依據,對半番鴨不育研究具有重要意義。

4 結 論

lnc46198在不同胚齡半番鴨性腺中動態表達,在半番鴨12.5 d胚齡性腺中特異性高表達,并抑制鴨胚成纖維細胞增殖,促進鴨胚成纖維細胞凋亡,可為lncRNA對鴨生殖細胞分化發育作用機制提供科學參考依據。