晚期NSCLC放療前后血清circPVT1和miR-486-5p水平變化及臨床意義

張天偉　張金標　張燕　明匯　張鵬　聶東

摘要：目的 探討晚期非小細胞肺癌（NSCLC）患者放療前后血清環狀RNA漿細胞瘤轉化遷移基因1（circPVT1）、微小RNA-486-5p（miR-486-5p）水平變化及對放療療效的評估價值。方法 研究納入137例晚期NSCLC患者作為NSCLC組，另選取健康體檢者140例作為對照組。采用實時熒光定量PCR（qPCR）檢測血清circPVT1、miR-486-5p表達水平，比較放療前后及不同放療療效患者血清circPVT1和miR-486-5p水平；受試者工作特征（ROC）曲線分析血清circPVT1、miR-486-5p水平對放療療效的診斷價值。結果 與對照組相比，NSCLC組放療前血清circPVT1表達水平升高，miR-486-5p表達水平降低（P＜0.05）；經Targetscan在線分析顯示，circPVT1與miR-486-5p有靶向關系；鱗癌與腺癌NSCLC患者放療前血清circPVT1、miR-486-5p表達水平比較差異無統計學意義（P＞0.05）；與TNM分期Ⅲ期患者相比，Ⅳ期患者血清circPVT1表達水平升高，miR-486-5p表達水平降低（P＜0.05）；與放療前相比，放療后患者血清circPVT1表達水平降低，miR-486-5p表達水平升高（P＜0.05）。與放療有效組相比，無效組放療前和放療后血清circPVT1表達水平升高，miR-486-5p表達水平降低（P＜0.05）；與放療前相比，放療有效組和無效組在放療后均顯示血清circPVT1水平降低，而miR-486-5p水平升高（P＜0.01）。血清circPVT1、miR-486-5p聯合診斷放療無效的AUC為0.918（95%CI：0.859～0.958），敏感度為80.65%，特異度為88.00%，聯合診斷效能優于單獨診斷。結論 血清circPVT1、miR-486-5p水平對晚期NSCLC放療療效有一定評估價值。

關鍵詞：癌，非小細胞肺；RNA，環狀；化放療；環狀RNA漿細胞瘤轉化遷移基因1；微小RNA-486-5p

中圖分類號：R734.2文獻標志碼：ADOI：10.11958/20230346

Changes and clinical significance of serum circPVT1 and miR-486-5p levels before and after radiotherapy for advanced NSCLC

ZHANG Tianwei， ZHANG Jinbiao ZHANG Yan， MING Hui， ZHANG Peng， NIE Dong

Department of Tumor Blood Radiotherapy， Zibo 148th Hospital， Zibo 255300， China

Corresponding Author E-mail： zjb20220620@126.com

Abstract： Objective To investigate changes of serum levels of circulating RNA plasmacytoma variant translocation 1 （circPVT1） and microRNA-486-5p （miR-486-5p） before and after radiotherapy in patients with advanced non-small cell lung cancer （NSCLC） and their evaluation value for radiotherapy efficacy. Methods A total of 137 patients with advanced NSCLC were selected as the NSCLC group， and 140 health examination personnel in our hospital were selected as the control group. Real-time fluorescence quantitative PCR （RT-qPCR） was applied to detect serum expression levels of circPVT1 and miR-486-5p. Serum levels of circPVT1 and miR-486-5p before and after radiotherapy were compared. Receiver operating characteristic （ROC） curve was applied to analyze the diagnostic value of serum circPVT1 and miR-486-5p levels for radiotherapy efficacy. Results Compared with the control group， the serum expression level of circPVT1 was obviously higher before radiotherapy in the NSCLC group， and the expression level of miR-486-5p was obviously lower （P＜0.05）. According to Targetscan online analysis， circPVT1 had a targeted relationship with miR-486-5p. There were no significant differences in serum expression levels of circPVT1 and miR-486-5p before radiotherapy between patients with squamous cell carcinoma and adenocarcinoma NSCLC （P＞0.05）. Compared with TNM stage Ⅲ group， the serum expression level of circPVT1 was obviously higher in patients with stage IV NSCLC， and serum expression level of miR-486-5p was obviously lower （P＜0.05）. The serum expression level of circPVT1 was obviously lower in patients after radiotherapy than that before radiotherapy， and the expression level of miR-486-5p was obviously higher （P＜0.05）. Compared with the effective radiotherapy group， the serum expression level of circPVT1 was increased and the expression level of miR-486-5p was decreased before and after radiotherapy in the ineffective group （P＜0.05）. Compared with before radiotherapy， both the effective and ineffective radiotherapy groups showed a decreased serum circPVT1 level and an increased miR-486-5p level after radiotherapy （P＜0.05）. The AUC （95%CI： 0.859-0.958） of combined diagnosis of serum circPVT1 and miR-486-5p was 0.918， the sensitivity was 80.65% and the specificity was 88.00%. The combined diagnosis was better than single diagnosis （Z=2.06， 2.024， P＜0.05）. Conclusion Serum levels of circPVT1 and miR-486-5p have certain value in evaluating the efficacy of radiotherapy for advanced NSCLC.

Key words： carcinoma， non-small-cell lung; RNA， circular; chemoradiotherapy; cyclic RNA plasmacytoma variant translocation 1; micro RNA-486-5p

非小細胞肺癌（NSCLC）是肺癌的主要病理類型，除少數早期患者可通過手術治療外，多數患者采用放療、化療或兩者相結合的治療方式。雖然NSCLC的治療取得一定進步，但患者預后存在較大差異，因此尋找與預后相關的分子標志物對臨床指導治療具有重要意義。環狀RNA漿細胞瘤轉化遷移基因1（circPVT1）是一種環狀RNA，在肺癌、鼻咽癌等多種腫瘤中呈高表達，其通過調控靶基因表達，促進腫瘤生長與轉移［1-2］。研究顯示，在NSCLC細胞中，沉默circPVT1表達可通過上調miR-1208表達增強NSCLC細胞的放射敏感性［3］，提示circPVT1與NSCLC的放療有關。經Targetscan在線分析顯示，circPVT1與miR-486-5p有靶向結合位點，miR-486-5p在NSCLC中呈低表達，發揮抑癌基因的作用［4］。研究顯示，大蒜素通過上調miR-486-5p表達，抑制肺癌細胞增殖、侵襲，增強細胞對X線的敏感性［5］。本研究探討circPVT1、miR-486-5p與NSCLC放療療效的相關性，為NSCLC的治療提供參考。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選擇2020年9月—2022年6月在淄博一四八醫院進行治療的137例晚期NSCLC患者作為NSCLC組，其中男83例，女54例，年齡42～75歲，平均（57.56±8.05）歲，病理類型腺癌75例，鱗癌62例，根據國際抗癌聯盟（UICC）第8版肺癌TNM分期，Ⅲ期81例，Ⅳ期56例。納入標準：（1）患者均經病理診斷為原發性NSCLC，TNM分期Ⅲ—Ⅳ期。（2）不符合手術治療指征，無放療禁忌證。（3）入組前1個月內未接受放化療及免疫治療。排除標準：（1）合并其他惡性腫瘤患者。（2）嚴重器質性疾病患者。（3）重度貧血、自身免疫性疾病患者。（4）精神疾病或認知障礙者。選擇同期在本院健康體檢者140例作為對照組，其中男77例，女63例，年齡45～78歲，平均（58.34±10.05）歲。2組性別（c2=0.885）、年齡（t=0.715）比較差異無統計學意義（P＞0.05）。本研究通過醫院倫理委員會批準（倫理號：ysbyy202316）。

1.2 方法

1.2.1 治療 采用新華醫療器械有限公司的醫用電子直線加速器（型號：600E）進行放療，定位CT為國產64排螺旋CT，采用常規放療方案，按照腫瘤靶區（GTV）、臨床靶區（CTV）及計劃靶區（PTV）設置3～5個照射區，放射源為6 MV X線，每次2～3 Gy，每周5次，放療周期4～6周，總劑量60～70 Gy，放療結束后觀察4周評價治療效果。

1.2.2 療效評估 參照實體瘤療效評價標準RECIST指南，分為完全緩解（CR）、部分緩解（PR）、疾病穩定（SD）與疾病進展（PD）；有效=CR+PR。

1.2.3 實時熒光定量PCR（qPCR）檢測血清circPVT1、miR-486-5p表達 采集患者放療前及放療后4周空腹靜脈血5 mL，對照組采集體檢當天空腹靜脈血5 mL，3 000×g離心20 min，分離血清，-70 ℃冰箱保存。使用Trizol試劑（北京百奧萊博科技有限公司）提取血清總RNA，并用PrimeScript RT-PCR試劑盒（日本TaKaRa公司公司）反轉錄。使用分光光度計分析RNA濃度與純度后，取1 μg RNA使用qPCR檢測試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）進行PCR擴增，反應體系50 μL，其中Taq/RTase Mix Ⅱ 2 μL，2×One Step RT-PCR Buffer 25 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各1 μL，加雙蒸水至50 μL。反應條件：45 ℃反轉錄30 min，94 ℃預變性2 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個循環；72 ℃終延伸5 min。circPVT1、miR-486-5p及內參引物購自生工生物工程（上海）股份有限公司。circPVT1引物：上游5′-GGTTCCACCAGCGTTATTC-3′，下游5′-CAACTTCCTTTGGGTCTCC-3′；miR-486-5p引物：上游5′-ACACTCCAGCTGGGTCCTGTACTGAGCTGCCCCGAG-3′，下游5′-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3′；GAPDH引物：上游5′-GAGTCAACGGATTTGGTCGTT-3′，下游5′-TTGATTTTGGAGGGATCTCG-3′；U6引物：上游5′-CTCGCTTCGGCAGCACAT-3′，下游5′-TTTGCGTGTCATCCTTGCG-3′。PCR反應結束后，分別以GAPDH、U6為內參，采用2-ΔΔCt法計算circPVT1、miR-486-5p相對表達量。

1.3 統計學方法 采用SPSS 25.0軟件進行數據分析，實驗數據符合正態分布的用x±s表示，2組間比較采用獨立樣本t檢驗，配對樣本采用配對t檢驗；計數資料使用例（%）表示，組間比較采用χ²檢驗；受試者工作特征（ROC）曲線分析血清circPVT1、miR-486-5p水平對放療療效的診斷價值。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 對照組與NSCLC患者血清circPVT1、miR-486-5p表達水平比較 與對照組比較，NSCLC組放療前血清circPVT1表達水平顯著升高，miR-486-5p表達水平顯著降低（P＜0.01）。與放療前比較，放療后患者血清circPVT1表達水平降低（P＜0.01），miR-486-5p表達水平升高（P＜0.01）。見表1。

2.2 circPVT1與miR-486-5p靶向關系 經Targetscan在線分析顯示，circPVT1與miR-486-5p具有靶向關系，見圖1。

2.3 NSCLC患者放療前不同病理類型與分期血清circPVT1、miR-486-5p表達水平比較 鱗癌與腺癌NSCLC患者放療前血清circPVT1和miR-486-5p表達水平比較差異無統計學意義（P＞0.05）；與TNM Ⅲ期患者比較，Ⅳ期患者血清circPVT1表達水平升高，miR-486-5p表達水平降低（P＜0.01），見表2。

2.4 NSCLC放療不同療效血清circPVT1、miR-486-5p表達水平比較 137例患者中，CR患者3例（2.2%），PR患者72例（52.6%），SD患者18例（13.1%），PD患者44例（32.1%），放療近期總有效患者75例（54.7%），無效患者62例（45.3%）。與放療有效組相比，無效組放療前和放療后血清circPVT1表達水平升高，miR-486-5p表達水平降低（P＜0.05）；與放療前相比，放療后的有效組和無效組中血清circPVT1表達水平降低，miR-486-5p表達水平升高（P＜0.05），見表3。

2.5 放療前血清circPVT1、miR-486-5p水平對放療療效的診斷價值 放療前血清circPVT1、miR-486-5p及兩者聯合診斷放療無效的ROC曲線見圖1；曲線下面積（AUC）、截斷值、敏感度、特異度及約登指數見表4；聯合診斷效能優于單獨診斷（Z分別為2.006和2.024，P＜0.05）。

3 討論

NSCLC為常見的惡性腫瘤，晚期NSCLC患者的5年生存率不到20%［6］，放療作為不能手術NSCLC患者的一種治療手段，可延長患者生存期，改善預后。由于受多種因素影響，患者放療后療效差異較大，因此有效評估放療療效有利于制定個體化治療方案，改善患者預后［7-8］。

circRNA通過吸收miRNA靶向調節基因表達，參與調節細胞增殖、血管生成、能量代謝等多種過程，參與腫瘤的發生發展及耐藥性。研究顯示，circRNA可在外周血和組織液中穩定表達，可能是腫瘤鑒別診斷、判斷療效與評估預后的標志物［9］。circPVT1在NSCLC［3］、胃癌［10］、乳腺癌［11］、甲狀腺癌［12］等多種腫瘤中表達水平升高，發揮促癌基因的作用，抑制其表達可抑制腫瘤細胞增殖與侵襲，從而抑制腫瘤生長。研究顯示，circPVT1在肺鱗狀細胞癌患者組織、細胞及血清中表達上調，circPVT1作為miR-30d和miR-30e的競爭性內源性RNA調節細胞周期蛋白F表達，促進肺鱗狀細胞癌的進展［13］。本研究經Targetscan在線分析顯示，circPVT1與miR-486-5p存在靶向結合位點。miR-486-5p在肺癌［14］、乳腺癌［15］、結直腸癌［16］等腫瘤中表達下調，過表達miR-486-5p可抑制腫瘤細胞增殖與遷移。本研究結果顯示，NSCLC患者血清circPVT1表達水平高于對照組，miR-486-5p表達水平低于對照組，且與Ⅲ期患者比較，Ⅳ期患者血清circPVT1表達水平升高，miR-486-5p表達水平降低，與前文報道結果類似［3，14］，提示circPVT1、miR-486-5p與NSCLC的發生發展密切相關。

有研究顯示，circPVT1、miR-486-5p在腫瘤細胞放療、化療耐藥中起著重要作用［17］。circPVT1與NSCLC患者腫瘤分化程度或TNM分期及不良預后相關，經順鉑聯合吉西他濱化療后，circPVT1表達降低，且化療耐藥患者的circPVT1表達高于化療敏感患者［18］。在結腸癌中，lncRNA PVT1通過調控miR-486-5p/CDK4軸促進結腸癌細胞對5-FU的耐藥性［19］。本研究結果顯示，放療后患者血清circPVT1表達水平低于放療前，miR-486-5p水平高于放療前，且與放療有效組相比，放療無效組血清circPVT1表達水平升高，miR-486-5p表達水平降低，提示檢測血清circPVT1、miR-486-5p水平可反映化療效果，對NSCLC的治療有一定指導意義。分析其可能的原因是，高水平circPVT1和低水平miR-486-5p促進NSCLC的進展，影響化療效果。本研究通過ROC曲線分析發現，血清circPVT1、miR-486-5p聯合診斷放療無效的AUC為0.918，敏感度為80.65%，特異度為88.00%，聯合診斷效能優于單獨診斷，提示檢測血清circPVT1、miR-486-5p水平對NSCLC患者化療療效評估有一定價值，對臨床制定NSCLC的治療方案具有一定指導意義。

綜上所述，NSCLC患者血清circPVT1表達水平升高，miR-486-5p表達水平降低，與晚期NSCLC患者放療療效有關，兩者聯合對放療療效有一定評估價值，可能成為評估化療療效的標志物。

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（2023-03-15收稿 2023-05-13修回）

（本文編輯 李鵬）