梗阻性無精子癥患者不同來源精子ICSI助孕前藥物療效及安全性分析

陳其桂　李大文　成俊萍　黃泰帥

摘要：目的 探討梗阻性無精子癥（OA）患者不同來源精子行卵胞質內單精子注射（ICSI）前予左卡尼汀治療效果、安全性及對助孕結局的影響。方法 141例OA患者口服左卡尼汀治療3個月后，分別采用睪丸精子抽吸術（TESA）、經皮附睪精子抽吸術（PESA）獲取精子，根據精子來源不同分為TESA組（78例）和PESA組（63例），均行ICSI助孕。比較2組患者的基線資料、精子質量、胚胎發育及臨床結局。結果 2組OA患者予左卡尼汀治療3個月后精子DNA斷裂率（DFI）和自發頂體反應率均低于治療前，頂體完整率高于治療前（P＜0.05）；2組間精子DFI、頂體完整率及自發頂體反應率差異均無統計學意義（P＞0.05）。2組配偶ICSI受精率、2PN受精率、卵裂率、優胚率、種植率、臨床妊娠率、活產率、早產率、流產率及新生兒畸形率差異均無統計學意義（P＞0.05）。共獲103個新鮮移植周期，989枚MII卵，受精卵子數773個，臨床妊娠49例，活產分娩39例（其中TESA組17例，PESA組22例）。出生后3個月隨訪發現，TESA組1例新生兒患有心臟畸形，其余新生兒均無畸形。結論 OA患者行TESA-ICSI及PESA-ICSI助孕前予左卡尼汀治療均可優化精子質量，改善臨床結局，且用藥安全。

關鍵詞：梗阻性無精子癥；睪丸精子；附睪精子；左卡尼汀；妊娠結局

中圖分類號：R699文獻標志碼：ADOI：10.11958/20221780

Analysis of the drug efficacy and safety before ICSI from different sources of sperm in

patients with obstructive azoospermia

CHEN Qigui LI Dawen CHENG Junping HUANG Taishuai

1 Department of Andrology， the Reproductive Hospital of Guangxi Zhuang Autonomous Region， Nanning 530000， China;

2 Center for Reproductive Medicine and Genetics， People's Hospital of Guangxi Zhuang Autonomous Region

Corresponding Author E-mail： Lidawendavid@aliyun.com

Abstract： Objective To investigate the efficacy， safety and the influence on pregnancy outcome of L-carnitine before intracytoplasmic sperm injection （ICSI） from different sources of sperm in patients with obstructive azoospermia （OA）. Methods A total of 141 patients with OA were treated with L-carnitine for three months， and sperms were obtained by testicular sperm aspiration （TESA） and percutaneous epididymal sperm aspiration （PESA） respectively. According to the source of sperm， they were divided into the two groups： the TESA group （n=78） and the PESA group （n=63）. The general clinical data， sperm quality， embryonic development and clinical outcome of the two groups were compared. Results In the TESA/PESA group， sperm DFI and sperm spontaneous acrosome reaction rate were significantly lower than those before treatment， and sperm acrosome integrity rate was significantly higher than that before treatment （P＜0.05）. There were no significant differences in sperm DFI， sperm acrosome integrity rate and sperm spontaneous acrosome reaction rate between the two groups（P＞0.05）. There were no significant differences in the fertilization rate， 2PN fertilization rate， cleavage rate， excellent embryo rate， implantation rate， clinical pregnancy rate， live birth rate， premature birth rate， abortion rate and neonatal malformation rate between the two groups （P＞0.05）. A total of 103 fresh transplant cycles， 989 MII oocytes， 773 zygotes， 49 clinical pregnancies and 39 live births were obtained （including 17 in the TESA group and 22 in the PESA group）. During a 3-month follow-up after birth， it was found that one newborn had cardiac abnormalities in the TESA group， while the other newborns had no abnormalities. Conclusion In OA patients， L-carnitine before TESA-ICSI and PESA-ICSI can improve the sperm quality， optimize clinical outcome， and the medication is safe.

Key words： obstructive azoospermia; testicular sperm; epididymal sperm; L-carnitine; pregnancy outcome

無精子癥在患有不育癥的育齡夫婦中約占5%，其中梗阻性無精子癥（obstructive azoospermia，OA）約占40%，是男性不育的主要原因之一［1］。OA患者精液中無精子，但精子發生不受干擾。卵胞質內單精子注射（intracytoplasmic sperm injection，ICSI）是輔助生殖技術中最常用的治療方式［2］。睪丸精子抽吸術（testicular sperm aspiration，TESA）和經皮附睪精子抽吸術（percutaneous epididymal sperm aspiration，PESA）操作簡單方便，是常用的兩種取精方法［3］。目前，ICSI聯合睪丸或附睪精子助孕是OA患者的首選治療方法。精子來源（睪丸精子或附睪精子）是影響ICSI結局的重要因素之一，精子質量下降對受精和胚胎發育均不利。由于OA患者受慢性生殖系統炎癥影響，通過穿刺所獲得的睪丸、附睪精子質量往往不高，從而影響妊娠結局。左卡尼汀可調控脂質代謝，改善細胞代謝異常，提高精子質量。但是，生殖中心臨床醫師常忽視在ICSI助孕前進行精子質量評估，亦未常規使用藥物治療以改善精子質量，導致ICSI助孕后受精率、妊娠率低下，臨床結局不佳，甚至出現周期失敗。本研究通過分析OA患者不同來源精子功能質量，評估助孕前藥物干預療效及安全性，以期為改善臨床助孕結局提供參考。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選擇2014年1月—2019年12月于廣西壯族自治區人民醫院生殖醫學與遺傳中心就診的OA患者。OA診斷標準：（1）3次或3次以上精液常規檢查，并經離心確認，精子數為零。（2）雙側睪丸體積＞30 mL或單側體積＞15 mL。（3）血卵泡刺激素（follicle stimulating hormone，FSH）正常。（4）睪丸活檢證實有精子。納入標準：（1）配偶年齡＜38歲。（2）夫婦雙方染色體未見異常。（3）超排卵用藥方案為長方案。（4）配偶生育力正常或單純為輸卵管、盆腔因素導致不孕。排除標準：（1）服用抑制生精藥物。（2）夫婦雙方生殖系統感染、生殖器發育異常等。（3）吸煙、酗酒或吸毒等。納入符合以上條件的141對夫婦，不育年限［3（2，5）］年，男方年齡［31.00（28.50，34.00）］歲，男方體質量指數（BMI）（23.97±3.01）kg/m2，配偶年齡（29.57±3.85）歲，配偶BMI［21.00（18.88，23.03）］kg/m2。患者均予左卡尼汀口服液（東維力，東北制藥，10 mL，口服，每日3次）治療，分別采用TESA（TESA組，78例）、PESA（PESA組，63例）在左卡尼汀治療前及治療3個月后獲取精子，由男科實驗室檢測精子DNA斷裂率（DNA fragmentation index，DFI）、頂體完整率及自發頂體反應率，并行ICSI助孕。

1.2 研究方法

1.2.1 促排卵及采卵

采用促性腺激素釋放激素激動劑（gonadotrophin releasing hormone agonist，GnRH-a）長方案促排卵。配偶自使用促性腺激素（gonadotrophin，Gn）4 d后開始B超監測卵泡發育，當有2個卵泡直徑＞18 mm時，于當日21：00左右給予人絨毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin，HCG）10 000 IU肌內注射，給藥36 h后行經陰道超聲穿刺取卵。

1.2.2 TESA

患者取仰臥位，常規消毒鋪巾，局麻滿意后，予F14號半自動活檢針（蘇州市立普醫療科技有限公司）抽出睪丸少量曲細精管，隨后放入培養皿中，內含精子洗滌液。搗碎曲細精管組織并操作倒置顯微鏡找尋可用的活動精子。如果觀察不到精子，可進行重復多點針刺活檢。

1.2.3 PESA

患者取仰臥位，常規消毒鋪巾，局麻滿意后，使用含精子洗滌液的5 mL無菌注射器經皮穿刺一側附睪，抽吸附睪液送檢。若無附睪液，則改變穿刺方向反復抽吸。采用倒置顯微鏡找尋活動精子，如果有足量的活動精子滿足ICSI治療，操作結束；否則穿刺另一側附睪。

1.2.4 睪丸體積測量

患者取仰臥位，選用睪丸體積測量器［弗安（上海）企業發展有限公司］，醫師將測量器的不同型號與睪丸相對比確定睪丸體積，注意需將睪丸置于陰囊皮膚最薄處進行觀察。

1.2.5 FSH、黃體生成素（LH）、睪酮水平檢測

采用cobas e801免疫測定分析儀（羅氏診斷有限公司）進行檢測。男性患者勿劇烈運動，早上空腹檢查；女性患者于月經周期第3～5天早上空腹檢測。

1.2.6 竇卵泡數

配偶于降調前1～2個月的月經周期第2～4天檢查，排空膀胱與直腸后取截石位，采用邁瑞DC-N6彩色超聲診斷儀（探頭頻率6.5～9.0 MHz），經陰道超聲連續縱切及橫切掃查完整卵巢，并記錄雙側卵巢中所有直徑為2～9 mm的卵泡數量，即竇卵泡數。

1.2.7 HCG日子宮內膜厚度

配偶于HCG注射日檢查，排空膀胱與直腸后取截石位，采用邁瑞DC-N6彩色超聲診斷儀（探頭頻率5.0～9.0 MHz），經陰道超聲對子宮進行多切面掃查，取子宮正中矢狀縱切面，在垂直于宮腔線的方向測量子宮中央兩條外側腔回聲線之間的厚度，即子宮內膜厚度。

1.2.8 精子染色質擴散試驗檢測DFI

試劑：精子DNA完整性檢測試劑盒（SCD）halosperm?（西班牙halotech公司）；瑞氏-姬姆薩染色液（珠海貝索生物技術有限公司）。操作步驟：將獲得的精子置于4孔皿，密度稀釋為（5～10）×10⁶個/mL，使用精子DNA完整性檢測試劑盒完成變性、孵育、固定、風干步驟后，使用瑞氏-姬姆薩染色液染色，最后使用顯微鏡（×400），配合血球分類計數器（XK06-2，江蘇新康醫療器械有限公司）進行人工判別，計數200條以上精子。按照精子染色暈圈直徑與精子核直徑的比值將精子暈圈分為5個等級：1，大暈圈（>1）；2，中等暈圈（1/3～1）；3，小暈圈（<1/3）；4，無暈圈；5，精子頭部不著色。計算每個等級的百分比，DFI為3—5等級百分比之和。

1.2.9 精子頂體完整率及自發頂體反應率

采用豌豆凝集素（FITC-PSA）熒光染色法檢測。試劑：FITC標記的PSA、磷酸鹽緩沖液（PBS，pH=7.4）。操作步驟：將獲得的精子置于Eppendorf管（內含PSA儲存液，PBS溶解FITC標記的PSA制成），取處理后的精子涂抹于載玻片上自然干燥，將載玻片予95%乙醇固定后迅速干燥，干燥完畢后置于PSA工作液中，4 ℃避光反應8～12 h，置于450～490 nm激發光下于油鏡（×400）觀察涂片。判讀方法：頂體區域占精子頭部40%～70%，正常精子頂體在熒光顯微鏡下有一致且明亮的熒光，認為屬于頂體完整；僅精子頭部赤道板附近有明亮帶狀熒光者屬于發生自發反應后的頂體。計數200條以上精子，統計頂體完整精子數、自發頂體發生數。頂體完整率=頂體完整精子數/檢測精子總數×100%；自發頂體發生率=自發頂體發生數/檢測精子總數×100%。

1.2.10 受精、卵裂、胚胎移植及妊娠情況

配偶于ICSI后第1天觀察卵子受精情況，以雙原核（2PN）卵子作為正常受精卵。第3天按照Peter分級標準［4］選擇優質胚胎進行移植，移植胚胎數≤2個，剩余Ⅲ級以上胚胎冷凍保存，并同時予黃體支持。

1.2.11 妊娠判定及隨訪

配偶于移植胚胎后第14天測血β-HCG水平，若陽性則確定妊娠。分別于第28、42天行B超檢查胚胎發育情況，若B超見宮腔內孕囊及心管博動則確定臨床妊娠。黃體支持自妊娠8周起逐漸減量至妊娠10周停用，隨訪至妊娠12周。電話隨訪記錄妊娠結局。

1.2.12 計算指標

受精率=受精卵子數/第2次減數分裂中期的卵母細胞（MII卵子）數×100%；雙原核（2PN）受精率=2PN卵子數/MII卵子數×100%；卵裂率=卵裂數/受精卵子數×100%；優胚率=優質胚胎數/2PN卵裂數×100%；種植率=孕囊數/移植胚胎數×100%；臨床妊娠率=臨床妊娠例數/移植周期例數×100%；活產率=活產分娩數/移植周期例數×100%；早產率=臨床早產例數/臨床妊娠例數×100%；流產率=臨床流產例數/臨床妊娠例數×100%；新生兒畸形率=新生兒畸形數/出生嬰兒數×100%。

1.3 統計學方法

采用SPSS 22.0軟件進行數據分析。符合正態分布的計量資料以均數±標準差（x±s）表示，2組間比較采用獨立樣本t檢驗，組內比較采用配對樣本t檢驗；非正態分布的計量資料以M（P₂₅，P₇₅）表示，2組間比較采用Mann-Whitney U檢驗，組內比較采用Wilcoxon符號秩檢驗。計數資料以例（%）表示，組間比較采用χ²檢驗或Fisher確切概率法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 TESA組與PESA組患者一般情況比較

2組患者不育年限、年齡、睪丸體積、睪酮、FSH及BMI差異均無統計學意義（P＞0.05），見表1。2組患者配偶的年齡、基礎FSH、基礎LH、竇卵泡數、HCG日子宮內膜厚度、獲卵數及BMI差異均無統計學意義（P＞0.05），見表2。

2.2 2組患者精子DFI、頂體完整率及自發頂體反應率比較

見表3。2組OA患者予左卡尼汀治療3個月后精子DFI和自發頂體反應率均低于治療前，頂體完整率高于治療前（P＜0.05）；2組間精子DFI、頂體完整率及自發頂體反應率差異均無統計學意義。

2.3 2組ICSI后胚胎發育及妊娠結局比較

2組配偶ICSI受精率、2PN受精率、卵裂率、優胚率、種植率、臨床妊娠率、活產率、早產率、流產率及新生兒畸形率差異均無統計學意義，見表4。

2.4 ICSI周期胚胎發育及妊娠結局

共獲103個新鮮移植周期，989枚MII卵，受精卵子數773個，臨床妊娠49例，活產分娩39例（其中TESA組17例，PESA組22例）。出生后3個月隨訪發現，TESA組1例新生兒患有心臟畸形，其余新生兒均無畸形。

3 討論

OA是由先天性雙側輸精管缺如、生殖道感染或創傷性因素等引起的輸精功能障礙。生殖道的任一位置均可出現梗阻，其典型特征是精子發生正常。OA病因多種，常見為泌尿生殖系統感染，可能導致單側或雙側梗阻［5］。OA的臨床治療取決于病因，并考慮配偶因素，包括顯微手術重建或取精行ICSI。在無法顯微外科重建或重建失敗的情況下，取精行ICSI是更可行的解決方案。

左卡尼汀，別稱肉堿或肉毒堿，是生物活性的立體異構體，以一種高度極性的小兩性離子的形式存在。左卡尼汀是一種有效的抗氧化劑，可減輕活性氧和自由基誘導的氧化應激的影響，且副作用非常小。人體組織分布研究表明，在成熟精子和附睪中存在高濃度的左卡尼汀，其作為轉運的重要輔助因子，通過將脂肪酸和磷脂等輸送到線粒體中進行β氧化供能，維持細胞能量代謝［6］；其亦可抑制睪丸內生殖細胞的凋亡，改善精子參數［7］；且其在卵母細胞成熟、精子-卵子結合和胚胎發育中具有重要作用［8］。本研究探討了OA患者應用左卡尼汀治療后，分別行TESA-ICSI及PESA-ICSI助孕的臨床價值。

精子DFI是受精成功率、胚胎質量和輔助生殖結局的影響因素［9］。有研究指出，精子DFI＜30％是發動和維持妊娠的重要條件［10］。Siddhartha等［11］研究顯示，精子DFI增高會導致行ICSI助孕患者的臨床妊娠率降低。據研究報道，左卡尼汀可修復精子DNA損傷，從而降低精子DFI［12］。精子頂體是精子與透明帶結合和穿透的重要結構，使精卵結合，受精發生，缺乏頂體的圓頭精子無受精能力。Zahiri等［13］研究指出，不良精子頂體形態（如大、小或無頂體）可能會影響染色質完整性，并降低精子的生育潛力和ICSI周期妊娠率。

本研究結果顯示，TESA組和PESA組OA患者予左卡尼汀治療3個月后精子DFI和自發頂體反應率均低于治療前，頂體完整率高于治療前，與何泳志等［14］研究結論一致，提示OA患者ICSI助孕前應用左卡尼汀可改善睪丸及附睪精子質量。但TESA組與PESA組間精子DFI、頂體完整率及自發頂體反應率無明顯差異，分析原因為：左卡尼汀在睪丸中具有抗凋亡作用，促進生殖相關基因表達，減輕精子損傷；左卡尼汀在附睪中可增加脂肪酸氧化，增強細胞代謝能力，改善能量供應［15］；左卡尼汀可通過不同機制對睪丸及附睪精子發揮作用，均具有明顯療效。

另外，本研究結果顯示，TESA組和PESA組均獲得較好的妊娠結局，分別獲得17例和22例活產分娩。另外，配偶ICSI受精率、2PN受精率、卵裂率、優胚率、種植率、臨床妊娠率、活產率、早產率、流產率及新生兒畸形率均不受精子來源影響。由此提示左卡尼汀對睪丸及附睪精子能通過多種機制產生作用，治療后精子質量無差異，且2組ICSI胚胎發育及臨床結局無差異。這與既往多項研究［16-17］結果一致。相比以往研究，本研究觀察的ICSI結局指標更全面，數據更充分，共獲103個新鮮移植周期，989枚MII卵，受精卵子數773個，臨床妊娠49例，活產分娩39例。本研究亦對出生后3個月新生兒畸形情況進行了隨訪統計，結果發現TESA組有1例新生兒患有心臟畸形，其余新生兒均無畸形。

綜上所述，OA患者行TESA-ICSI及PESA-ICSI助孕前予左卡尼汀治療均可優化精子質量，改善臨床結局，且用藥安全。臨床中建議生殖醫生應根據患者個人情況、取精熟練程度、生殖中心條件等靈活選用睪丸或附睪精子進行ICSI助孕。但本研究為單中心研究，且樣本量較小，相關結論有待通過多中心、大樣本研究進一步驗證。

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（2022-11-14收稿 2023-02-08修回）

（本文編輯 陳麗潔）