血清miR-134-5p和miR-320a檢測聯合肺功能指標對煤工塵肺患者的早期診斷價值

熊高才　楊元鳳　李家松　劉廷謙　何冰冰　劉卓令

摘要：目的 探討血清miR-134-5p和miR-320a聯合肺功能指標對塵肺患者早期臨床診斷價值。方法 選取煤工塵肺（CWP）患者（CWP組）、煤礦接塵體檢人群（接塵組）以及同期健康體檢人群（對照組）各40例；實時熒光定量PCR（qRT-PCR）法檢測各組血清miR-134-5p和miR-320a水平。檢測各組受試者的肺功能指標：最大通氣量（MVV）、用力肺活量（FVC）、第1秒用力呼氣容積（FEV1）、第3秒用力呼氣容積（FEV3）、1秒率（FEV1/FVC）、3秒率（FEV3/FVC）、最大呼氣中期流量（MMEF）、峰流速（PEF）、75%呼氣流速（MEF75）、50%呼氣流速（MEF50）、25%呼氣流速（MEF25）、殘氣量/肺總量（TLC）、功能殘氣量（FRC）和肺泡通氣量（VA）；采用Logistic回歸分析煤礦接塵相關作業的人群發生CWP的危險因素；采用受試者工作特征（ROC）曲線分析miRNA聯合肺功能指標對CWP患者的早期診斷價值。結果 對照組、接塵組和CWP組血清miR-134-5p、miR-320a表達水平，MVV、FEV1、FEV1/FVC、MMEF、MEF50、FRC和VA逐漸降低（P＜0.05）。多因素Logistic回歸分析結果發現FRC降低是煤礦接塵人群發生CWP的獨立危險因素（P＜0.05）。miR-134-5p和miR-320a聯合肺功能指標FRC預測煤礦接塵相關作業的人群發生CWP的診斷效能較高，AUC為0.975（95%CI：0.948～1.000）。結論 血清miR-134-5p、miR-320a和肺功能指標FRC聯合對早期CWP的臨床診斷具有重要參考價值。

關鍵詞：煤塵肺；功能殘氣量；呼吸功能試驗；miR-134-5p；miR-320a

中圖分類號：R563.9文獻標志碼：ADOI：10.11958/20221645

Early diagnostic value of serum miR-134-5p and miR-320a combined with pulmonary function index in coal worker pneumoconiosis patients

XIONG Gaocai YANG Yuanfeng LI JiasongLIU Tingqian HE Bingbing LIU Zhuoling

1 Department of Respiratory and Critical Care， the Third People's Hospital of Guizhou Province， Guiyang 550008， China;

2 Department of Pharmacy， the Second Affiliated Hospital of Guizhou University of Traditional Chinese Medicine

Corresponding Author E-mail： 369400274@qq.com

Abstract： Objective To explore the value of serum miR-134-5p and miR-320a combined with pulmonary function indexes in the early clinical diagnosis of pneumoconiosis. Methods Forty cases of coal workers' pneumoconiosis （CWP）， 40 cases of coal mine dust exposed physical examination population and 40 cases of healthy physical examination population in the same period were included in this study. Expression levels of serum miR-134-5p and miR-320a were detected by qRT-PCR assay. Lung function indexes were detected in three groups， including maximum ventilation volume （MVV）， forced vital capacity （FVC）， forced expiratory volume 1 （FEV1）， forced expiratory volume 3 （FEV3）， FEV1/FVC， FEV3/FVC， maximum mid-expiratory flow （MMEF）， peak expiratory flow （PEF）， 75 % maximal expiratory flow （MEF75）， 50% maximal expiratory flow （MEF50）， 25% maximal expiratory flow （MEF25）， residual volume （RV）， RV/total lung capacity （TLC）， functional residual capacity （FRC） and alveolar ventilation （VA）. Logistic regression was used to analyze risk factors of CWP in coal mine dust-related operations. Receiver operating characteristic （ROC） curve was used to analyze the early diagnostic value of miRNA combined with pulmonary function index in patients with CWP. Results The expression levels of serum miR-134-5p， miR-320a， MVV， FEV1， FEV1/FVC， MMEF， MEF50， FRC and VA were decreased gradually in the control group， the dust exposure group and the CWP group （P＜0.05）. Multiple Logistic regression analysis showed that the decrease of FRC was an independent risk factor for CWP in coal mine dust exposure population （P＜0.05）. miR-134-5p and miR-320a combined with lung function index FRC showed high diagnostic efficacy in predicting CWP disease in coal mine dust-related operations， with an AUC of 0.975 （95%CI： 0.948-1.000）. Conclusion The combination of serum miR-134-5p， miR-320a and lung function index FRC has important reference value for the clinical diagnosis in patients with early CWP.

Key words： anthracosis; functional residual capacity; respiratory function tests; miR-134-5p; miR-320a

煤工塵肺（coal workers pneumoconiousis，CWP）是一種常見的職業病，患者普遍存在肺纖維化、支氣管扭曲或狹窄及慢性阻塞性肺疾病等并發癥。此外，肺組織中的煤塵顆粒可能具有毒性作用，引起氧化應激、DNA損傷和慢性炎癥反應等［1］。CWP早期癥狀較輕，易被漏診、誤診，但病情會逐年加重，直接損傷肺功能，患者出現換氣功能障礙，呼吸衰竭。由于早期難診斷且無特效治療藥物，CWP已成為我國重大的公共衛生問題，尋找有效的生物標志物對塵肺的預防意義重大［2］。miRNA是一類由22～25個核苷酸組成的單鏈RNA［3］，對機體生長發育、能量代謝與免疫反應等生理病理過程具有重要作用，游離miRNA具有作為某些人類疾病的生物標志物的潛力［4-5］。CWP發展過程中伴隨miRNA表達異常［6］，但miRNA結合肺功能指標預測CWP肺纖維化的研究較少。在小鼠肺纖維化模型中，miR-320a-3p可通過靶向叉頭框蛋白M1（forkhead box protein M1，FOXM1）mRNA調節纖維化程度［6］；通過微陣列和生物信息學方法發現肺纖維化患者血清miR-134-5p和miR-320a存在差異性表達［7］，miR-134-5p和miR-320a可能參與了塵肺纖維化過程。本研究將miR-134-5p和miR-320a聯合肺功能指標用于CWP早期診斷，為塵肺病的早期預防提供新思路。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2020年1月—2021年1月貴州省第三人民醫院呼吸及危重癥科就診的CWP患者（CWP組）、煤礦接塵體檢人群（接塵組，從事煤礦接塵相關作業的人群）以及同期健康體檢人群（對照組）各40例。CWP組納入標準：（1）由具有職業病診斷資質的塵肺診斷專家根據《職業性塵肺病的診斷》（GBZ70-2015）確診為CWP。（2）未罹患其他重大肺部疾病。接塵組納入標準：（1）從事煤礦接塵相關作業，未確診為CWP。（2）無重大肺部疾病。全部研究對象均簽署知情同意書。CWP組均為男性，年齡（39.07±3.87）歲；接塵組均為男性，年齡（39.30±4.48）歲；對照組均為男性，年齡（38.33±7.39）歲。3組間年齡（F=0.349）差異無統計學意義（均P＞0.05）。

1.2 實時熒光定量PCR（qRT-PCR）法檢測血清miR-134-5p和miR-320a表達水平

入組后采集對象肘部靜脈血5 mL，3 500 r/min離心1 h，將上清液轉移至干凈的1.5 mL EP管中，-80 ℃儲存備用。采用凱杰生物工程（深圳）有限公司miRNeasy Serum/Plasma Advanced Kit試劑盒提取各組樣本血清miRNA。室溫解凍備用血清，加入適量的裂解液和蛋白酶，56 ℃孵育30 min，80 ℃孵育30 min后，12 000 r/min離心5 min，取上清液，加入離心柱，分離miRNA。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，miR-134-5p（169 bp）上游：5'-UGUGACUGGUUGACCAGA-3'，下游：5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'；miR-320a（203 bp）上游：5'-AAGGGATCGCGGGCG-3'，下游：5'-TGCGTGTCGTGGAGTC-3'；內參U6（103 bp）上游：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，下游：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。反應條件：預變性94 ℃ 5 min；變性94 ℃ 1 min，退火61 ℃ 60 s，延伸72 ℃ 40 s（40個循環）。根據得到的Ct值，采用2^-ΔΔCt法計算miRNA相對表達量。

1.3 肺功能檢測

根據我國《職工工傷與職業病致殘程度鑒定》GB/T 16180-2014中因職業接觸粉塵而引起的塵肺病患者肺功能檢測要求，各組受試者入院后或體檢時需檢測：最大通氣量（MVV）、用力肺活量（FVC）、第1秒用力呼氣容積（FEV1）、第3秒用力呼氣容積（FEV3）、1秒率（FEV1/FVC）、3秒率（FEV3/FVC）、最大呼氣中期流量（MMEF）、峰流速（PEF）、75%呼氣流速（MEF75）、50%呼氣流速（MEF50）、25%呼氣流速（MEF25）、殘氣量（RV）/肺總量（TLC）、功能殘氣量（FRC）和肺泡通氣量（VA）。

1.4 統計學方法

采用SPSS 19.0進行數據分析。符合正態分布的計量資料以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗；不符合正態分布的計量資料以M（P25，P75）表示，多組間比較采用Kruskal-Wallis H檢驗，組間多重比較采用Sidaks檢驗。計數資料以例表示，組間比較采用χ2檢驗。采用單因素和多因素Logistic回歸分析煤礦接塵相關作業人群發生CWP的危險因素。采用受試者工作特征（ROC）曲線分析miRNA聯合肺功能指標對CWP的早期診斷價值。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組血清miR-134-5p和miR-320a水平比較

對照組、接塵組和CWP組血清miR-134-5p和miR-320a表達水平逐漸降低（P＜0.05），見表1。

2.2 各組肺功能指標比較

對照組、接塵組和CWP組MVV、FEV1、FEV1/FVC、MMEF、MEF50、FRC和VA逐漸降低（P＜0.05），見表2。

2.3 發生CWP的危險因素分析

以MVV、FEV1、FEV1/FVC、MMEF、MEF50、FRC、VA、miR-134-5p和miR-320a為自變量，煤礦接塵人群是否發生CWP（否=0，是=1）為因變量，進行單因素Logistic回歸分析，結果發現FEV1、FEV1/FVC、MMEF、FRC、miR-134-5p和miR-320a是煤礦接塵人群發生CWP的影響因素（P＜0.05），見表3。以FEV1、FEV1/FVC、MMEF、FRC、miR-134-5p和miR-320a為自變量，煤礦接塵人群是否發生CWP（否=0，是=1）為因變量，進行多因素Logistic回歸分析，結果發現FRC降低是煤礦接塵人群發生CWP的獨立危險因素（P＜0.05），見表4。

2.4 ROC曲線分析

血清miR-134-5p、miR-320a聯合肺功能指標FRC預測煤礦接塵相關作業的人群發生CWP的診斷效能較高，見表5、圖1。

3 討論

我國作為煤炭資源大國，從事煤炭行業的人員數量巨大，CWP發病率居世界首位［8］。長期吸入煤顆粒可導致多種肺部疾病，如CWP、進行性大面積纖維化、慢性支氣管炎、肺功能喪失和肺氣腫等［9］。CWP早期是指接塵人群接觸粉塵，但尚未被診斷為CWP，該時期可持續20～30年。臨床上針對CWP通常是根據確切的粉塵接觸史，結合肺影像學和分子生物學檢測結果進行診斷［10］。然而，患者肺部在沒有典型病理改變的情況下，臨床醫師很難做出準確診斷。目前，臨床上針對CWP主要通過對癥治療減輕患者病痛，而肺泡灌洗術作為探索性的治療方法，其術中和術后均存在發生并發癥的風險［11-12］。因此，尋找血清生物標志物聯合肺功能相關指標用于塵肺發病早期的預測和診斷具有重大意義。

miRNAs通過靶向特定的mRNA導致靶基因的轉錄后沉默來調節基因表達，參與調節多個細胞進程，如細胞周期進展、增殖、凋亡和發育。人體內超過30%的編碼基因受到miRNA的調控［13］。研究發現，當患者長期受到各種化學刺激和空氣污染等威脅時，肺組織內miRNAs表達出現異常，并引起蛋白質異常表達，導致肺部疾病的發生發展［14］。因此，肺組織內miRNAs的異常表達可能是診斷塵肺的潛在臨床生物標志物［15］。本課題組前期通過miRNA芯片技術篩選出了miR-134-5p和miR-320a兩個在CWP患者中異常低表達的miRNAs，并且通過本研究驗證了CWP患者血清miR-134-5p和miR-320a表達水平較體檢人群和煤礦接塵人群明顯降低，說明miR-134-5p和miR-320a可能與煤礦接塵人群患CWP相關。

肺功能指標測定有助于判斷患者肺功能障礙的性質和程度，可作為肺疾病診斷的輔助手段。塵肺患者可根據我國《職工工傷與職業病致殘程度鑒定》GB/T 16180-2014中因職業接觸粉塵而引起的塵肺病患者肺功能檢測要求執行塵肺患者肺功能檢測。呼吸困難是粉塵暴露對肺產生不利影響的重要臨床特征，而FEV1和MMEF均能反應氣道阻塞障礙情況。研究發現，FEV1與CWP患者肺部顆粒物含量呈負相關，同時FEV1降低也是塵肺患病率和死亡風險增加的重要因素［16-18］。焊工塵肺患者MMEF指標明顯降低［19］，隔熱纖維材料暴露工人小氣道功能指標MMEF明顯降低［20］。本研究發現，CWP組和接塵組患者的FEV1、MMEF和FRC均較對照組降低，且FRC是早期CWP的獨立影響因素。FRC是平靜呼氣后肺內含氣量，由補呼氣容積與殘氣容積組成。塵肺主要影響肺部擴張，因此FRC作為肺容量的衡量指標，對塵肺檢測具有一定的臨床價值。另外，本研究中FEV1和MMEF不是煤礦接塵患者發生CWP的危險因素，與既往的研究結果不一致［18-20］，這可能是患者塵肺疾病背景不完全一樣，既往研究中的研究對象是隔熱纖維材料暴露工人，或者是焊工及煤礦工人混合的患者，而本文的研究對象主要是煤礦接塵患者；另外，研究對象所處的疾病進展期也不完全一致。本研究將miR-134-5p和miR-320a聯合肺功能指標FRC進行臨床診斷價值分析，結果發現與單純miR-134-5p和miR-320a指標相比，肺功能指標聯合miRNAs指標對早期CWP的診斷效能更高。

綜上所述，早期CWP患者血清miR-134-5p和miR-320a表達降低，且肺功能指標FRC降低是CWP患者的獨立危險因素。miR-134-5p和miR-320a聯合肺功能指標FRC對早期CWP臨床診斷具有良好的應用價值。但本研究樣本量較少，具有地域局限性，后續還會從體內體外探究miR-134-5p和miR-320a對CWP的作用機制，為治療CWP提供可靠的潛在標志物。

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（2022-10-12收稿 2023-02-21修回）

（本文編輯 李志蕓）