“樸實方”對慢傳輸型便秘小鼠結腸Cajal 細胞及SCF/c-Kit 信號通路的影響

趙向東 王貝貝 李芳斕 曹永清 王可為

（1.廣州中醫藥大學附屬深圳市中醫院，廣東深圳 518000；2.上海中醫藥大學附屬龍華醫院，上海 230023；3.南京中醫藥大學附屬南京中醫院，江蘇南京 210022）

慢傳輸型便秘（slow transit constipation，STC）是功能性便秘的一種，以結腸傳輸功能障礙，腸內容物通過緩慢為主要特點，主要癥狀為排便困難，并伴有排便頻次降低、糞便干燥堅硬等表現[1]。本病全球發病率為14%，其中我國發病率為4.0%～10.0%[2-3]。便秘會增加結直腸癌發病風險，誘發心腦血管疾病，常伴有焦慮、抑郁、睡眠障礙等，嚴重影響患者的生活質量[4]。現代研究發現，Cajal間質細胞（interstitial cells of cajal，ICC）在胃腸道動力障礙性疾病中具有重要作用[5]。ICC的特異受體酪氨酸激酶受體（c-Kit）及其天然配體干細胞因子（stem cell factor，SCF）構成的信號途徑對ICC的發生、發育及功能維持具有重要的調控作用[6]。

樸實方為龍華醫院曹永清教授治療便秘的經驗方，基于四君子湯化裁，加入枳實、厚樸、丹參等以活血行氣、健脾益氣，治療便秘臨床療效顯著[7]。本研究使用復方地芬諾酯建立STC小鼠模型，觀察樸實方對STC模型小鼠SCF/c-Kit信號通路的影響，以挖掘樸實方治療STC的作用機制，為臨床用藥提供科學依據。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 SPF級8周齡ICR雄性小鼠50只，體質量（27±2）g，購自上海史萊克實驗動物有限公司，許可證號：SCXK（滬）2017-0005。飼養于上海中醫藥大學動物中心，飼養溫度為16～22 ℃，相對濕度45%～55%，自由飲水與進食，晝夜光照交替12 h。本實驗經上海中醫藥大學實驗動物倫理委員會批準（批準編號：PZSHUTCM19030835）。

1.2 實驗藥物 樸實方凍干粉：樸實方藥物組成為黨參20 g、茯苓15 g、白術20 g、厚樸15 g、枳實15 g、丹參30 g，飲片均購自上海中醫藥大學附屬龍華醫院中藥房。中藥飲片加入1100 mL超純水，完全浸泡30 min，大火煮沸后轉小火再煎煮30 min，將藥液倒出，剩余藥材重復上述步驟再次煎煮。2次水煎藥液合并、過濾、蒸發濃縮、冷凍干燥，凍干粉置于-20 ℃環境中保存備用。實驗開始前先配制成濃度為1.70 g/mL（高劑量）的母液，再取部分母液用超純水稀釋成0.85 g/mL（低劑量）濃度使用。復方地芬諾酯片（常州康普藥業有限公司，批號1807013），研磨成粉，用蒸餾水配制成濃度1 mg/mL的混懸液。琥珀酸普蘆卡必利片（prucalopride，Janssen Cilag S.P.A公司，批號IEL0X00），研磨成粉，用蒸餾水配制成濃度0.03 mg/mL的混懸液。

1.3 主要試劑 活性炭（2018090716，廣州鴻生炭業化工有限公司），阿拉伯樹膠（2018040506，合肥博美生物科技責任有限公司），SCF酶聯免疫吸附（ELISA）法試劑盒（00502072019，上海司鼎生物科技有限公司），RNA逆轉錄試劑盒（FSQ-101，日本TOYOBO公司），BCA蛋白試劑盒（P0012S，碧云天生物技術有限公司）。

1.4 主要儀器 熒光定量PCR分析儀（STEPONE，美國ABI公司），Mini pate spinner（MPS1000，美國Labnet公司），穩壓穩流電泳儀（DYY-6B，北京六一生物科技有限公司），高速冷凍離心機（450R，德國eppendorf公司），數顯恒溫水浴鍋（HH-1，上海梅香儀器有限公司），臺式低速冷凍離心機（L535R，湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司），熒光倒置顯微鏡（IX71，日本OLYMPUS公司），凍干機（Alpha2-4/LD plus，德國CHRIST公司），旋轉蒸發儀（R220SE，上海巴玖實業有限公司）。

2 實驗方法

2.1 分組與造模 50只ICR小鼠適應性飼養1周后隨機分為正常組、模型組、陽性對照組和樸實方低、高劑量組，每組10只。除正常組外，其余各組小鼠予復方地芬諾酯混懸液灌胃造模，給藥劑量為每日10 mg/kg，1次/d，連續14 d[8]。當小鼠出現進食減少、體質量減輕和大便粒型小、干硬等表現時，表明造模成功。正常組以等量生理鹽水灌胃，1次/d，連續14 d。此期間若出現小鼠死亡，則予補足，以確保造模完成后各組鼠數均為10只。

2.2 給藥 造模完成后，陽性對照組灌胃給予琥珀酸普蘆卡必利混懸液0.3 mg/（kg·d），樸實方高、低劑量組分別灌胃給予相應中藥溶液17.0、8.5 g/（kg·d），正常組、模型組每日灌胃給予同體積生理鹽水，各組均每日灌胃1次，給藥體積均為0.1 mL/10 g，連續14 d。

2.3 取材 末次給藥結束后，各組小鼠禁食不禁水24 h，管飼法灌胃0.2 mL 5%活性炭，30 min后眼眶采血，脫頸椎處死，取腸管進行腸道推進功能檢測，完成后截取適當長度結腸，使用PBS溶液將結腸內的糞便清洗干凈，截取3 段長1～2 cm的結腸組織，其中1 段浸泡于10%多聚甲醛中，2 段放入凍存管并立即轉移至-80 ℃冰箱凍存，以待后續檢測使用。

2.4 指標檢測

2.4.1 測定炭末推進率觀察腸道推進功能 各組小鼠灌胃活性炭30 min后，取包括胃和直腸末端在內的整個腸管，在腸道保持充分松弛情況下量取其腸道總長度及活性炭染色的腸管長度，計算炭末推進率（即為腸道推進率）。炭末推進率（%）=（炭末前沿至幽門的距離/腸道總長度）×100%。

2.4.2 蘇木精-伊紅（HE）染色法觀察結腸組織學特征 取浸泡于10%多聚甲醛中固定的各組小鼠結腸組織，按照脫水、透明、浸蠟、包埋的順序處理，切片、撈片、烤片，依次予二甲苯、無水乙醇、95%乙醇、80%乙醇浸泡，自來水漂洗，蘇木素、鹽酸染色，自來水返藍，1%伊紅染色，最后使用95%乙醇、無水乙醇脫水，二甲苯脫水透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察并拍照。

2.4.3 ELISA法檢測血清SCF水平 取各組小鼠血清，按ELISA試劑盒說明書上的方法檢測小鼠血清中SCF含量。

2.4.4 RT-PCR法檢測結腸組織SCF、c-Kit mRNA表達 取凍存的各組小鼠結腸組織約100 mg，采用Trizol法提取細胞總RNA，按照逆轉錄試劑盒說明書操作，將RNA反轉錄合成cDNA；然后進行實時定量PCR，嚴格按照SYBR試劑盒操作，反轉錄體系為20 μL，上下游引物各1.5 μL，cDNA使用2 μL，反應條件為首先95 ℃持續2 min進行預變性，隨后95 ℃持續5 s，60 ℃持續10 s，連續35～40個循環后檢測溶解曲線。反應結束后得到Ct值，采用2-△△Ct計算mRNA相對表達量。引物序列見表1。

表1 c-Kit、SCF及內參引物序列

2.4.5 蛋白質免疫印跡（Western blot）法檢測結腸組織SCF、c-Kit蛋白表達 取凍存的各組小鼠結腸組織，快速研磨碾碎，收集蛋白樣品，測定濃度；加入適量濃縮的SDS-PAGE蛋白上清緩沖液進行電泳及轉膜；轉膜結束后，將PVDF膜室溫封閉1 h，PBST沖洗3 次；二抗孵育，重復上述操作。采用化學發光檢測系統，將PVDF膜加入化學發光底物，后將其置入增光屏的暗盒中曝光，掃描圖片顯影、定影。以GAPDH單抗檢測作為內參對照，使用Image J軟件分析各組蛋白的表達。

2.5 統計學方法 使用SPSS 22.0軟件對數據進行統計學分析。本研究所有計量資料均符合正態分布，使用均值±標準差（）表示。正常組和模型組比較采用兩獨立樣本t檢驗；模型組與各給藥組比較采用單因素方差分析。P＜0.05表示差異具有統計學意義。

3 實驗結果

3.1 各組小鼠腸道推進率比較 模型組小鼠的腸道推進率明顯低于正常組（P＜0.01），樸實方高、低劑量組及陽性對照組小鼠腸道推進率明顯高于模型組（P＜0.01）。各給藥組組間腸道推進率比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 各組小鼠腸道推進率比較（）

表2 各組小鼠腸道推進率比較（）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01。

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3.2 各組小鼠結腸組織學特征比較 正常組小鼠結腸黏膜表面光滑，可見大量腺體，無明顯水腫充血；模型組小鼠結腸肌層厚度降低，腺體數量減少，出現明顯充血、水腫；樸實方高劑量組及陽性對照組小鼠結腸組織肌層厚度較模型組明顯增加，腺體數量增加，排列較整齊，充血水腫明顯改善；樸實方低劑量組小鼠結腸黏膜組織病理改變僅輕度改善。見圖1。

圖1 各組小鼠結腸組織病理表現（HE，×200）

3.3 各組小鼠血清SCF含量比較 模型組小鼠血清SCF含量顯著低于正常組（P＜0.01）；樸實方高、低劑量組和陽性藥物組小鼠血清SCF含量明顯高于模型組（P＜0.01）；各給藥組組間SCF含量比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。見表3。

表3 各組小鼠血清SCF含量比較（）

表3 各組小鼠血清SCF含量比較（）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01。

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3.4 各組小鼠結腸組織SCF mRNA、c-Kit mRNA相對表達量比較 模型組小鼠結腸組織SCF mRNA、c-Kit mRNA相對表達量顯著低于正常組（P＜0.01）；樸實方高、低劑量組和陽性對照組小鼠上述指標明顯高于模型組（P＜0.01）；上述指標各給藥組組間比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。見表4。

表4 各組小鼠結腸組織SCF mRNA、c-Kit mRNA相對表達量比較（）

表4 各組小鼠結腸組織SCF mRNA、c-Kit mRNA相對表達量比較（）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01。

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3.5 各組小鼠結腸組織SCF、c-Kit蛋白表達比較 模型組小鼠結腸組織SCF、c-Kit蛋白相對表達量明顯低于正常組（P＜0.01）；樸實方高、低劑量組和陽性對照組小鼠上述蛋白相對表達量均明顯高于模型組（P＜0.05，P＜0.01）；上述指標各給藥組組間比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。見圖2、表5。

圖2 各組小鼠結腸組織SCF、c-Kit蛋白電泳圖

表5 各組小鼠結腸組織SCF、c-Kit蛋白相對表達量比較（）

表5 各組小鼠結腸組織SCF、c-Kit蛋白相對表達量比較（）

注： 與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

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4 討論

慢傳輸型便秘是以腸道傳輸功能減退為特點的頑固性便秘，本病發病機制復雜，目前普遍認為與腸道神經系統紊亂、ICC細胞損傷、胃腸道激素水平異常、神經遞質紊亂、腸道菌群失調、精神心理因素、腸道平滑肌形態和功能異常等因素相關[4]。由于本病病因復雜，癥狀頑固，臨床治療往往難以取得滿意效果。目前主要的治療手段有外科手術、中西藥物治療、針灸、物理療法及心理精神治療等，其中口服西藥包括促動力藥、容積性瀉藥、滲透性瀉藥、刺激性瀉藥、潤滑劑等。本研究的陽性藥物普蘆卡必利是新型二氫苯并呋喃甲酰胺衍生物的代表藥物，可特異并選擇性激動和表達腸神經系統神經元5-羥色胺（5-HT）受體，誘導腸道高幅推進性收縮，具有顯著的促動力作用。

本研究采用復方地芬諾酯灌胃誘導小鼠結腸傳輸功能紊亂。復方地芬諾酯是用于治療腹瀉的傳統藥物，長期服用會導致大腸中的水分被過度吸收，抑制腸道運動并引起便秘，但它不影響造模小鼠的正常生理功能，并接近便秘的臨床癥狀，是一種有效的功能性便秘造模藥物[9]。

中醫學對便秘的認識由來已久，《傷寒論·辨脈法》提出：“其脈浮而數，能食，不大便者，此為實，名曰陽結也。……名曰陰結也。”曹永清教授認為STC的主要病機是中焦失調、氣郁濕阻、血瘀腸絡[7]，自擬“樸實方”，臨床療效顯著。樸實方由黨參、茯苓、白術、枳實、厚樸、丹參組成。其中黨參、茯苓、白術為該方主藥，來源于四君子湯。原方中人參為君，甘溫益氣，健脾養胃；臣以苦溫之白術，健脾燥濕，加強益氣助運之力；佐以甘淡的茯苓，健脾滲濕，苓術相配，則健脾祛濕之功益著。STC患者大便困難，腑氣不通，故加厚樸寬腸下氣、化滯除脹，枳實行氣消積，二藥共用調暢氣機而除痞滿，以消無形之氣滯；輔以丹參活血通絡。

目前STC的發病機制尚未完全明確，研究發現Cajal間質細胞的數量和功能異常可導致腸道傳輸功能紊亂，而Cajal間質細胞數量與表型的改變與SCF/c-Kit通路密切相關[10]。Cajal間質細胞主要分布于結腸神經系統和平滑肌之間，是胃腸道平滑肌的慢波起搏細胞，參與慢波的形成，介導腸道神經信號傳導，從而調控胃腸道肌肉收縮功能[11-13]。STC的發病機制與胃腸道運動能力下降有關，而起源于環肌和縱肌交界區內的慢波可通過各肌層Cajal間質細胞傳導電信號來影響胃腸道運動功能[14]。本研究結果表明，模型組小鼠腸道推進率明顯降低，經過樸實方和琥珀酸普蘆卡必利干預后明顯改善，小鼠的腸道運動能力明顯加強，其中樸實方高、低劑量和琥珀酸普蘆卡必利療效相當，可供臨床參考。本研究還發現樸實方對STC模型小鼠腸道運動能力的改善無明顯劑量依賴性，可為臨床用藥的合理劑量提供依據。

c-Kit是ICC的特異性標志物，屬受體酪氨酸激酶家族第3亞類，與其配體SCF結合后所啟動的信號通路，對ICC的發育、分化及表型維持至關重要，是直接反映ICC數量和密度的標簽。有學者研究發現，STC患者結腸組織c-Kit mRNA及其蛋白表達降低，提示SCF/c-Kit信號通路在結腸Cajal細胞減少、結腸運輸障礙所引起的STC中發揮重要作用[15-16]。ICC配體SCF來源于神經元細胞和平滑肌細胞，可促進ICC的發生和分化，并維持其正常的生理功能[17]。研究表明，ICC細胞的數量及功能和SCF/c-Kit信號通路密切相關。SCF是c-Kit的天然配體，每個c-Kit單體都通過細胞外結構域與SCF結合。在SCF二聚化之后，c-Kit單體的結構發生變化并產生同源二聚化，導致細胞膜中氨基酸殘基的自動磷酸化并刺激各種第2信號分子來調節ICC的細胞功能[6]。本研究發現，STC模型小鼠的結腸肌層厚度降低，腺體數量減少且充血、水腫，血清SCF含量下降，結腸組織c-Kit、SCF mRNA及其蛋白表達均顯著下降，經樸實方和琥珀酸普蘆卡必利治療后上述病理表現和指標都得到明顯改善，各給藥組小鼠血清SCF含量和結腸組織c-Kit、SCF mRNA及其蛋白表達比較差異均無統計學意義，說明樸實方在對SCF便秘小鼠的治療過程中可以激活SCF/c-Kit信號通路，修復ICC并增加其數量。

綜上，樸實方可提高小鼠腸道推進率，改善小鼠結腸組織結構，上調結腸組織中c-Kit和SCF的表達，激活SCF/c-Kit信號通路，促進結腸ICC增殖，增強腸道蠕動，從而改善小鼠便秘狀態。本研究初步闡釋了樸實方治療STC的作用機制，然而中藥復方具有多成分、多靶點作用，課題組擬進一步探討樸實方有效成分及其他作用靶點，深入研究其作用機制，從而更好地指導臨床用藥。此外，本實驗中樸實方達到和普蘆卡必利相似的治療效果，比預期結果好，可能存在其他作用機制出現了疊加效果，也值得設計相關實驗以進一步研究。