丹酚酸B對(duì)視網(wǎng)膜靜脈阻塞損傷大鼠模型視網(wǎng)膜的保護(hù)作用及對(duì)血管新生的影響

劉志強(qiáng),李亞坤,白 玫,郭向東,梁春利

0 引言

視網(wǎng)膜靜脈阻塞(retinal vein occlusion,RVO)是一種嚴(yán)重的視網(wǎng)膜血管疾病,涉及血管生成和黃斑水腫等并發(fā)癥,可導(dǎo)致視力減弱甚至失明[1]。玻璃體腔注射抗VEGF藥物、皮質(zhì)類(lèi)固醇和激光療法已被用于治療繼發(fā)于視網(wǎng)膜中央RVO和分支RVO的黃斑水腫[2-3],但治療效果和應(yīng)用具有局限性[4],仍有15%～40%患者視力無(wú)反應(yīng)或僅部分反應(yīng)[5],因此積極探索治療效果顯著且副作用小的其他藥物具有重要意義。丹酚酸B是傳統(tǒng)中藥丹參的主要有效水溶性成分,具有抑制血管新生的作用[6],但關(guān)于其是否可通過(guò)影響血管生成發(fā)揮對(duì)RVO損傷的改善作用尚未見(jiàn)報(bào)道,故本研究擬構(gòu)建RVO大鼠模型,并經(jīng)丹酚酸B治療,探討丹酚酸B對(duì)RVO大鼠視網(wǎng)膜組織病理、功能和血管生成相關(guān)因子的表達(dá)影響,以期為RVO抗VEGF藥物選擇提供一定參考資料。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)雄性SD大鼠35只,6～8周齡,體質(zhì)量為200±20g,濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司提供[SCXK(魯)2019-0003]。經(jīng)裂隙燈檢查,所有大鼠均排除眼部疾患。在室溫(23±3)℃,濕度40%～65%環(huán)境下普通飼養(yǎng),12h光-暗交替,給予充足水和普通飼料,適應(yīng)性飼養(yǎng)1wk。本研究經(jīng)河北北方學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)委員會(huì)審批。

1.1.2藥品和主要試劑及儀器丹酚酸B(純度≥98%)(YRD029)購(gòu)自成都儀睿生物科技有限公司;孟加拉玫瑰紅(純度≥95%)(632-69-9)購(gòu)自Sigma-Aldrich(上海)貿(mào)易有限公司;缺氧誘導(dǎo)因子1α(hypoxia inducible factor 1 α,HIF1α)(ab216842)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)(ab68153)、p-STAT3(ab267373)、VEGF(ab46154)抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司;YZ5T型裂隙燈顯微鏡購(gòu)自蘇州六六視覺(jué)科技股份有限公司;GYC1000眼底激光儀購(gòu)自英國(guó)Optoprobe公司;Invitrogen iBright凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自賽默飛世爾生物科技有限公司。

1.2方法

1.2.1造模和分組及給藥隨機(jī)選取10只SD大鼠作為對(duì)照組,剩余25只均利用孟加拉玫瑰紅聯(lián)合激光光動(dòng)力法誘導(dǎo)RVO大鼠模型[7-8]：腹腔注射戊巴比妥鈉40mg/kg麻醉大鼠,0.4%鹽酸奧布卡因和1%丁卡因進(jìn)行局部麻醉,復(fù)方托吡卡胺滴眼液(5mg/mL)充分?jǐn)U瞳(為防止角膜表面干燥和視網(wǎng)膜視野受損,在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中定期使用氯化鈉9mg/mL滴眼),后經(jīng)尾靜脈注射0.25mL孟加拉玫瑰紅(50mg/kg),3～5min后,大鼠左眼角膜上放置滴加氧氟沙星眼膏的蓋玻片,采用波長(zhǎng)532nm的眼底激光儀沿著視網(wǎng)膜分支靜脈進(jìn)行激光照射以縮小血管,照射點(diǎn)距離視神經(jīng)乳頭1.5～3.0視盤(pán)直徑(papilla disc,PD),功率60mW,光斑60μm,時(shí)間0.4s,見(jiàn)激光處?kù)o脈變細(xì)約1PD后,調(diào)整功率為80mW,光斑100μm,時(shí)間0.5s至視網(wǎng)膜靜脈血流中斷,遠(yuǎn)端靜脈擴(kuò)張,即造模成功。對(duì)照組僅尾靜脈注射生理鹽水,不施以激光誘導(dǎo)。成模大鼠21只,隨機(jī)剔除1只,剩余大鼠隨機(jī)分為模型組和丹酚酸B組,每組各10只,避光12h后次日給藥。其中丹酚酸B組大鼠腹腔注射丹酚酸B 50mg/(kg·d),對(duì)照組及模型組大鼠僅注射等量生理鹽水,連續(xù)21d。

1.2.2熒光素眼底血管造影技術(shù)觀察視網(wǎng)膜靜脈結(jié)構(gòu)給藥前和給藥21d后腹腔注射戊巴比妥鈉40mg/kg麻醉大鼠,復(fù)方托吡卡胺滴眼液(5mg/mL)充分?jǐn)U瞳,腹腔注射10%熒光素鈉0.3mL,結(jié)膜顏色呈黃色變化后,利用F-10共焦激光掃描檢眼鏡進(jìn)行熒光素眼底血管造影(fundus fluorescein angiography,FFA)檢查,觀察眼底情況并拍照。

1.2.3視網(wǎng)膜電圖評(píng)估視網(wǎng)膜功能給藥21d后,各組大鼠暗適應(yīng)12h,麻醉及散瞳操作方法同前,視網(wǎng)膜電圖(electroretinogram,ERG)[9]中,記錄電極為氯化銀電極,固定在角膜中央,不銹鋼電極針?lè)謩e作為參考電極和接地電極分別放在頰部和尾根部,暗光ERG使用RET Iport系統(tǒng)進(jìn)行,LED閃光強(qiáng)度為-0dB(3.00cds/m2),刺激頻率為0.15Hz,繪圖時(shí)間為150ms,記錄a波和b波振幅(μV)。其中光刺激下,開(kāi)始的一個(gè)負(fù)波為a波,后出現(xiàn)一個(gè)正波為b波;a波振幅指從基線(xiàn)到b波波谷谷底部的垂直距離;b波振幅指a波波谷到b波波峰的垂直距離。

1.2.4HE染色觀察視網(wǎng)膜組織學(xué)變化給藥21d后,腹腔注射戊巴比妥鈉40mg/kg麻醉大鼠并施行安樂(lè)死,迅速摘除各組大鼠左眼球,鏡下使用手術(shù)顯微剪去除角膜和晶狀體,取5只置于4℃含4%多聚甲醛的固定液中固定48h以上。根據(jù)靜脈阻塞部位常規(guī)制備石蠟切片,蘇木精染色5min,0.5%鹽酸乙醇分化10s,伊紅液復(fù)染30s,水洗后梯度乙醇脫水,二甲苯透明,晾干后中性樹(shù)膠封片,鏡下觀察并利用Image pro plus軟件測(cè)量視網(wǎng)膜總層(RTL)、內(nèi)核層(inner nuclear layer,INL)和外核層(outer nuclear layer,ONL)厚度。

1.2.5VEGFA免疫熒光染色評(píng)估血管生成石蠟切片常規(guī)脫蠟、脫水,于3% H2O2中孵育10min以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性,磷酸鹽緩沖鹽水漂洗3次,1%牛血清白蛋白孵育1h以阻斷非特異性抗體,后將切片與VEGFA抗體(1∶200稀釋)在4℃下孵育過(guò)夜,磷酸鹽緩沖鹽水洗滌3次,與Cy3標(biāo)記的山羊抗兔IgG(H+L)熒光二抗(1∶200稀釋)室溫下孵育1h,漂洗3次后,DAPI染核5min,熒光倒置顯微鏡下觀察并拍照記錄。以相對(duì)于對(duì)照組的VEGFA熒光強(qiáng)度(%)評(píng)估血管生成情況。

1.2.6Westernblot檢測(cè)視網(wǎng)膜組織中HIF-1α、STAT3、p-STAT3及VEGFA蛋白表達(dá)給藥21d后,取各組5只大鼠視網(wǎng)膜組織(液氮中保存?zhèn)溆?,預(yù)冷RIPA裂解液勻漿裂解,4℃下高速離心后取上清,BCA法測(cè)定蛋白濃度,調(diào)整蛋白為統(tǒng)一濃度,加熱變性蛋白。SDS-PAGE分離等量蛋白并濕轉(zhuǎn)至PVDF膜上,5%脫脂牛奶37℃封閉2h,一抗4℃孵育過(guò)夜,辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的二抗室溫孵育2h,ECL顯影,凝膠成像系統(tǒng)曝光并成像。Image J軟件分析條帶灰度值,以目的蛋白與內(nèi)參GAPDH灰度值比值表示蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1丹酚酸B對(duì)RVO大鼠視網(wǎng)膜靜脈的影響FFA顯示,治療前對(duì)照組大鼠視網(wǎng)膜熒光在血管內(nèi)均分布均勻;而模型組大鼠視網(wǎng)膜光凝部位可見(jiàn)明顯靜脈阻塞,遠(yuǎn)端視網(wǎng)膜靜脈擴(kuò)張、迂曲并伴有出血,毛細(xì)血管灌注破壞,21d后部分血管熒光不完整,有效側(cè)支循環(huán)豐富,但形狀不規(guī)則,見(jiàn)有熒光滲漏;丹酚酸B組大鼠治療前視網(wǎng)膜病變同模型組,而經(jīng)過(guò)丹酚酸B治療21d后視網(wǎng)膜靜脈循環(huán)恢復(fù),形狀逐漸規(guī)則,血管側(cè)支減少,見(jiàn)圖1。

圖1 給藥前后大鼠視網(wǎng)膜靜脈結(jié)構(gòu)觀察。

2.2丹酚酸B對(duì)RVO大鼠a波和b波振幅的影響與對(duì)照組比較,模型組和丹酚酸B組大鼠ERG a波和b波振幅降低(均P<0.05);與模型組比較,丹酚酸B大鼠ERG a波和b波振幅升高(均P<0.05),見(jiàn)圖2,表1。

表1 各組大鼠a波和b波振幅比較

圖2 各組大鼠ERG圖像。

2.3丹酚酸B對(duì)RVO大鼠視網(wǎng)膜組織病理變化的影響HE染色結(jié)果顯示,對(duì)照組大鼠視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)完整、各層排列整齊、界限清晰,視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞呈單層排列,未見(jiàn)明顯病理學(xué)損傷;模型組大鼠可見(jiàn)明顯視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞減少,分層排列紊亂,部分細(xì)胞壞死溶解,存在空泡化,INL和ONL明顯變薄;丹酚酸B組大鼠視網(wǎng)膜組織病理?yè)p傷相對(duì)于模型組有所改善。與對(duì)照組比較,模型組和丹酚酸B組大鼠RTL、INL和ONL厚度均降低(均P<0.05);與模型組比較,丹酚酸B組大鼠RTL、INL和ONL厚度均升高(均P<0.05),見(jiàn)圖3,表2。

表2 各組大鼠視網(wǎng)膜RTL、INL和ONL厚度比較

2.4丹酚酸B對(duì)RVO大鼠視網(wǎng)膜血管新生的影響三組大鼠視網(wǎng)膜組織中VEGFA熒光強(qiáng)度比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=190.806,P<0.001)。與對(duì)照組(100±0)%比較,模型組(305.57±24.62)%和丹酚酸B組(172.93±15.74)%大鼠視網(wǎng)膜組織中VEGFA熒光強(qiáng)度增強(qiáng)(均P<0.05);與模型組比較,丹酚酸B組大鼠視網(wǎng)膜組織中VEGFA熒光強(qiáng)度減弱(P<0.05),見(jiàn)圖4。

圖4 各組大鼠視網(wǎng)膜組織中VEGFA熒光染色圖。

2.5丹酚酸B對(duì)RVO大鼠視網(wǎng)膜HIF-1α、STAT3、p-STAT3及VEGFA蛋白表達(dá)的影響組間STAT3蛋白相對(duì)表達(dá)量無(wú)顯著性變化(P>0.05);與對(duì)照組比較,模型組和丹酚酸B組大鼠視網(wǎng)膜組織中HIF-1α、p-STAT3及VEGFA蛋白相對(duì)表達(dá)量升高(均P<0.05);與模型組比較,丹酚酸B組大鼠視網(wǎng)膜組織中HIF-1α、p-STAT3及VEGFA蛋白相對(duì)表達(dá)量降低(均P<0.05),見(jiàn)圖5,表3。

表3 各組大鼠視網(wǎng)膜組織中被檢蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

圖5 各組大鼠視網(wǎng)膜組織中HIF-1α、STAT3、p-STAT3及VEGFA蛋白條帶 A:對(duì)照組;B:模型組;C:丹酚酸B組。

3 討論

視網(wǎng)膜需要大量氧氣來(lái)維持其生理功能,RVO通常會(huì)引起血流量減少和毛細(xì)血管脫落,導(dǎo)致視網(wǎng)膜缺氧進(jìn)而誘發(fā)VEGF表達(dá)上調(diào),而VEGF可增加血管通透性并導(dǎo)致血-視網(wǎng)膜屏障破壞,在黃斑水腫和視網(wǎng)膜新生血管形成中發(fā)揮重要作用[10]。因此,靶向VEGF的藥物被認(rèn)為是一種有前途的治療方法。目前,抗VEGF主要通過(guò)直接干預(yù)降低VEGFA表達(dá),臨床研究證實(shí)有效,然而,抗VEGF藥物仍然不可避免地表現(xiàn)出一些潛在缺點(diǎn)[11],因此促進(jìn)血流恢復(fù)同時(shí)降低VEGF表達(dá),減弱血管通透性、抑制血管過(guò)度新生可作為RVO藥物治療策略的靶點(diǎn)。

丹酚酸B為丹參水溶性成分丹酚酸的有效單體之一,體外實(shí)驗(yàn)已證實(shí)有較強(qiáng)的抗氧化、抗血栓生成及心腦血管保護(hù)作用[12-13]。RVO模型旨在成功實(shí)現(xiàn)視網(wǎng)膜靜脈閉塞,導(dǎo)致缺氧缺血性損傷、血視網(wǎng)膜屏障破裂、神經(jīng)元死亡和視網(wǎng)膜水腫,本研究模型組大鼠視網(wǎng)膜光凝部位可見(jiàn)明顯靜脈阻塞,遠(yuǎn)端視網(wǎng)膜靜脈擴(kuò)張、迂曲并伴有出血,毛細(xì)血管灌注破壞,經(jīng)過(guò)21d后可見(jiàn)部分血管熒光不完整,有效側(cè)支循環(huán)豐富,但形狀不規(guī)則,見(jiàn)有熒光滲漏。相關(guān)臨床研究同樣表明視網(wǎng)膜分支靜脈阻塞患者脈絡(luò)膜血管指數(shù)升高,而抗VEGF治療可減小脈絡(luò)膜血管指數(shù)[14]。分析本研究中模型組大鼠視網(wǎng)膜病變可能是由于光凝造成血流阻斷,血管壓力升高,使得血管破裂,阻塞位置出現(xiàn)熒光滲漏,而阻塞部位遠(yuǎn)端血液充盈不足,使得大量毛細(xì)血管新生。此外,激光光凝對(duì)視網(wǎng)膜光凝區(qū)產(chǎn)生熱效應(yīng)、光化學(xué)效應(yīng)和器質(zhì)性損傷,對(duì)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)造成一定程度的破壞,從而使毛細(xì)血管的管壁通透性升高,血管內(nèi)容物滲出,導(dǎo)致視網(wǎng)膜缺血缺氧,誘導(dǎo)大量毛細(xì)血管新生,建立起豐富的毛細(xì)血管側(cè)支網(wǎng)絡(luò)[15-16]。丹酚酸B組大鼠治療前視網(wǎng)膜病變同模型組,而經(jīng)過(guò)21d丹酚酸B治療后視網(wǎng)膜靜脈循環(huán)恢復(fù),形狀逐漸規(guī)則,血管側(cè)支減少,可能是由于丹酚酸B具有一定的溶栓作用,通過(guò)促進(jìn)眼底視網(wǎng)膜阻塞血管再通減輕血管阻塞引起的病變[17-18]。

ERG是視網(wǎng)膜對(duì)光刺激的電反應(yīng),其組成部分a波、b波和振蕩電位的振幅和時(shí)間模式取決于視網(wǎng)膜的功能完整性、到達(dá)視網(wǎng)膜的測(cè)試閃光強(qiáng)度和環(huán)境照明,其中a波測(cè)量視網(wǎng)膜感光器響應(yīng),b波是較為敏感的視網(wǎng)膜缺血指標(biāo),可反映視網(wǎng)膜INL細(xì)胞的電活動(dòng),均可用于評(píng)估視網(wǎng)膜功能[19]。研究發(fā)現(xiàn),a波、b波振幅降低提示視網(wǎng)膜功能障礙[20]。ONL由感光視錐細(xì)胞和視桿細(xì)胞組成,INL有助于光信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),ONL感光細(xì)胞丟失可用于評(píng)估視網(wǎng)膜功能和視網(wǎng)膜敏感性[21]。本研究結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,模型組大鼠ERG a波和b波振幅均下降,同時(shí)INL和ONL厚度均降低,提示視網(wǎng)膜功能障礙;經(jīng)丹酚酸B治療后,模型大鼠ERG a波和b波振幅均升高,結(jié)合大鼠視網(wǎng)膜組織學(xué)變化結(jié)果,提示丹酚酸B可能通過(guò)促進(jìn)血流恢復(fù),減輕大鼠視網(wǎng)膜缺血缺氧性病理?yè)p傷進(jìn)而改善視網(wǎng)膜功能。

HIF-1α是對(duì)氧變化最敏感的轉(zhuǎn)錄因子,在缺氧誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞血管生成中起重要作用。當(dāng)機(jī)體缺氧時(shí),HIF-1α與HIF-1β結(jié)合形成化合物,可激活下游靶基因,調(diào)節(jié)一系列血管活性因子和細(xì)胞因子的基因表達(dá)和蛋白質(zhì)合成[22]。據(jù)報(bào)道,HIF-1α可通過(guò)激活STAT3分子促進(jìn)病理性新生血管形成,STAT3分子進(jìn)一步調(diào)節(jié)其下游基因,包括VEGF[23]。而VEGF過(guò)表達(dá)是視網(wǎng)膜新生血管形成和血管滲漏的主要原因,可加重視網(wǎng)膜病理?yè)p傷及視覺(jué)障礙[24]。Yu等[25]基于化學(xué)計(jì)量學(xué)方法和譜效關(guān)系研究補(bǔ)腎活血方治療糖尿病視網(wǎng)膜病變的Q標(biāo)志物,發(fā)現(xiàn)丹酚酸B可顯著抑制VEGF和HIF-1α表達(dá)。本研究經(jīng)VEGFA免疫熒光染色和Western blotting法檢測(cè),發(fā)現(xiàn)模型組大鼠視網(wǎng)膜組織中VEGFA、HIF-1α和p-STAT3蛋白相對(duì)表達(dá)量均升高,而經(jīng)丹酚酸B作用后,三者蛋白表達(dá)均下調(diào),結(jié)合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果,提示丹酚酸B可能通過(guò)促進(jìn)RVO大鼠靜脈阻塞血流恢復(fù),減輕視網(wǎng)膜組織缺氧性損傷,抑制HIF-1α/STAT3/VEGF信號(hào)通路激活,降低VEGFA表達(dá)進(jìn)而減少病理性新生血管形成,改善視網(wǎng)膜功能。本研究結(jié)果與許琳等[26]研究報(bào)道的叔丁基對(duì)苯二酚通過(guò)下調(diào)HIF-1α和VEGF蛋白表達(dá),可抑制糖尿病視網(wǎng)膜病變大鼠視網(wǎng)膜血管新生具有一致性。

綜上所述,丹酚酸B可減輕RVO大鼠視網(wǎng)膜組織病理學(xué)損傷,改善視網(wǎng)膜功能,這可能與抑制HIF-1α/STAT3/VEGFA途徑激活,減少血管新生有關(guān)。