基于低場核磁-近紅外二維相關(guān)光譜技術(shù)研究加熱溫度對牛肉水分的影響

王廷敏,謝安國,2,付淑亞,劉云宏*

1(河南科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院,河南 洛陽,471023) 2(南陽理工學(xué)院 張仲景國醫(yī)國藥學(xué)院,河南 南陽,473004)

牛肉作為一種具有較高營養(yǎng)價值的保健型肉類食品,在我國的消費量僅次于豬肉和禽肉[1]。牛肉中蛋白質(zhì)含量達到了20%左右,并含有人體所需的所有必需氨基酸[2]。牛肉經(jīng)過熱加工處理后,其所含的蛋白質(zhì)會發(fā)生變性、降解,脂肪也會因為氧化反應(yīng)產(chǎn)生相應(yīng)變化,水分含量和分布情況也會發(fā)生較大改變,進而影響牛肉的品質(zhì)[3]。肉制品生產(chǎn)加工中,按滅菌溫度的高低可分為高溫肉制品和低溫肉制品。高溫肉制品是指加熱殺菌時食品中心溫度大于115 ℃并持續(xù)一段時間,滅菌徹底,因而商品貨架期長。低溫肉制品是采用較低的殺菌溫度進行巴氏殺菌的肉制品,肉制品中心溫度達到68～72 ℃時可保溫30 min左右,能夠較好地保留原有的風(fēng)味物質(zhì)和營養(yǎng)成分。因此不同加熱溫度在肉品工業(yè)中都有合適的應(yīng)用場景。

水分的組成和分布是牛肉肌肉的一個重要質(zhì)量指標,對牛肉的質(zhì)構(gòu)、色澤和商業(yè)價值有顯著的影響。低場核磁共振技術(shù)(low-field nuclear magnetic resonance,LF-NMR)可以用來研究牛肉的水分遷移情況,它作為一種快速發(fā)展的新興技術(shù),在肉及肉類產(chǎn)品的檢測中已經(jīng)得到廣泛的應(yīng)用[4]。通常認為肉品弛豫特征峰能夠反映肉中不同水分狀態(tài)的分布情況,趙家藝等[5]研究發(fā)現(xiàn)醬鹵牛肉的質(zhì)構(gòu)特性及水分變化與二次加熱溫度呈規(guī)律性變化。馬紀兵等[6]研究牦牛肉在風(fēng)干過程中水分遷移規(guī)律,探討了核磁參數(shù)與組織結(jié)構(gòu)和質(zhì)構(gòu)之間的相關(guān)性,結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著風(fēng)干時間的延長,肌原纖維橫截面積、肌纖維直徑以及肌間距離顯著降低,牦牛肉的硬度、內(nèi)聚性、膠著性、咀嚼性則顯著增大。

光譜分析檢測技術(shù)具有較高的靈敏度、其選擇性很強,能夠?qū)崿F(xiàn)無損、快速地檢測樣品,通常作為一種快速評估肉類化學(xué)成分的技術(shù)。如今,近紅外(near-infrared,NIR)光譜已成功應(yīng)用于牛肉行業(yè)化學(xué)成分的測量例如,它被用來測定牛肉成分和質(zhì)量特性[7]。此外,光譜分析技術(shù)還被用于牛肉和豬肉的揮發(fā)性鹽基氮的含量測定[8];結(jié)合化學(xué)計量學(xué)方法定量鑒定牛肉肉糜摻假情況[9-10]。然而,近紅外光譜數(shù)據(jù)龐大,光譜信息復(fù)雜,不同結(jié)構(gòu)信息的圖譜重疊嚴重,限制了光譜進一步分析。二維相關(guān)分析可將傳統(tǒng)的一維光譜擴展到二維,能提高光譜的分辨率和重疊峰的分離度[11-12]。而移動窗口技術(shù)[13-14]可以觀察出官能團隨外界干擾發(fā)生變化的時間段,能夠?qū)⑽镔|(zhì)的靜態(tài)檢測轉(zhuǎn)變?yōu)閯討B(tài)分析,明顯的對比出不同溫度對肉品的影響。核磁共振反映的是氫質(zhì)子的運動狀態(tài),而近紅外光譜反映了含H鍵官能團的分子振動狀態(tài)。2種獨立的技術(shù)從不同維度上反映了水分子的結(jié)構(gòu)與狀態(tài),起到了相互補充,相互印證的作用。將核磁、近紅外與移動窗口二維光譜技術(shù)相結(jié)合,在解決不同官能團重疊、準確識別光譜信號變化的同時,還能確定官能團發(fā)生變化的時序以及官能團與不同分子水的相似來源。

近年來,利用低場核磁或近紅外研究牛肉加工方面已有文獻報道,但未見將核磁、近紅外與移動窗口二維相關(guān)光譜技術(shù)相結(jié)合應(yīng)用于食品領(lǐng)域的相關(guān)研究。本研究從分子層面出發(fā),利用現(xiàn)代光譜技術(shù)依次從紅外譜、二維相關(guān)譜、近紅外-核磁異質(zhì)譜圖逐級對牛肉熟化過程進行動態(tài)跟蹤。通過分析譜圖特征峰變化趨勢和規(guī)律,探討不同加熱溫度對牛肉水分狀態(tài)的影響,揭示牛肉熟化過程中的結(jié)構(gòu)變化機理,確定各種官能團的變化時序,為牛肉熟化機制研究提供一種新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗樣品:牛肉里脊(河南,洛陽,優(yōu)品生鮮超市)。

1.2 儀器與設(shè)備

JA5003B型電子分析天平,上海精科儀器有限公司;DHG9425A型鼓風(fēng)干燥箱,上海恒科學(xué)儀器公司DF-101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器,河南省予華儀器有限公司;MINI20-015V-I型低場核磁共振成像分析儀,上海紐邁電子科技有限公司;Brucker Vector 33型傅立葉變換紅外光譜儀,德國BRUCKER公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 試驗設(shè)計

將所購買的新鮮牛里脊肉剝?nèi)ケ砻娴慕钅ず椭?肉樣切割為4 cm×4 cm×2 cm的牛肉塊,并將其分裝于食品級蒸煮袋中,最后將樣品置于不同加熱溫度(60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120 ℃)的油浴鍋中加熱。分別測定其水分分布狀況,各指標重復(fù)測定3次,分析牛肉在熱加工過程中水分遷移規(guī)律。

1.3.2 指標測定

1.3.2.1 水分分布的測定

取每個樣品中心位置約1 g的牛肉條分別裝入直徑為15 mm的核磁專用瓶內(nèi),將核磁瓶放置于磁體永久磁場中心位置。在肉樣測定之前,首先利用分析軟件FID(free induction decay)脈沖序列對系統(tǒng)參數(shù)進行校正,再利用CPMG(carr-purcell-meiboom-gill)脈沖序列采集樣品橫向弛豫時間(T2),重復(fù)測定3次。主要參數(shù)設(shè)置為:SF(MHz)=21,O1(Hz)=305 957.14,P90(μs)=13.00,P180(μs)=26.00,TD=74 990,PRG=1,TW(ms)=1 000.000,TE(ms)=0.250,NECH=3 000,SW(kHz)=100,RFD(ms)=0.080。

1.3.2.2 近紅外光譜采集

通過傅立葉變換近紅外光譜儀采集牛肉熱加工過程中的光譜。采集光譜范圍:10 000～4 000 cm-1(780～2 500 nm);掃描次數(shù):64次;分辨率:8 cm-1。每個樣品采集光譜3次,取平均光譜。

1.4 數(shù)據(jù)分析

每組實驗數(shù)據(jù)重復(fù)測定3次,取平均值,采用SPSS 21.0軟件完成數(shù)據(jù)統(tǒng)計,采用Origin 8.0軟件繪圖,在2D shige軟件上進行二維相關(guān)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同加熱溫度下的牛肉橫向弛豫圖譜

牛肉在加熱過程中蛋白質(zhì)發(fā)生變性,進而產(chǎn)生一系列物理特性的變化,這會影響牛肉的水分分布情況。通過低場核磁共振的橫向弛豫時間(T2)分析了牛肉加熱過程中3種組分水的變化。圖1是在不同加熱溫度下加熱一定時間后牛肉的LF-NMR多組分弛豫圖譜。

a-3 min;b-15 min圖1 不同加熱溫度下加熱3 min、15 min的牛肉T2分布圖Fig.1 Distribution of beef T2at different heating temperatures for 3 min and 15 min

T2橫向弛豫時間H質(zhì)子自旋核在外加磁場收到射頻脈沖的激發(fā)后,系統(tǒng)內(nèi)部達到橫向熱平衡所需要的時間,其值越大反映水分子的流動性越強[15]。肉品在熟化過程中,核磁峰面積和峰形狀都發(fā)生了顯著變化。由圖1可見,弛豫時間圖譜出現(xiàn)3個核磁峰,從左至右分別對應(yīng):結(jié)合水1～10 ms(T21)、不易流動水10～100 ms(T22)、自由水100～1 000 ms(T23)。根據(jù)峰積分面積及其變化可知不同組分水的含量及遷移情況。T21表示的是一種存在于細胞內(nèi)與大分子物質(zhì)緊密結(jié)合的水,結(jié)構(gòu)比較穩(wěn)定。由圖1可以看出,熱加工過程中T21變化很少。T22代表不易流動水,又稱半結(jié)合水,主要分布于肌原纖維及細胞膜之間。圖1中T22峰峰面積、信號強度最大,說明牛肉中水分主要以不易流動水狀態(tài)存在。隨著加熱溫度升高,T22峰的峰高顯著降低并且T22峰逐漸變寬;說明有一部分不易流動水會轉(zhuǎn)化為游離的自由水。加熱溫度越高及加熱時間越長,T22下降得越多。T23表示存在于細胞外間隙的水分,而鮮肉中沒有自由水,隨著加熱溫度不斷升高,加熱時間逐漸延長,自由水含量顯著升高。結(jié)合水被看作是一種以氫鍵的形式與肌肉固形物相結(jié)合的強極性基團形成的單分子層水,半結(jié)合水是親水基團周圍的多層水及鄰近水。蛋白質(zhì)變性后,其特有的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,局部呈現(xiàn)出不規(guī)則的線狀結(jié)構(gòu)[16]。環(huán)繞肽鏈周圍單層水和多層水的形態(tài)也會發(fā)生變化。因此,3個核磁峰向左移動、馳豫時間都變短,這是由蛋白質(zhì)和水分子之間的平均間距縮短所致。而牛肉在新鮮狀態(tài)下及較低加熱溫度加熱初期不存在T23峰,在80 ℃加熱3 min的條件下,開始出現(xiàn)T23峰。并隨著加熱溫度的升高,不易流動水向自由水轉(zhuǎn)換的速率變快。

2.2 牛肉熟化過程中的近紅外光譜分析

利用近紅外光譜結(jié)合二維相關(guān)光譜研究牛肉熟化過程中的變化機理。由圖2可知,不同加熱溫度下的牛肉光譜與鮮樣相比出現(xiàn)顯著的改變,如890、945、1 430、1 750、2 070 nm處反射值明顯增大,鮮肉經(jīng)熱加工處理后出現(xiàn)原先沒有的波峰,并且波峰和波谷都向長波方向移動。造成這些差異的原因是,牛肉在經(jīng)過熱加工處理之后,蛋白質(zhì)熱變性,其中的分子間作用力發(fā)生了改變,主要是氫鍵的含量發(fā)生了顯著變化。當近紅外光照射在樣品上,樣品內(nèi)的含氫基團會選擇性地吸收部分特定頻率的近紅外光,加熱處理影響官能團中的O—H、C—H、N—H、S—H的基團振動特征改變,代表相關(guān)的分子結(jié)構(gòu)發(fā)生變化[17]。

圖2 牛肉不同加熱溫度下加熱的原始近紅外光譜Fig.2 Raw NIR spectra of beef heated at different heating temperatures

2.3 牛肉熟化過程中的二維近紅外相關(guān)光譜分析

二維相關(guān)紅外光譜技術(shù)將一維的近紅外光譜在二維上展開,可以將重疊的小峰和弱峰清晰地顯示出來,提高光譜的分辨率。同時該技術(shù)還能將官能團在外界干擾作用下的變化順序在圖中清楚地反映出來,從而有助于對牛肉肌肉熟化機理的研究。二維相關(guān)光譜中,在對角線上的峰為自動峰,總是正值;對角線外的峰為交叉峰,分為正交叉峰和負交叉峰。另外,圖中顯示區(qū)域,紅色為正峰,藍色為負峰[18]。

圖3-a和圖3-b為牛肉熟化過程中近紅外光譜經(jīng)二維相關(guān)分析得到的同步和異步譜圖,不同加熱溫度的牛肉同步二維紅外相關(guān)光譜主要在945 nm/945 nm、1 430 nm/1 430 nm附近出現(xiàn)了2個自相關(guān)峰,其峰強度依次為945 nm/945 nm>1 430 nm/1 430 nm,這2個自相關(guān)峰都是水分在近紅外波段的吸收帶,分別為O—H的四倍頻振動和二倍頻振動[19-20]。同時,在對角線外出現(xiàn)交叉峰,在890 nm/1 380 nm、1 380 nm/890 nm處出現(xiàn)正交叉峰,而890和1 380 nm處都是C—H伸縮振動,說明自相關(guān)峰光譜強度與牛肉熟度之間呈正相關(guān)[21]。此外還存在6個負交叉峰:945 nm/2 070 nm、2 070 nm/945 nm、1 430 nm/2 070 nm、2 070 nm/1 430 nm、1 750 nm/2 070 nm、2 070 nm/1 750 nm處,1750和2 070 nm處分別歸屬于S—H二倍頻振動和N—H彎曲振動(稱為酰胺II帶),說明與牛肉熟度呈負相關(guān)。在圖3-b中只檢測到交叉峰,有4個正交叉峰,分別在890 nm/1 200 nm、890 nm/1 430 nm、890 nm/1 670 nm和890 nm/2 070 nm處。其強度依次為890 nm/1 430 nm>890 nm/1 200 nm>890 nm/1 670 nm>890 nm/2 070 nm。另外還有4個負交叉峰,分別在1 670 nm/890 nm、1 430 nm/860 nm、1 200 nm/890 nm和2 070 nm/890 nm處。根據(jù)Noda[22-23]規(guī)則,可以推斷出牛肉熟化過程中不同官能團的變化時序為945 nm>890 nm>1 430 nm>2 070 nm>1 750 nm,即氫鍵變化時序為O—H→C—H→N—H→S—H。

a-同步二維近紅外相關(guān)光譜圖;b-異步二維近紅外相關(guān)光譜圖圖3 不同加熱溫度下牛肉的同步和異步二維近紅外相關(guān)光譜圖Fig.3 Synchronous and asynchronous 2D NIR spectra of beef at different heating temperatures

2.4 近紅外-核磁異質(zhì)譜圖分析

二維異質(zhì)相關(guān)光譜常被用于檢測2種不同光譜的共變特征。正相關(guān)說明2種不同光譜強度變化一致或存在相似來源。為深入探討牛肉熟化過程中的官能團和水分變化的關(guān)系,得到了NIR光譜與核磁共振波譜之間的異質(zhì)二維相關(guān)光譜圖。

如圖4-a異質(zhì)相關(guān)譜圖同步圖所示,核磁馳豫時間大于100 ms的T23與NIR的1 430、1 685與2 050 nm附近形成3個較明顯的正相關(guān)峰,表明合頻O—H、二倍頻C—H、二倍頻O—H與自由水有相似來源;在圖4-b異步圖中,T23與NIR的945、1 430 nm附近有2個明顯的正相關(guān)峰,四倍頻O—H、合頻O—H與自由水有相似來源,并且四倍頻O—H比合頻O—H優(yōu)先變化;同時在這幾處位置與T22附近同樣有相應(yīng)的負相關(guān)峰,說明加熱使牛肉細胞內(nèi)O—H、C—H等處的分子結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,牛肉細胞空間結(jié)構(gòu)被破壞,細胞保水性變差,不易流動水不斷向自由水轉(zhuǎn)化并逐漸溢出細胞。

a-同步譜圖;b-異步譜圖圖4 二維NIR/NMR異質(zhì)相關(guān)光譜圖Fig.4 Two-dimensional NIR/NMR heterogeneous correlation spectrum

2.5 牛肉熟化過程移動窗口二維相關(guān)光譜分析

擾動相關(guān)移動窗二維(perturbation related moving window 2D,PCMW2D)分析[24]將動態(tài)光譜變量與窗口大小為(2m+1)的子數(shù)據(jù)集中的動態(tài)擾動變量相關(guān)聯(lián)。通過在整個擾動區(qū)域上移動窗口位置并計算每個窗口的相關(guān)函數(shù),繪制映射譜圖,就能獲得沿擾動方向的光譜變化信息。此后Thomas等進一步發(fā)展了移動窗二維(moving window two dimensional,MW2D)相關(guān)光譜技術(shù),2DCOS能夠清晰地給出光譜變量之間的相關(guān)性和變化順序。

采用移動窗口技術(shù)進一步揭示牛肉熟化過程中物質(zhì)成分的變化過程,結(jié)果如圖5所示。由圖5-a中可以看出,牛肉加熱3 min時,在945、1 430和1 750 nm處出現(xiàn)強的紅外光譜峰,3個光譜峰分別是O—H四倍頻振動,O—H二倍頻振動和S—H二倍頻振動。在加熱時間延長至15 min時,同樣的位置也出現(xiàn)了波譜峰,但其強度明顯低于加熱3 min時的波譜峰強度。在移動窗口H核磁共振譜圖中,牛肉在加熱初期(3 min),在加熱溫度70 ℃處出現(xiàn)2個核磁波譜峰,其波譜峰強度為55δ>65δ,兩波譜峰分別代表半結(jié)合水和自由水,表明加熱初期半結(jié)合水比自由水變化強度大;在加熱后期(15 min)同樣的化學(xué)位移處出現(xiàn)2個核磁波譜峰,但自由水的變化強度明顯高于半結(jié)合水。根據(jù)Nada的二維光譜理論,自動峰的圓圈數(shù)越多,待測體系受外擾變化強度越大。上述結(jié)果說明,當溫度達到70 ℃后,牛肉分子結(jié)構(gòu)開始發(fā)生變化,分子間的氫鍵大量斷裂,水溶性蛋白質(zhì)開始凝固,牛肉細胞的保水性逐漸變差,細胞內(nèi)的水分慢慢遷移到肉品的表面。80 ℃以后,由于對熱敏感的分子結(jié)構(gòu)已被改變,其他物質(zhì)結(jié)構(gòu)保持了相對穩(wěn)定、變化緩慢。直到溫度達到105 ℃左右,牛肉的近紅外光譜和核磁譜又開始劇烈變化,在945和1 430 nm處又出現(xiàn) 2個 紅外光譜峰,該峰分別是O—H四倍頻振動和O—H二倍頻振動。T23峰位置左移,游離水中H質(zhì)子弛豫時間縮短。說明100 ℃ 以上的高溫進一步破壞牛肉物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)。大量無序卷曲形成和大量疏水鍵暴露,導(dǎo)致肽鏈與水分子形成氫鍵的類型增加,蛋白質(zhì)和水分子之間的平均間距縮短。110 ℃以后,物質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化再次趨于緩和。高溫對牛肉的影響將主要通過時間累積完成,這一發(fā)現(xiàn)與高溫肉制品殺菌過程的經(jīng)驗認知相一致。

a-3 min移動窗口近紅外光譜;b-15 min移動窗口近紅外光譜;c-3 min H核磁共振譜;d-15 min H核磁共振譜圖5 不同加熱溫度下牛肉的移動窗口近紅外光譜和H核磁共振譜Fig.5 Moving window near-infrared spectra and H NMR spectra of beef under different heating temperatures

3 結(jié)論

基于CPMG序列測定牛肉在不同加熱溫度和時間下的橫向弛豫時間T2,分析了核磁信號峰的參數(shù)。結(jié)果表明肉樣中存在3種不同水分群,隨著加熱溫度升高,時間延長,LF-NMR多組分弛豫圖譜中代表不易流動水的峰面積減小,而自由水的峰面積隨之增大。在峰形狀上,T22峰高度明顯降低,寬度增大;T23峰出峰后變寬;3個峰峰位置都顯著左移。牛肉受熱過程中NIR光譜變化特征是890、945、1 430、1 750、2 070 nm處,物質(zhì)對近紅外光吸收減少,反射值增高。

對不同溫度下加熱的牛肉進行了二維相關(guān)光譜和移動窗口分析,結(jié)果表明氫鍵光譜的變化時序為:945 nm>890 nm>1 430 nm>2 070 nm>1 750 nm,可以推斷出牛肉熟化過程中不同官能團的變化時序為O—H→C—H→N—H→S—H。研究結(jié)果還顯示,加熱溫度對牛肉分子結(jié)構(gòu)的影響是非線性的,明顯分為2個階段。溫度達到70 ℃后,核磁共振譜和近紅外光譜都劇烈變化;溫度達到100～110 ℃時,牛肉波譜再次劇烈改變。結(jié)合牛肉的物質(zhì)結(jié)構(gòu)可推知,70～80 ℃時對熱敏感的分子受到影響,如水溶性蛋白質(zhì)開始失活變性,半結(jié)合水發(fā)生遷移;但依然有大量基團保持了穩(wěn)定。蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)直到100～110 ℃的高溫才被進一步破壞,大量氫鍵斷裂以及疏水基團暴露。這揭示了低溫/高溫肉制品分別選擇70 ℃和110 ℃附近進行熱處理的合理性。本文通過核磁共振和近紅外光譜相結(jié)合的波譜技術(shù),分析了肉品受熱時的水分遷移及分子振動變化規(guī)律,為低溫/高溫肉品熱加工技術(shù)提供科學(xué)參考。