E49F對麥氏交替單胞菌木聚糖酶XynZT-2的活性分析

石嘉寧,吳俊濤,崔彩霞,李同彪,周晨妍*

1(新鄉醫學院 生命科學技術學院,河南省合成生物學工程實驗室,河南 新鄉,453003) 2(黃淮學院 生物與食品工程學院,河南省農(副)產品資源化利用工程研究中心,河南 駐馬店,463000)

木聚糖(xylan)是半纖維素的重要組成成分,是一種可再生生物資源[1-2]。由于木聚糖的復雜性,完全水解需要主鏈和側基裂解酶的協同作用。木聚糖酶主要包括:內切β-1,4-木聚糖酶和β-木糖苷酶。其中內切-β-1,4-木聚糖酶是所有木聚糖酶中最重要的一種,能夠水解木聚糖分子主鏈內部的β-1,4-糖苷鍵,隨機切割生成木糖、低聚木糖和阿拉伯木聚糖等功能性還原糖[3-4]。目前為止,已有許多方法可提高酶的活性,通過對蛋白結構進行生物信息學分析,利用分子改造或化學修飾等方法,從而提高酶的活性[5]。研究發現,GH10、11、2、6、5、7、8、16、43、62家族的部分糖苷水解酶具有木聚糖酶活性,然而,根據催化特性、氨基酸序列以及空間結構不同,木聚糖酶主要分布于GH10和GH11家族[6]。近幾年研究發現,GH43家族的木聚糖酶有較高的催化效率和底物選擇性等。

木聚糖酶作為一種重要的工業酶制劑,在食品、造紙與飼料領域被廣泛應用[7-9]。不同來源的木聚糖酶的酶學性質有所不同,研究發現天然存在的木聚糖酶極少可以兼具耐熱性和高活性[10-13]。目前對于木聚糖酶的分子改造研究主要集中在對酶的耐熱性改造方面。然而,大多數改造后的木聚糖酶在耐熱性提高的同時伴隨著活性的下降,這在一定程度上限制了耐熱木聚糖酶在工業中的應用。因此,越來越多的研究者對木聚糖酶進行分子改造以期獲得酶學性質優良的工業化木聚糖酶[14]。前期本實驗室已從山東煙臺近海區域分離得到麥氏交替單胞菌,并從該菌克隆出了GH43家族木聚糖酶基因XynZT-2(Genbank NO.:MT814836),酶學性質分析發現,該酶的酶活力較低,不利于后期的酶學特性研究。本研究旨在利用計算機輔助設計,將第49位點的氨基酸由Glu突變為Phe,以期獲得酶活力提高的突變木聚糖酶,探討該酶的催化分子機制,為后期催化活性分子改造奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

麥氏交替單胞菌(Alteromonasmacleodii)HY35由實驗室保存,克隆宿主大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α購自Novagen公司,表達宿主E.coliBL21(DE3)、質粒pET28a購于Invitrogen公司。

樺木木聚糖,Sigma公司;制性內切酶EcoRⅠ、Hind Ⅲ、E×TaqDNA聚合酶、T4DNA連接酶、DNA Marker,寶日醫生物技術(北京)有限公司;異丙基-β-D-硫代半乳糖糖苷(isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside,IPTG)、卡那霉素,天津希恩思生化科技有限公司;SanPrep柱式DNA小量抽提試劑盒,上海生工生物工程有限公司;瓊脂糖凝膠膠回收試劑盒,北京索萊寶科技有限公司;磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液(pH 3.0～5.0)、磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液(pH 6.0～7.0),天津市德恩化學試劑有限公司;Tris-鹽酸緩沖液(pH 8.0)、甘氨酸-氫氧化鈉(pH 9.0),北京索萊寶科技有限公司。

1.2 突變位點的篩選

根據Alteromonasmacleodii木聚糖酶XynZT-2基因序列,利用DNAMAN6.0及BLAST同源氨基酸序列比對分析XynZT-2,通過SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/)進行三維結構建模。利用Discovery Studio 3.0軟件的LibDock程序的默認參數將重組木聚糖酶與底物木三糖進行分子對接,并利用Discovery Studio 3.0和PyMOL(http://pymol.org/)分析木聚糖酶結構與底物之間的相互作用。

1.3 引物設計

送至蘇州金唯智生物科技有限公司合成,如表1所示。

表1 定點突變的引物設計Table 1 Design of primers for the site-specificed mutagenesis

1.4 重組工程菌的構建

從麥氏交替單胞菌基因組克隆得到木聚糖酶基因xynZT-2,并以木聚糖酶基因xynZT-2為模板,利用重疊延伸PCR技術,PCR擴增條件:94 ℃預變性2 min;94 ℃變性30 s,52 ℃退火45 s,72 ℃延伸1 min;經30個循環后72 ℃延伸10 min。擴增產物由限制性內切酶EcoRⅠ和Hind Ⅲ酶切后與載體pET28a連接,轉化至E.coliBL21(DE3),通過測序確定得到重組質粒pET28a-xynEF。

1.5 重組工程菌的誘導及表達

將重組菌BL21(DE3)/pET-28a-xynEF接種于3 mL LB抗性培養基中,37 ℃,220 r/min培養12 h,以1%的接種量轉接至100 mL LB培養基,培養至菌濃度OD600值至0.6～0.8,加入0.4 mmol/L IPTG,24 ℃誘導12 h;誘導結束后離心(8 000 r/min,5 min),收集菌體,加入5 mL pH 6.0的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液懸浮菌體,通過細胞破碎法釋放胞內物質,高速離心(8 000 r/min,20 min),上清液即為粗酶液。

1.6 重組木聚糖酶活力測定

將純化所得的酶液稀釋至0.5 mg/mL;二硝基水楊酸(dinitrosalicylic acid,DNS)法[15]測酶活力,取1.5 mL 0.5 mg/mL的樺木木聚糖底物與1 mL酶液在最適溫度水浴中反應15 min。在pH 6.0磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液的條件下,以1 min產生1 μmol木糖所需要的酶量定義為1個酶活力單位(U)。

1.7 蛋白純化與SDS-PAGE

采用His TrapTMHP-5 mL對含His標簽蛋白進行分離純化[16]。將5×SDS蛋白上樣緩沖液加入到處理好的酶液中,混勻后煮沸10 min,將其變性,8 000 r/min離心10 min,取上清液進行SDS-PAGE電泳檢測,染色40 min,脫色至底色透明,觀察蛋白條帶。

1.8 木聚糖酶酶學性質測定

1.8.1 最適溫度及溫度穩定性

將純化所得的酶液稀釋至0.5 mg/mL;在35～80 ℃與底物反應15 min,分別測定突變酶與原酶的酶活力,以最高酶活力為100%,計算相對酶活力,以此得到突變酶與原酶的最適溫度。將純化后的酶液在最適溫度保溫0～60 min,每隔5 min取樣,測定各個時間段保溫后殘余酶活力,以未保溫酶的活力為100%,由此得到酶的熱穩定性。

1.8.2 最適pH及pH穩定性

在最適溫度的條件下,將0.5 mg/mL酶液與不同的pH 3～9緩沖液配制的木聚糖底物反應15 min,以不同pH的酶液為對照,測定酶活力后以最高者為100%,作pH與相對酶活力的曲線。將酶液與不同pH值的緩沖液混合使質量濃度為0.5 mg/mL于40 ℃保溫60 min,在最適溫度下測定殘余酶活力,與不保溫的酶活力比,計算出相對酶活力,得出pH穩定性。

1.9 動力學參數的測定

最適條件下測定木聚糖酶的酶活性,以不同質量濃度的木聚糖溶液(1.0～10.0 mg/mL)為底物,在pH 7.0的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液的條件下,通過Origin 2018軟件進行非線性擬合,計算酶的kcat及kcat/Km值。

2 結果與分析

2.1 木聚糖酶XynZT-2同源建模及突變位點選擇

將木聚糖酶XynZT-2的氨基酸序列提交至SWISS-MODEL同源建模。XynZT-2與來源于Xanthomonas citri的GH43家族木聚糖酶(PDB No.6xn0.1.A)模板之間的序列同源性為60.36%。XynZT-2預測模型的“GMQM”評分為0.85,“QMEAN”評分為-2.07,達到了高質量模型的標準[17]。由預測模型可知(圖1),XynZT-2主要由5組β-折疊片層圍繞中心軸腔形成桶狀,屬于GH43家族典型結構[18],其催化殘基由Asp30、Asp150和Glu237構成(圖1-a)。研究表明,底物進出口通道正面和背面的氨基酸殘基進行疏水性取代可提高酶的催化活性[19],任蕊蕊等[20]將谷氨酰胺轉氨酶TGase底物進出口通道背面的Glu300替換成疏水性的色氨酸(Trp),酶的催化活性明顯提高。結合以上報道,通過分析XynZT-2結構發現,Glu49位于底物進出口通道的背面,且其空間鄰近區域有以小的α-螺旋結構,剛性較強,不利于底物的進出(圖1-b)。因此,嘗試將Glu49突變成疏水性氨基酸Phe,以分析其對酶活性的影響。

圖1 木聚糖酶XynZT-2三維結構模型及其催化活性口袋Fig.1 Three-dimensional structure model of the xylanase XynZT-2 and its catalytic activity pocket注:棒狀結構表示氨基酸殘基,表面溶劑區域表示催化活性口袋。

2.2 重組工程菌的構建

通過重疊延伸PCR方法獲得目的基因(圖2),將獲得突變后的基因序列xynZT-2EF與載體pET28a進行雙酶切,經T4DNA連接酶連接,構建重組表達質粒。將重組質粒轉化至E.coliBL21(DE3),通過抗性篩選,獲得目的基因陽性克隆子BL21(DE3)/pET28a/xynEF。

M-Marker;a1-基因xynZT-2;b1～3-突變基因上段;b4～5-突變基因下段;c1-基因xynZT-2E49F圖2 突變基因片段Fig.2 The fragments of the mutant gene

2.3 重組菌的驗證與表達

從陽性克隆子提取重組質粒。將載體與突變酶重組質粒BL21(DE3)/pET28a和xynEF在37 ℃同時進行雙酶切5 h,結果顯示,在5 369 bp和1 029 bp處均有目的條帶,測序驗證正確且與突變后的序列一致,表明重組工程菌構建成功(圖3-a)。

M-Marker;a1-pET28a質粒;a2-重組菌XynEF;b1-pET28a質粒;b2-BL21(DE3)/pET28a/XynEF粗酶液;b3-BL21(DE3)/pET28a/XynEF純酶液圖3 雙酶切驗證及SDS-PAGE凝膠電泳檢測Fig.3 Identified by restriction enzyme digestion and the SDS-PAGE gel electrophoresis

將粗酶液進行蛋白純化,通過SDS-PAGE凝膠電泳結果顯示,在大約42 kDa出現目的條帶,與該酶預測分子質量38.9 kDa相接近。該結果表明重組木聚糖酶蛋白成功表達(圖3-b)。

2.4 酶學性質分析

2.4.1 溫度穩定性與酶活性的分析

原酶XynZT-2與突變酶XynEF都呈現出先升高后降低的趨勢。原酶XynZT-2最適溫度為45 ℃,與原酶相比突變酶XynEF的最適溫度提高了25 ℃,當溫度達到70 ℃以上時相對酶活力明顯降低,溫度升高至80 ℃后相對酶活力降低至20%以下(圖4-a)。在60 ℃保溫60 min,原酶XynZT-2相對酶活力損失在20%左右,突變酶XynEF相對酶活力損失在40%左右。由此可見,突變酶XynEF的熱穩定性明顯低于原酶XynZT-2。另外,原酶XynZT-2與突變酶XynEF在保溫10 min后,熱穩定性迅速下降,相對酶活力分別下降到79.65%和64.75%,之后逐漸趨向平衡,熱穩定性沒有明顯變化(圖4-b)。推測可能是原酶XynZT-2與突變酶XynEF熱處理時,一開始酶分子對溫度較為敏感,結構發生明顯變化,酶熱穩定性下降速度快。隨著熱處理時間的延長,酶分子結構趨于穩定,導致熱穩定性變化不太明顯。

a-酶的最適溫度;b-酶的溫度穩定性;c-酶溫度的穩定性實驗的酶活力變化圖4 溫度對酶活力及穩定性的影響Fig.4 Effect of temperature on the enzyme activities and stabilities

在各自最適溫度下測定原酶和突變酶的酶活力發現,原酶XynZT-2的酶活力為0.083 U/mL,突變酶XynEF的為0.530 U/mL,相比原酶XynZT-2提高了6.4倍。另外,在60 ℃保溫60 min,比酶活力的下降趨勢與熱穩定性基本保持一致。在保溫60 min后,原酶XynZT-2僅保留0.065 U/mL的酶活力,而突變酶XynEF仍保留高于原酶5倍的酶活力(0.324 U/mL)(圖4-c)。由此可見,E49F突變使得突變酶XynEF的熱穩定性下降,而突變酶XynEF的最適溫度和酶活力明顯提高。

2.4.2 最適pH與pH穩定性的分析

原酶XynZT-2最適pH值為6.0,突變酶XynEF最適pH值為7.0,因此,木聚糖酶在最適pH值方面上升了1個pH單位(圖5-a)。突變酶XynEF在pH 3.0～5.0時相對酶活力低于20%;在pH 6.0～9.0時,與原酶XynZT-2相比突變酶XynEF相對酶活力沒有顯著下降。在pH 3.0～6.0的穩定性與原酶XynZT-2相比,可知突變酶XynEF的相對酶活力降低了37%;在pH 7.0～8.0相對酶活力大于80%且略高于原酶XynZT-2(圖5-b)。由此可以得出,該突變對木聚糖酶XynEF pH穩定性沒有明顯改善。

a-最適pH;b-酶的pH穩定性圖5 pH對酶活力及穩定性的影響Fig.5 Effect of pH on the enzyme activities and stabilities

2.4.3 酶動力學分析

XynZT-2與XynEF的動力學參數如表2所示。突變酶的Km值為1.078 mmol/L,相比原酶(15.120 mmol/L)明顯下降,由此表明,突變酶對底物的親和力增強。突變酶的催化效率kcat/Km值為115.636 L/(mmol·min),原酶的催化效率值kcat/Km為11.446 L/(mmol·min)。突變酶的kcat/Km值相比原酶提高了10.1倍,催化效率明顯提高。

表2 木聚糖酶的動力學分析Table 2 Dynamics analysis of the xylanases

2.5 催化效率和穩定性機制分析

針對突變酶XynEF酶活力提高的原因進行分析,以原酶XynZT-2的空間模型為模板,利用SWISS-MODE同源建模。所構建的XynEF模型“GMQM”評分為0.89,“QMEAN”評分為-1.79,同樣達到高質量模型的標準。分析原酶XynZT-2和突變酶XynEF結構發現,在原酶XynZT-2中的Glu49與周圍氨基酸殘基沒有發生相互作用(圖6-a)。而在突變酶XynEF的結構模型中,由于第49位點谷氨酸(Glu)突變為苯丙氨酸(Phe),Phe49與空間鄰近氨基酸Pro53和Leu314分別形成疏水作用(圖6-b),穩定了Phe49與周圍殘基的局部結構。同時,由于E49F突變,使得第49位點鄰近區域的小片段α-螺旋變短,由原酶的6個氨基酸殘基(50-AGIPFN-55)變為3個氨基酸殘基(51-GIP-53),而相應的第49位點所在的Loop結構變長,柔韌性增強。

a-XynZT-2三維結構;b-XynEF三維結構圖6 重組木聚糖酶XynZT-2與突變酶XynEF結構分析Fig.6 Structural analysis of the recombinant XynZT-2 and the mutant XynEF注:棒狀結構表示氨基酸殘基,紫色虛線表示疏水作用,黃色方框表示突變位點空間鄰近結構。

結構分析發現,第49位點所在的Loop區域位于酶催化活性口袋的進出通道。研究表明,酶的進出通道的柔韌性改變會影響酶的催化活力[21]。為分析突變酶XynEF酶活力提高的原因,利用Discovery Studio 3.0軟件,以木三糖為模式底物與原酶XynZT-2和突變酶XynEF分別進行分子對接。底物木三糖無法與原酶XynZT-2的催化活性口袋結合,推測可能是原酶XynZT-2底物進出口通道較窄,同時通道口α-螺旋剛性較強、靈活性低,底物無法進入所致。這可能也是原酶XynZT-2酶活力較低的原因。突變酶XynEF可與底物木三糖有效結合,結果如圖7所示,底物平躺在催化口袋內部,3個催化殘基Asp30、Asp150和Glu237鄰近木三糖分子,Asp150和Glu237與底物木三糖形成氫鍵,Asp30沒有直接和木三糖形成氫鍵,而是通過水分子與木三糖間接形成氫鍵,以氫鍵形式實現質子或電子在催化殘基和木三糖分子間的傳遞(圖7-a)。同時,底物木三糖與催化口袋內的Ala99、Arg315、Thr286以及周圍水分子形成氫鍵,穩定底物木三糖的結合構象,從而有利于電子和質子的傳遞,促進酶的催化效率(圖7-b)。

圖7 突變酶XynEF與木三糖分子對接結果Fig.7 Molecular docking results of the mutant XynEF with xylotriose注:圖a中紫色棒狀結構表示木三糖分子,線性結構表示氨基酸殘基,橙色虛線表示氫鍵,綠色球狀表示水分子。

3 討論

在工業應用方面對酶的活性要求較高,需要通過蛋白質工程對酶進行改造。定點突變是酶改造的常用方法,該方法通過比較該酶的氨基酸序列,改變一個或多個氨基酸位點,從而改變酶的性質。通過針對性地改變一個或多個氨基酸位點,避免不必要的氨基酸突變,對突變結果也更具準確性和高效性[22-23]。目前,已有很多研究者通過對木聚糖酶進行分子改造并取得了一定的成果,但仍未能達到工業化的水平,因此改善木聚糖酶催化特性研究還有待進行。

本研究Alteromonasmacleodii木聚糖酶xynZT-2基因,通過大腸桿菌實現了高效表達。利用同源建模及酶底物進出通道、催化活性口袋分析,識別了影響木聚糖酶XynZT-2催化活性的關鍵氨基酸殘基Glu49,通過定點突變,構建例如突變酶XynEF。分析酶學特性發現,突變酶XynEF的最適溫度為70 ℃,相比原酶提高了25 ℃;在60 ℃保溫60 min,測定熱穩定性發現,突變酶的熱穩定性明顯低于原酶,這可能是由于突變酶中突變殘基Phe49鄰近區域的小片段α-螺旋變短,Loop結構變長,酶的柔性增加,結構穩定性降低所致。在最適溫度下,突變酶的酶活力相比原酶提高了6.4倍,酶活力明顯改善。突變酶的Km值相比原酶明顯下降,對底物的親和力增強,且突變酶的kcat/Km值相比原酶提高了10.1倍,催化效率明顯提高。通過分子對接分析發現,原酶酶活力較低可能是因為底物難以在催化活性口袋有效結合所致,而E49F突變導致突變酶的進出通道口發生改變,使得底物較易通過通道口在催化活性口袋內催化還原,從而提高了酶的活力和催化效率。本研究通過計算機模擬以及定點突變等技術獲得了催化性能明顯改善的突變木聚糖酶XynEF,豐富了GH43家族木聚糖酶的催化分子機制,并為GH43家族木聚糖酶分子改造研究提供了基礎。