副干酪乳酪桿菌甲基化轉移酶突變體響應滲透脅迫的代謝組學研究

吳美靈,張文羿*

1(內蒙古農業大學,乳品生物技術與工程教育部重點實驗室,內蒙古 呼和浩特,010018) 2(內蒙古農業大學,農業農村部奶制品加工重點實驗室,內蒙古 呼和浩特,010018)

DNA甲基化是一種天然的表觀遺傳修飾方式,它是在DNA甲基轉移酶(DNA methyltransferase,DNMTs)的作用下,以S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine,SAM)為甲基供體,將其轉移到基因組CpG二核苷酸胞嘧啶上,主要包括n6位腺嘌呤甲基化(6-methyladenine,6mA)、n4位胞嘧啶甲基化(4-methylcytosine,4mC)和c5位胞嘧啶甲基化(5-methylcytosine,5mC)3種類型[1]。DNMTs主要有DNMT3A和DNMT3B從頭甲基轉移酶和DNMT1維持性DNA甲基轉移酶兩類[2]。DNA甲基轉移酶可以直接或間接影響小RNA在滲透脅迫下的穩定性[3]。大腸桿菌中編碼腺嘌呤-N6甲基轉移酶的yfiC基因可以增強細胞在滲透脅迫下的存活能力[4]。pglX是一種編碼腺嘌呤特異性DNA甲基轉移酶的基因,與pglY、pglZ、pglW構成了整個噬菌體生長限制系統[5],包含于新型噬菌體防疫系統(bacteriophage exclusion,BREX)中,并對BREX介導的噬菌體抗性至關重要[6]。

副干酪乳酪桿菌(Lacticaseibacillusparacasei)是一株兼性厭氧型革蘭氏陽性菌株,常被作為發酵劑及輔助發酵劑用于乳制品的生產制作,尤其在干酪的生產中應用最多。副干酪乳桿菌4341作為輔助發酵劑提高了短熟Caciotta型奶酪的風味[7]。干酪的生產制作過程中菌株的生長會受到滲透脅迫的影響,在澳大利亞切達奶酪成熟期的不同階段,副干酪乳酪桿菌GCRL163表現出良好的耐鹽性[8]。TIAN等[9]通過高通量篩選技術篩選出的副干酪乳桿菌NCBIO01-M2突變體,能夠通過調節不飽和脂肪酸比例和細胞內相容性溶質來調節滲透脅迫響應機制。

代謝組學是(metabonomics/metabolomics)系統生物學的重要組成部分,可以對生物體內所有代謝物進行定性和定量分析。其主要將不同層次的信息整合在一起,以確定生物體的生化反應[10-12],目前在醫學和生命科學、食品和環境科學等領域應用廣泛[13-14]。超高效液相色譜-四極桿飛行時間串聯質譜聯用技術(ultra high performance liquid chromatography-quadrupole time of flight tandem mass spectrometry,UHPLC-QTOF-MS)是目前用于代謝物鑒定和代謝組學研究較為強大的分析技術。該技術結合了UHPLC的高分離效率和QTOF-質譜的卓越結構識別能力,能夠從復雜樣品中檢測數百甚至數千種成分[15]。

副干酪乳酪桿菌Zhang(LacticaseibacillusparacaseiZhang)分離自酸馬奶,是一株性狀優良的益生菌[16-19]。在此前研究中發現副干酪乳酪桿菌Zhang中存在N6甲基腺嘌呤位點,與BREX系統的pglX基因高度相似,為了解pglX基因的生物學功能,構建了副干酪乳酪桿菌Zhang甲基化轉移酶突變體(L.paracaseiZhang ΔpglX)[20-21]。本研究以副干酪乳酪桿菌Zhang甲基化轉移酶突變體及其野生型為研究對象,在含有1 mol/L NaCl的培養基中進行10 h的滲透脅迫處理,從代謝組學水平上揭示DNA甲基化轉移酶突變株與野生型菌株的滲透脅迫應答機制,以期獲得抗逆性強的優良菌株,為干酪制品的商業發酵劑開發提供研究基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗菌株

試驗菌株L.paracaseiZhang和甲基化轉移酶突變體L.paracaseiZhang ΔpglX,內蒙古農業大學乳品生物技術與工程教育部重點實驗室。

1.2 試劑與儀器

甲酸、乙腈、氨水(LC-MS級),美國Sigma公司。亮氨酸腦啡肽(leucine-enkephalin)、ACQUITY UPLC-Xevo G2 QTOF MS超高效液相色譜-四極桿飛行時間質譜儀、MassLynx 4.1工作站、Progenesis QI軟件,Waters公司;Milli-Q純水儀,Millipore公司;電熱恒溫培養箱,上海一恒科技有限公司;高速控溫離心機,Eppendorf公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌株活化

將-80 ℃冷凍保藏的L.paracaseiZhang和甲基化轉移酶突變體L.paracaseiZhang ΔpglX按2%的接種量接種于5 mL已滅菌的MRS液體培養基中,于37 ℃恒溫培養箱中培養24 h,即為活化菌株,需活化培養3代。

1.3.2 滲透脅迫

將活化好的L.paracaseiZhang和L.paracaseiZhang ΔpglX以2%的體積比接種于5 mL已滅菌MRS液體培養基中,于37 ℃恒溫培養箱中培養到OD600值為1,按2%接種量接種于含1 mol/L NaCl溶液的培養基中,37 ℃培養10 h,收集菌液,4 ℃、4 000 r/min離心10 min獲取發酵上清液。

1.3.3 UPLC-Q-TOF MS分析

1.3.3.1 樣品前處理

將發酵液樣品與乙腈按1∶1的比例混合均勻,4 ℃靜置20 min,以沉淀蛋白質。之后振蕩15 s,室溫離心10 000 r/min、15 min,吸取上清液。將其經0.22 μL微孔濾膜過濾至上樣瓶中,并將每個樣品吸取20 μL混合成為質量控制樣本(quality control,QC),以分析樣本相同的檢測方法,監測儀器在檢測過程中的穩定性。

1.3.3.2 高效液相色譜條件

使用Waters HSS T3色譜柱(1.8 μm,2.1 mm×100 mm),柱溫為35 ℃,進樣量、流速分別設置為5 μL 和0.32 mL/min。正離子模式下,流動相A1為0.1%甲酸-水溶液,B1為0.1%甲酸-乙腈溶液,采用梯度洗脫,梯度洗脫條件如表1所示。負離子模式下,流動相A2為0.1%氫氧化銨-水溶液,B2為純乙腈,梯度洗脫條件如表2所示。

表1 正離子模式下流動相梯度洗脫條件Table 1 Gradient elution conditions of mobile phase in positive ion mode

表2 負離子模式下流動相梯度洗脫條件Table 2 Gradient elution conditions of mobile phase in negative ion mode

1.3.3.3 質譜條件

質譜采用ESI源正離子(ESI+)和負離子(ESI-)模式掃描,以氮氣作為霧化氣,氬氣作為碰撞氣體,質荷比掃描范圍在50～1 200m/z。為確保數據的準確性,在正負離子模式下采用200 ng/μL亮氨酸腦啡肽為校正液。毛細管電壓為3 kV,離子源溫度為120 ℃,脫溶劑氣溫度為500 ℃,脫溶劑氣流速設置為800 L/h。

1.3.3.4 數據處理與統計學分析

將UPLC-QTOF MS采集的原始數據經Progenesis QI軟件完成峰提取、峰對齊、去卷積化等處理,使用MetaboAnalyst 5.0(http://www.metaboanalyst.ca)進一步對數據進行標準化處理,之后將數據導入SIMCA 14.0軟件完成多元統計分析,主要采用主成分分析(principal component analysis,PCA)和有監督的正交偏最小二乘判別分析(orthogonal partial least squares discriminant analysis,OPLS-DA)。最終結合P值≤0.05,變量投影重要性(variable importance in the projection,VIP)值≥1以及組間差異變化倍數(fold change,FC)≥2為差異代謝物篩選條件,并通過KEGG數據庫進行代謝通路分析。

2 結果與分析

2.1 滲透脅迫下代謝物主成分分析

通過SIMCA 14.0軟件對在滲透脅迫下L.paracaseiZhang和L.paracaseiZhang ΔpglX的代謝物進行PCA和OPLS-DA,結果如圖1所示,左右兩邊分別為正負離子模式下的PCA圖,可以看出QC樣本能夠很好的聚集在一起,并與突變組(M)和野生組(W)樣本有明顯的分離趨勢,表明檢測方法穩定且重復性良好。其中,第1主成分(PC1)將QC樣本和兩組(M組和W組)處理樣本分離,并且在正負離子模式下樣品總變化量分別為55.1%和58.2%;第2主成分(PC2)將QC與兩組(M組和W組)處理樣本分離,并且在正負離子模式下樣品總變化量分別為13.7%和20.7%。

a-ESI+;b-ESI-圖1 滲透脅迫下L.paracasei Zhang和L.paracasei Zhang ΔpglX的PCAFig.1 PCA of L.paracasei Zhang and L.paracasei Zhang ΔpglX under osmotic stress

在OPLS-DA正負離子模式下(圖2),突變組(M)與野生組(W)的3個平行樣本聚集在一起,表明實驗重復性較好,并且組間也有明顯的區分,說明在滲透脅迫下兩株菌株存在差異代謝物質。圖中橫坐標為主成分的得分值(Tp),可以看出組間的差異;縱坐標為正交成分得分值(TO),可以分辨出組內樣本間的差異。進一步進行S-PLOT分析,結果如圖3所示,圖中離中心越遠的點,表明其代謝物重要度越高,越能成為顯著差異代謝物。因此可以確定兩菌株在滲透脅迫條件下存在多個差異代謝物質。

a-ESI+;b-ESI-圖2 滲透脅迫下L.paracasei Zhang和L.paracasei Zhang ΔpglX的OPLS-DAFig.2 OPLS-DA of L.paracasei Zhang and L.paracasei Zhang ΔpglX under osmotic stress

圖3 滲透脅迫下L.paracasei Zhang和L.paracasei Zhang ΔpglX的S-PLOTFig.3 S-PLOT of L.paracasei Zhang and L.paracasei Zhang ΔpglX under osmotic stress

2.2 差異代謝物分析

根據OPLS-DA模型分析結果,結合T檢驗P值≤0.05、VIP值≥1和FC值≥2三個條件,篩選顯著差異代謝物。結果如表3所示,突變組(M)與野生組(W)相比共篩選出10個顯著差異代謝物,其中皮質醇、18-羥基皮質酮、四氫孕酮、脫氧肌苷、P1, P4-雙(5′-腺苷)四磷酸鹽等明顯增加,甜菜堿醛、糖衣去氧膽酸呈顯著下降趨勢。

表3 滲透脅迫下L.paracasei Zhang和L.paracasei Zhang ΔpglX的差異代謝物Table 3 Differential metabolites of L.paracasei Zhang and L.paracasei Zhang ΔpglX under osmotic stress

根據KEGG數據庫對篩選的10個差異代謝物進行富集分析得到如圖4所示的代謝通路富集分析圖,主要富集到類固醇激素生物合成、嘌呤代謝、甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝以及初級膽汁酸生物合成等多條代謝通路。圖5為差異代謝物富集通路圖,圖中能明顯看出各差異代謝物的上調和下調趨勢。

圖4 滲透脅迫下L.paracasei Zhang和L.paracasei Zhang ΔpglX的差異代謝物富集分析Fig.4 Differential metabolite enrichment analysis of L.paracasei Zhang and L.paracasei Zhang ΔpglX under osmotic stress

2.2.1 類固醇類激素

在滲透脅迫下L.paracaseiZhang ΔpglX與L.paracaseiZhang相比,主要差異代謝物為皮質醇、18-羥基皮質酮以及四氫孕酮等類固醇激素類物質,參與了類固醇激素生物合成代謝途徑。類固醇激素也稱甾體激素,是一類特殊的萜類脂質,其結構包含4個環烷烴環的甾體核心。甾體可以控制細胞增殖和分化,能夠通過質膜并與細胞內受體結合調節信號轉導等途徑,其中部分甾體在細胞與細胞的相互作用中充當信號分子[22-24]。甾體激素主要分為性激素和腎上腺皮質激素兩大類,是由膽固醇衍生而來的,其具有脂溶性[25-26]。腎上腺皮質激素可以合成糖皮質激素,即皮質醇。在本研究中皮質醇存在明顯上調趨勢,其具有升高血糖的作用。主要機制包括拮抗胰島素,減少葡萄糖利用,促進糖異生,增加骨骼肌蛋白和脂肪甘油三酯的分解等。同時該類物質還具有抗炎作用,但長期服用容易導致糖尿病、高血壓等疾病[27]。因此,DNA甲基化轉移酶突變體可以通過增加類固醇激素,提高類固醇激素生物合成來應對滲透脅迫。

2.2.2 核苷酸

DNA甲基化轉移酶突變株L.paracaseiZhang ΔpglX與野生型相比,在滲透脅迫下嘌呤代謝能力增強,主要以脫氧肌苷和P1, P4-雙(5′-腺苷)四磷酸鹽為顯著差異代謝物。脫氧肌苷也稱為次黃嘌呤脫氧核苷,是由脫氧腺苷殘基自發脫氨基產生的,正常的有氧呼吸產生的活性氧誘導也能生成脫氧肌苷[28-29]。在原核蛋白和真核蛋白中P1, P4-雙(5′-腺苷)四磷酸鹽(A[5′]P4[5′]A ammonium salt,Ap4A)與細胞分裂的控制有關[30-31]。有研究表明,將大腸桿菌(Escherichiacoli)和鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphimurium)暴露于氧化應激和熱休克環境中,Ap4A和二(5′-核苷酸基)寡磷酸鹽等相關核苷酸大量增加[32-33]。由此可以看出,與野生株相比甲基化轉移酶突變體能夠通過提高脫氧肌苷和Ap4A的產量,從而增強嘌呤代謝能力來應對滲透脅迫。

2.2.3 其他代謝物質

在滲透脅迫環境中,與野生株相比甲基化轉移酶突變體L.paracaseiZhang ΔpglX中甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝以及初級膽汁酸生物合成顯著富集,顯著差異代謝物主要為甜菜堿醛和糖衣去氧膽酸。甜菜堿醛在甜菜堿醛脫氫酶(betaine aldehyde dehydrogenase,betB)或膽堿氧化酶(choline oxidase,codA)的作用下可以合成甘氨酸甜菜堿[34],甘氨酸甜菜堿的積累可以抵消細胞在高滲透壓環境下水分的損失,并可以促進細胞生長,因此甘氨酸甜菜堿在多種原核生物和真核生物中被作為一種有效的滲透保護劑[35-36]。本研究中,甜菜堿醛的含量減少,表明甲基化轉移酶突變株通過增加甘氨酸甜菜堿的含量來應對滲透應激反應。此外,糖衣去氧膽酸(glycochenodeoxycholic acid,GCDCA)在膽柳糖水解酶(biliosaccharide hydrolase,cbh)的作用下可以合成甘氨酸和鵝去氧膽酸鹽(chenodeoxycholic acid,CDCA)。有研究表明,鵝去氧膽酸鹽可以提高微膠囊的滲透穩定性[37],這就表明在本研究中,DNA甲基化轉移酶突變體通過合成鵝去氧膽酸鹽來提高滲透脅迫下菌株生長的穩定性。

3 結論與討論

副干酪乳酪桿菌Zhang因其具有抗酸性以及抗膽鹽性,使其在乳制品的成產制作過程中發揮重要作用。本研究采用UHPLC-QTOF-MS代謝組學分析技術,比較了DNA甲基化轉移酶突變體L.paracaseiZhang ΔpglX與野生型L.paracaseiZhang在滲透脅迫下生長過程中的差異代謝物,利用主成分分析和正交偏最小二乘判別分析等多變量統計分析共篩選出10個顯著差異代謝,主要為皮質醇、18-羥基皮質酮、四氫孕酮、脫氧肌苷、P1, P4-雙(5′-腺苷)四磷酸鹽、甜菜堿醛以及糖衣去氧膽酸等,主要涉及到類固醇激素生物合成、嘌呤代謝、甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝以及初級膽汁酸生物合成等多條代謝通路,說明DNA甲基化轉移酶突變株能夠通過提高類固醇激素類和核苷酸類以及甘氨酸甜菜堿來應對滲透應激反應。這一結果為揭示DNA甲基表型缺失后副干酪乳酪桿菌Zhang的滲透脅迫分子機制提供理論和方法支持。