艷錦竹芋葉斑病病原菌的分離與鑒定

張徐玥，宋蘊哲，李悅悅，聶傳朋，李焰焰，蔡普默

（武夷學院 茶與食品學院，福建 武夷山 354300）

艷錦竹芋（Stromanthe sanguinea Triostar）又名三色竹芋、艷錦密花竹芋等，是竹芋科（Marantaceae）紫背竹芋屬（Stromanthe）的多年生草本植物[1]。艷錦竹芋原產于巴西，我國均有栽培，主要在南方地區。因其株型端正美觀，葉面上絢麗多彩的斑紋深受人們喜愛，具有較高的觀賞價值，是近年來流行的主要觀葉植物之一[2]，目前被廣泛應用于園林綠化中[3]。

竹芋科植物在生產栽培中，其葉部極易出現葉斑或葉枯等病害，影響植物的觀賞價值，嚴重時植株容易出現死亡[4-8]。近幾年，竹芋科植物在觀葉植物的應用熱潮中脫穎而出，我國引種品種和栽植面積都有所增加，然而病蟲害問題日益嚴重，不少學者逐漸展開對竹芋科植物病害的研究。例如，2019 年吳碧云報道紫背竹芋炭疽病的病原菌為暹羅炭疽（Colletotrichum siamense）[9]；2020 年趙京鵬報道孔雀竹芋基腐病的病原菌為天南星麗赤殼（Calonectria spathiphylli），為國內首次報道[10]；2021 年陳燦鈿等鑒定青蘋果竹芋葉斑病的病原菌為平臍蠕孢（Bipolaris sivanesaniana），亦為首次報道[11]。我國引種竹芋科植物的歷史不長，對其病害的研究較少[8,12]，而明確其病原菌種類是開展針對性病害防治及保障其安全生產的基礎。

以福建省武夷山市武夷學院園藝大棚內采集的患葉斑病艷錦竹芋葉片為試驗材料，通過對病原菌的分離純化，對其進行致病性測定、形態學觀察及分子鑒定，并結合系統發育樹的分析，對引起艷錦竹芋葉斑病的病原菌進行鑒定，旨在為艷錦竹芋葉斑病的診斷及防控提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 艷錦竹芋病害癥狀觀察與病葉采集

2021 年5 月，在福建省武夷山市武夷學院園藝大棚內對艷錦竹芋病癥進行觀察拍照，并采集病葉作為試驗樣品。

1.2 病原菌的分離、純化及保存

參考方中達的常規組織分離法分離出病葉樣品的病原菌并純化[13]。將病葉樣品用無菌水沖洗干凈后，在超凈工作臺里切取若干塊2 mm×2 mm 病健交界處的病葉組織，用75%酒精浸泡30 s 消毒后，無菌水沖洗3 次，風干后放置在馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar,PDA）培養基中央，28 ℃恒溫培養。7 d 后挑取菌落邊緣菌絲轉接于PDA 培養基中繼續培養，重復3 次。純化后的菌絲塊（Φ5 mm）放在裝有無菌水的10 mL 離心管中，置于-4 ℃冷凍保存。

1.3 病原菌的致病性測定

采用菌絲塊針刺接種法，進行離體和活體兩種接種方式[13]，用75%酒精和無菌水消毒健康葉片，在每片葉片上接種1 處（每處穿刺5 個小孔）。在菌落邊緣切取菌絲塊（Φ5 mm），菌絲面貼合接種處，覆蓋濕棉球保濕。離體接種葉片置于培養皿內潤濕的濾紙上，用濕棉球包裹葉片基部保濕。活體接種每盆植株用透明塑料袋隔絕污染，置于28 ℃恒溫培養箱保濕培養，按日常方法管理。用無菌PDA 培養基塊（Φ5 mm）做空白對照，每個處理3 次重復。接種后，觀察記錄葉片發病情況。

1.4 病原菌的形態學觀察

觀察菌株在PDA 培養基培養7 d 的菌落，測量菌落直徑，觀察記錄菌落形態特征。觀察顯微形態使用插片法誘導產孢，將有分生孢子的蓋玻片制成臨時裝片，在Nikon 相差倒置顯微鏡（Eclipse Ts2，成貫儀器（上海）有限公司）下觀察其孢子大小、形狀、產孢細胞形狀和產孢方式，并對其形態進行顯微拍照。

1.5 病原菌的分子鑒定

將純化的菌株接種至新PDA 培養基中，待菌絲長滿培養基，刮取適量菌絲體，采用液氮研磨樣本。使用真菌基因組DNA 抽取試劑盒（天根生化科技有限公司，北京）提取純化菌株的DNA，-20 ℃保存。1%瓊脂糖檢測合格后進行ITS-PCR 擴增，引物選用ITS1/ ITS4（TCCGTAGGTGAACCTGCGG/ TCCTCCGCT TATTGATATGC）（引物由上海派森諾生物科技有限公司合成）。PCR 反應體系為10 μL 2×Taq PCR Master Mix 溶液、12 μL ddH2O、2 μL DNA、1 μL 上游引物和1 μL 下游引物。PCR 擴增程序為94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個循環；72 ℃總延伸7 min，16 ℃保存。對PCR 產物進行電泳檢測，后回收PCR 產物進行DNA 測序（由上海派森諾生物科技有限公司完成）。測序結果提交到國家生物技術信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI），后用NCBI Blast 程序將拼接后的序列與NCBI 核酸數據庫中的數據進行比對，從中下載8 株序列相似性高的菌株序列，并以Erysiphales sp.作為外源序列，運用MEGA11 軟件，根據鄰位歸并（Neighbor-Joining，NJ）法，并用Bootstrap 1000 次進行檢驗，構建系統發育樹。

2 結果與分析

1.1 艷錦竹芋病害癥狀

葉片內部有不規則小病斑，病健交界明顯，內部發白，邊緣為黃褐色，病斑邊緣具明顯的褐色線紋。葉片正反面均大量散生大小不等的黑褐色近圓錐形粒狀凸起，以葉面為主，牢牢附著在葉片上，中心為淺褐色。新生葉片無病斑，葉面上散生大量小粒狀凸起（圖1）。

圖1 艷錦竹芋葉斑病癥狀Fig.1 Symptoms of leaf spot disease of Stromanthe sanguinea ‘Triostar’

1.2 病原菌的致病性測定

將分離純化后的菌株進行致病性測定，其中菌株YJ-2 發病情況與病葉樣品內部小病斑相符，活體葉片發病較明顯，初期在打孔點邊緣小范圍開始發病，形成干枯發黃的病斑；后期病斑蔓延融合，形成邊緣明顯、內部發白的塊斑（圖2）。離體接種和活體接種均未出現黑褐色凸起小顆粒。

圖2 菌株YJ-2 的致病性測定Fig.2 Pathogenicity determination of strain YJ-2

1.3 病原菌的形態學觀察

菌株YJ-2 在PDA 培養基上28 ℃培養5 d 后，菌落直徑約75 mm，菌落輻射狀生長，出現深淺相間的輪紋，邊緣呈花瓣狀；中心處菌絲為白色致密的絨絮狀，邊緣氣生菌絲平鋪（圖3-a）；15 d 后，菌落出現黑色點狀的分生孢子器，排列在同心圓的邊緣，外緣出現黃色小點（圖3-c）；菌落背面顏色漸深呈灰褐色的不規則同心環（圖3-d）。菌絲呈直角狀分枝（圖3-e）；分生孢子梗細長分枝，少數不分枝或簇狀，生出內壁芽生瓶梗型產孢細胞（圖3-f）；α 型分生孢子卵圓形至長橢圓形單孢，孢子兩端多有兩個大油球，少數為1或3 個（圖3-g）；β 型分生孢子線型，多為筆直，有的稍彎曲或彎曲呈鉤狀，單孢，內無油球，無隔膜（圖3-h）。根據形態學觀察，初步鑒定為擬莖點霉屬菌（Phomopsis sp.）。

圖3 菌株YJ-2 的形態學觀察Fig.3 Morphological observation of strain YJ-2

1.4 病原菌的分子鑒定

拼接測序結果得出，菌株YJ-2 序列長度為530 bp（圖4）。拼接后序列與NCBI 核酸數據庫中的數據進行BLAST 比對，結果顯示菌株YJ-2（登錄號ON899814）和NCBI 數據庫中擬莖點霉屬菌Phomopsis sp.（登錄號DQ780431.1）的相似性達99.43%。系統發育樹結果顯示，菌株YJ-2 與Phomopsis sp.聚為一支，置信值為97%（圖5），親緣關系比較近，結合形態學觀察，將菌株YJ-2 鑒定為擬莖點霉屬菌（Phomopsis sp.）。

圖4 菌株YJ-2 部分測序峰圖（320bp-390bp）Fig.4 Partial sequencing of strain YJ-2 (320bp-390bp)

圖5 基于ITS 序列構建的菌株YJ-2 與相關菌株的系統發育樹Fig.5 Phylogenetic tree of strain YJ-2 and related strains based on ITS sequences

3 討論與結論

以武夷學院園藝大棚內患葉斑病艷錦竹芋的病葉為試驗材料，通過對病原菌的分離純化，將得到的菌株進行致病性測定，并對其形態學觀察、分子鑒定，并結合系統發育樹的分析，確定菌株YJ-2 為擬莖點霉屬菌，是該病株艷錦竹芋葉斑病的致病菌。

擬莖點霉屬是半知菌類、腔孢綱、球殼孢目，有性態為間座殼屬（Diaporthe）[14]，該屬寄主范圍廣，為害多種植物，其中包含一些觀賞類植物，如竹芋科、棕櫚科、鳳梨科等[15-17]。擬莖點霉屬的種級分類至今沒有明確提出，如今還是主要依據寄主來劃分，寄生在同屬植物上且形態一致的菌可以劃分為一個種；寄生在不同屬植物上形態相似的卻被劃分為另一個種[18]。2008 年曾莉等曾研究發現擬莖點霉（Phomopsis marantaceae）可引起竹芋擬莖點霉葉斑病，危害多種竹芋，但未發現危害艷錦竹芋，試驗病株的病癥與其描述的一致[8]。

僅對艷錦竹芋葉斑病的一種致病菌進行分離和初步鑒定，今后應深入開展發病規律、孢子萌發條件、致病機理、病原菌與宿主之間關系等研究，并對鑒定的致病菌進行生防制劑的篩選，掌握更多的病害發生信息，為今后竹芋科觀葉植物的病害防治提供一定的參考和理論依據。