基于感官組學解析熱加工鷹爪蝦關鍵滋味成分的變化

賈倩男，侯 虎，王 聰，孫 艷，樊 燕

（1.中國海洋大學食品科學與工程學院，山東 青島 266000；2.中國海洋大學海洋生命學院，山東 青島 266000）

鷹爪蝦（Trachypenaeus curvirostris）隸屬節肢動物門、甲殼綱、十足目、對蝦科，是一種重要經濟蝦類[1]，其出肉率高，味道鮮美，深受消費者青睞。熱加工是影響產品風味的重要因素，為提高產品品質，對關鍵滋味成分的研究必不可少。李婉君[2]對南極磷蝦與南美白對蝦滋味成分進行比較，確定其滋味特征與呈味模式。王芝妍等[3]通過分析中華管鞭蝦蝦肉揮發性氣味成分，確定超高壓處理前后蝦肉風味物質的變化。國內外對南美白對蝦、南極磷蝦的滋味成分已做深入系統的研究，但對鷹爪蝦的報道較少。蝦中重要的滋味成分有游離氨基酸、核苷酸及其衍生物、無機鹽和季胺堿等，這些物質往往相互協同作用賦予蝦鮮甜的味道[4]，但哪種滋味物質對風味的形成具有決定作用尚未清晰。

分子感官科學可以從分子水平對滋味定性、定量和描述，構建食品的滋味重組模型，從而確定食品中滋味活性成分[5]，現己廣泛應用于食品的滋味分析。重組實驗是分子感官科學應用中最重要的實驗方法[6]。通過滋味重組模型和消除實驗，可探究化合物與味覺特征形成的關系，確定樣品的關鍵滋味成分。向晨曦等[7]通過消除、添加和重組實驗探究蒸制鱘魚肉的關鍵味覺化合物，確定了鱘魚肉的特征性滋味活性物質。電子舌作為一種人工智能仿生物味覺模式建立的新型檢測系統，具有測量方法簡單、靈敏度高、重復性和及時性好等優勢[8]，現已廣泛應用于食品品質分級、感官評定、食品溯源、食品生產過程中的質量監控等方面。

本研究以鷹爪蝦為材料，通過滋味活度值（taste activity value，TAV）考察各化合物的呈味強度，探究鷹爪蝦在熱處理前后游離氨基酸、無機離子、季胺化合物、還原糖、有機酸和核苷酸含量的變化；采用重組、消除和添加實驗，結合感官評價和電子舌評價各滋味物質，探討其整體滋味輪廓及呈味特性，確定關鍵呈味物質及呈味貢獻，旨在為鷹爪蝦類產品的開發提供理論依據，也為提高加工貯藏中鷹爪蝦的品質提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮活鷹爪蝦購于山東青島南山水產品批發市場。

5’-鳥苷酸（5’-guanosine monophosphate，5’-GMP）、5’-肌苷酸（5’-inosine monophosphate，5’-IMP）、5’-三磷酸腺苷（5’-adenosine triphosphate，5’-ATP）、5’-二磷酸腺苷（5’-adenosine diphosphate，5’-ADP）、5’-腺苷酸（5’-adenosine monophosphate，5’-AMP）、肌苷（hypoxanthine riboside，HxR）、次黃嘌呤（hypoxanthine，Hx）、酒石酸、蘋果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、琥珀酸、谷胱甘肽、葡萄糖和海藻糖標準品 北京索萊寶科技有限公司；甜菜堿、膽堿標準品（色譜純）和辛烷磺酸鈉 上海源葉生物科技有限公司；乙醇、甲醇、乙腈（色譜純）美國默克公司；食品級氨基酸（18 種）寧波一諾生物科技有限公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

L-8900型全自動氨基酸分析儀 日本Hitachi公司；6410型三重四極桿串聯質譜儀 美國Agilent公司；AA-6800型原子吸收分光光度計 日本Shimadzu公司；TS-5000Z味覺分析系統 日本Insent公司。

1.3 方法

1.3.1 鷹爪蝦的熱處理

將新鮮鷹爪蝦去頭、殼，取蝦肉，然后將其放入蒸煮袋中，沸水煮制5 min。鷹爪蝦生鮮和熱處理樣品分別標記為TR和TC。

1.3.2 水溶性滋味物質的提取

稱取準確質量的蝦肉，以1∶2（g/mL）加入體積分數20%甲醇溶液，均質3 min后離心（10000×g、4 ℃、20 min）。重復上述操作3 次，合并上清液。經旋蒸除去甲醇后的樣品凍干保存。

1.3.3 感官評價

采用定量描述性分析（quantitative descriptive analysis，QDA）方法[9]進行感官評價，包括鮮味、咸味、甜味、酸味、苦味、濃厚味和異味。感官評定小組包括11 位評定員（6 男5 女），年齡均在21～30 歲之間。感官評價前預先對小組成員進行基本滋味培訓，熟悉蝦水提取液的特性和感官強度，以及與標準感官溶液的對應強度。評分標準為1～5 分。每個樣品重復3 次，結果取平均值。

1.3.4 呈味物質的測定

1.3.41 游離氨基酸的測定

參考Chen Wen等[10]的方法并作適當調整，采用全自動氨基酸分析儀測定。

1.3.42 無機離子的測定

Na＋、K＋含量的測定采用原子吸收光譜法，參照GB 5009.91—2017《食品中硒的測定》；PO43-含量的測定采用鉬藍比色法，參照GB 5009.87—2016《食品中磷的測定》；Cl-含量的測定采用硝酸銀滴定法，參照GB/T 5009.44—2016《食品中氯化物的測定》。

1.3.43 季胺化合物的測定

采用高效液相色譜-質譜聯用法測定季胺化合物的含量[11]。色譜條件：色譜柱ZORBAX SB-Phenyl（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫30 ℃；流速0.8 mL/min；流動相A為10 mmol/L甲酸銨溶液，流動相B為5 mmol/L甲酸銨-0.1%甲酸-25%甲醇；進樣體積5 μL；洗脫梯度程序：0～0.5 min，100% A、0% B；0.5～3.5 min，100%～0% A、0%～100% B；3.5～11.5 min，0% A、100% B；11.5～14.5 min，0%～100% A、100%～0% B。質譜條件：電噴霧電離源，正離子模式，多反應監測模式，干燥氣溫度350 ℃，干燥氣流速10 L/min，霧化氣壓力50 psi，毛細管電壓3500 V，碎裂電壓100 V，碰撞能量20 eV。定量離子質荷比（m/z）：甜菜堿（118.1→57.7）、膽堿[12]（104.2→60.2）、氧化三甲胺（76→58）。

1.3.44 還原糖的測定

參照張進杰等[13]的方法并作部分修改。色譜條件：色譜柱Cosmosil Sugar-D（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相為乙腈-水（75∶25，V/V）；流速1 mL/min；柱溫35 ℃；示差折光檢測器檢測，溫度35 ℃；進樣量20 μL。

1.3.45 有機酸的測定

參照G B/T 5009.157—2003《食品中有機酸的測定》。色譜條件：色譜柱Hypersil ODS-2 C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相為0.01 mol/L(NH4)2HPO4溶液，用1 mol/L磷酸溶液調pH值至2.75；流速0.8 mL/min；柱溫25 ℃；檢測波長210 nm；進樣量20 μL。

1.3.46 核苷酸及其關聯化合物的測定

參照李婉君[2]的方法，并作部分修改。色譜條件：色譜柱Hypersil ODS-2 C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相為0.05 mol/L K2HPO4-KH2PO4（1∶1，V/V）溶液，用1 mol/L磷酸溶液調pH值至6.5；流速0.9 mL/min；柱溫25 ℃；紫外檢測波長254 nm；進樣量20 μL。

1.3.47 谷胱甘肽的測定

參照王愛月等[14]的方法，并作部分修改。色譜條件：色譜柱Zorbax SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相為0.05 mol/L KH2PO4（pH 3，含0.1%辛烷磺酸鈉）-乙腈（92∶8，V/V）；柱溫為室溫；流速1.0 mL/min；檢測波長210 nm；進樣量20 μL。

1.3.5 TAV測定

TAV按下式計算。

式中：C為滋味物質含量/（mg/100 g）；T為滋味物質的滋味閾值/（mg/100 g）。

1.3.6 重組實驗

根據基本滋味物質定量分析的結果，按其“自然”濃度溶解于超純水中，即為基本滋味重組體，調節pH值使其與天然提取液相同，并通過感官評價比較天然蝦水提取液與其基本滋味重組體呈味差異[15]。

1.3.7 消除與添加實驗

利用基本滋味重組體進行消除與添加實驗[16]。首先進行消除實驗，即將基本滋味重組體減除某一種物質或者某一類成分后進行感官評價，通過評價每一種或每一類化合物去除后對整體滋味的影響，排除非關鍵滋味物質。消除實驗的結果可以初步判斷出主要滋味物質，設定為x種物質，這些主要滋味物質的混合物稱為主成分提取物。再進行添加實驗，即添加單個物質或混合物到重組的主成分提取物中再進行感官評價，又得到y種滋味活性物質。通過消除與添加實驗，共可以得到（x＋y）種關鍵滋味物質。

1.3.8 電子舌分析

用超純水配制50 mg/mL樣品溶液，并配制等質量濃度的滋味重組體，參比溶液為30 mmol/L KCl＋0.3 mmol/L酒石酸。樣品采集時間120 s，清洗180 s。每個樣品3 個平行，每個平行重復測7 次。

1.4 數據處理與分析

2 結果與分析

2.1 鷹爪蝦滋味感官評定結果

在鮮味、咸味、甜味和濃厚味方面，熱處理樣品TC滋味強度均大于生鮮樣品TR，表明熱處理對滋味具有顯著影響，這與Bai Jing等[17]對南美白對蝦加熱過程中品質變化的研究結果一致。這可能是加熱促使蝦肉中蛋白質以及多肽水解斷裂產生一些呈味物質。鷹爪蝦滋味以鮮味和濃厚味為主。

2.2 鷹爪蝦滋味組分定量分析結果

2.2.1 游離氨基酸含量變化及其對滋味的影響

游離氨基酸對水產品的滋味具有重要貢獻[21]。根據種類和濃度的不同，游離氨基酸可以賦予食品甜味、酸味或苦味[22]，其與核苷酸類物質產生風味協同作用，顯著提升水產品滋味品質。由表1可知，TC、TR樣品中均檢測出18 種游離氨基酸，總量分別為1165.94 mg/100 g和1396.64 mg/100 g，Gly、Arg、Tau、Pro和Ala的含量較高，熱處理后這5 種氨基酸含量占總游離氨基酸的74.88%。熱處理前后Gly含量均最高，分別為264.57 mg/100 g和346.79 mg/100 g，TAV均大于1，是甘甜味的主要貢獻者，這一結果與Jin Yinzhe等[23]測得的南美白對蝦中游離氨基酸的結果一致；Arg是一種苦味氨基酸，帶有微弱甜味，有增加呈味復雜性和提高鮮度的作用[24]，其在高含量下可與帶有甜味的Ala協同作用賦予蝦肉特有的適宜滋味；Tau是一種微酸性的氨基酸，盡管它對滋味的貢獻尚報道較少，但研究已證明其在調節正常生理功能中具有重要作用[25]；Pro也是甜味氨基酸，不僅可以提供甜味，還可以減少蝦肉中的不愉快滋味[26]。盡管Glu含量較低，其熱處理前后TAV均大于1，因此對鷹爪蝦的鮮味具有重要貢獻，發揮改善總體風味的作用；熱處理后，游離氨基酸總量增長到1396.64 mg/100 g，增加了19.79%，說明熱處理對游離氨基酸含量有顯著影響。熱處理前后，鮮味氨基酸的含量無顯著變化，甜味氨基酸的含量增多，除Arg外，苦味氨基酸的含量均降低。原因可能是，一方面，加熱使蝦肉中的蛋白質以及多肽水解斷裂產生了Gly和Ser等具有甜味的氨基酸[27]；另一方面，游離氨基酸會發生脫氨、脫羧等反應而轉化為烴、醛、胺等[28]，從而使其含量降低。Luan Yang等[29]研究發現煮熟的河豚肉比生河豚肉具有更強的鮮味和甜味，這是由于鮮味氨基酸Glu、Asp和甜味氨基酸Gly、Ala的含量增加（P＜0.05)。邱霞琴等[30]研究發現加熱后草魚中游離氨基酸總量減少，但一些鮮味氨基酸如Asp和Glu的含量增加。池岸英[31]研究表明，微波與水煮凡納濱對蝦中的游離氨基酸總量均低于鮮蝦，與本實驗研究結果相反，這種差異可能與處理樣品個體差異或處理條件有關。

表1 鷹爪蝦中游離氨基酸的含量、呈味特征、滋味閾值及TAVTable 1 Contents,taste attributes,taste thresholds and TAVs of freeamino acids in T. curvirostris

2.2.2 無機鹽離子、季胺化合物、還原糖、有機酸、核苷酸含量變化及其對滋味的影響

Na＋、K＋、Cl-和是評價水產品滋味的重要指標[32]，Na＋和K＋一般產生咸味，Cl-和PO34-本身無味，往往起到修飾風味的作用。由表2可知，鷹爪蝦中Na＋含量最高（39.12～49.15 mg/100 g），其次是Cl-（38.11～44.13 mg/100 g），TAV均大于1，表明無機離子對熱誘導蝦樣品的滋味具有重要貢獻。Wen Xinyi等[33]的研究發現K＋、Na＋和是調控煮制文蛤風味的重要因素。

表2 鷹爪蝦中無機離子、季胺化合物、還原糖、有機酸、核苷酸的含量、滋味閾值及TAVTable 2 Contents,taste thresholds and TAVs of inorganic salts,quaternary amine compounds,reducing sugars,organic acids and nucleotides in T. curvirostris

甜菜堿、氧化三甲胺和膽堿是存在于水產品中的重要季胺化合物。氧化三甲胺是一種呈味物質，可賦予水產品獨特的鮮味。甜菜堿具有甜味和一定的鮮味，能增強濃厚味[34]。由表2可知，TC樣品的甜菜堿和氧化三甲胺含量均高于TR樣品，膽堿含量無顯著變化，這可能是熱處理后鷹爪蝦濃厚味強的一個重要因素。同時，三者的TAV均小于1，表明甜菜堿、氧化三甲胺和膽堿對鷹爪蝦的濃厚味具有不同程度的輔助作用。鷹爪蝦中僅檢出較低含量的葡萄糖（3.50～10.52 mg/100 g），感官評價中鷹爪蝦甜味較弱，可能與此結果密切相關。姚靜玉等[18]在小龍蝦中也檢測到較低含量的葡萄糖。

乳酸和琥珀酸是水產品重要的呈味物質之一，琥珀酸與谷氨酸存在一定的協同增味效應[2]。由表2可知，鷹爪蝦中只檢測到乳酸、未檢測到琥珀酸，熱處理后乳酸含量由（205.63±3.53）mg/100 g降低為（127.47±8.03）mg/100 g，其TAV＞1表明乳酸是鷹爪蝦滋味的重要貢獻者。研究表明，乳酸在中華絨螯蟹的呈味中也具有重要作用[35]。

5’-IMP和5’-AMP賦予水產品強烈的鮮味[36]。由表2可知，TC樣品的核苷酸及其關聯化合物總量高于TR樣品，說明蝦在煮制后有更多滋味物質溶出。熱處理后5’-IMP的TAV（5.94）高于熱處理前（5.00），谷文靜[37]研究發現，經通電加熱的凡納濱對蝦其IMP和GMP含量較高，有助于保持蝦肉的鮮味且不會產生明顯的苦味。

2.3 天然提取液與滋味重組模型的呈味差異

由圖1可知，鷹爪蝦滋味重組模型與天然提取液有相似的滋味輪廓，滋味重組模型除酸味外，其他5 種滋味強度均低于天然提取液。劉天天等[34]構建沙蟹汁滋味重組物，發現重組物雖然可以再現沙蟹汁的滋味，但在溫和性、收斂性和后味方面，天然提取物優于滋味重組模型。

圖1 鷹爪蝦水提取液及其滋味重組模型的滋味輪廓Fig.1 Taste profiles of T. curvirostris water extract and its taste recombination model

2.4 滋味化合物的消除實驗

采用電子舌分析比較天然水提取液和相應滋味重組模型的呈味差異。由表3可知，TR樣品的甜味、鮮味和咸味強度值分別為5.56、13.45和9.98，TC樣品分別為8.05、13.83和10.39，強度較高，基本無酸味和苦味；滋味重組模型的甜味、鮮味和咸味強度值普遍低于天然水提取液，而苦味和酸味略高于原樣，與感官評價結果一致。滋味重組模型與天然水提取液存在一定差異，未能完整地再現原樣的呈味表現，這可能與滋味重組模型中缺乏某些關鍵呈味物質有關。類似研究表明，12 種關鍵滋味成分構成的滋味重組液不能完整再現河鲀的滋味輪廓[38]。

表3 鷹爪蝦水提取液及其滋味重組模型的滋味強度值Table 3 Taste intensity values of T. curvirostris water extract and its taste recombination model

首先對鷹爪蝦重組模型進行第1次消除實驗，將重組模型中的滋味物質分成11 個大組，具體分組情況如表4所示。當消除C、H、I和K組時，滋味變化不顯著，但當缺失另外7 組呈味組分時能感覺到顯著的滋味差異。消除A組、B組、D組和E組時，正確區分度高，甜味和鮮味顯著降低，Manninen等[39]的研究也表明游離氨基酸和呈味核苷酸可協同增強食物的鮮味；消除F組和G組時，TR樣品的正確區分度分別為19和16，TC樣品的正確區分度均為18，顯著影響了咸味、鮮味、甜味和濃厚味，苦味增加；消除J組時，甜味和濃厚味降低。因此，鷹爪蝦第1次消除實驗排除C、H、I和K組。將第1次消除時滋味產生顯著變化的混合組細分為包含單一或多個成分的子組，進行第2次消除實驗，進一步揭示每種組分對滋味的貢獻程度。

表4 鷹爪蝦滋味化合物第1次消除實驗Table 4 First omission tests of taste compounds in T. curvirostris

將A組、F組、G組和J組中每一種物質單獨進行消除實驗。B組細分為B1（Orn、Met）和B2（Leu、Tyr、Arg）兩個子群，E組細分為E1（5’-GMP）、E2（5’-AMP）和E3（5’-ATP、Hx、HxR）三個子群。由表5可知，Glu、Gly和Ala的消除均導致甜味顯著減弱。據報道，Glu是具有鮮味活性的化合物，Gly的TAV大于1，是甘甜味的主要貢獻者，Ala是甜味氨基酸，顯著影響鷹爪蝦的滋味。Pro和B1組的消除導致甜味稍減弱，B2組的消除對整體滋味無顯著影響，消除EI組后，甜味和鮮味均降低，E2和E3組的消除滋味無顯著變化。Na＋和Cl-的消除導致甜味、咸味、鮮味和濃厚味降低，苦味升高，消除K＋和正確區分度均小于3，對滋味無顯著影響，研究表明，Na＋、K＋、Cl-和也是河鲀魚的關鍵滋味組分[20]。甜菜堿具有甜味調節作用[40]，消除甜菜堿和氧化三甲胺，甜味和濃厚味降低。因此，結合兩次消除實驗，初步確定鷹爪蝦中關鍵呈味活性物質為Glu、Gly、Ala、5’-IMP、5’-GMP、Na＋、Cl-、甜菜堿和氧化三甲胺。

表5 鷹爪蝦滋味化合物第2次消除實驗Table 5 Second omission tests of taste compounds in T. curvirostris

2.5 滋味化合物的添加實驗

準備若干份由消除實驗確定的呈味活性物質，按其“自然的”濃度配制混合物，將消除實驗判定為非呈味活性的物質逐一添加到重組液中，進行感官評價。一些化合物本身對滋味無顯著影響，但組分間的相互作用可能會對滋味產生未知的影響。由表6可知，加入Tyr和Arg后區分度均大于10，滋味發生顯著變化，造成重組液甜味和鮮味增強，苦味減弱。因此Tyr和Arg在鷹爪蝦中也具有呈味活性。Kani等[16]在添加實驗中判斷Glu和甘氨酸甜菜堿也具有味覺活性，是魷魚關鍵的滋味成分。

表6 鷹爪蝦滋味化合物添加實驗Table 6 Addition tests of flavor compounds in T. curvirostris

多重消除與添加實驗的結果表明，鷹爪蝦呈味活性物質為Glu、Gly、Ala、Tyr、Arg、5’-IMP、5’-GMP、Na＋、Cl-、甜菜堿和氧化三甲胺。對比TAV的結果，乳酸的TAV大于1，但缺少乳酸時對滋味無顯著影響；Tyr和Arg在樣品中的TAV均小于1，但通過添加實驗證明這兩種化合物也是蝦的滋味活性物質。由于影響食品滋味的機制和因素十分復雜，各成分間協同作用對食品滋味貢獻等方面的研究有待于進一步拓展和深入。

3 結論

本研究在熱處理前后的鷹爪蝦中均檢測到18 種游離氨基酸，高含量氨基酸主要有Gly、Arg、Tau、Pro和Ala；含量最高的核苷酸為IMP，其次是Hx和HxR；有機酸只檢出乳酸；無機離子以Na＋和Cl-為主；還檢測出較高含量的甜菜堿和較低含量的葡萄糖。其中，Glu、Gly、Na＋、Cl-、乳酸與5’-IMP的TAV大于1，是蝦肉滋味的主要貢獻者。通過構建滋味重組模型，確定鷹爪蝦的關鍵滋味活性化合物為Glu、Gly、Ala、Tyr、Arg、5’-IMP、5’-GMP、Na＋、Cl-、甜菜堿和氧化三甲胺，從而為鷹爪蝦類產品的開發提供理論依據。