肉源大腸桿菌與假單胞菌混合生物被膜形成分析

季君珂，宓曉雨，袁楊洋，程 宇，張文棟，張 晨，江 蕓

（南京師范大學食品與制藥工程學院，江蘇 南京 210023）

生物被膜是一種微生物在不利環境條件下的生存機制和適應形式[1]。在食品加工環境中，腐敗菌和致病菌都可能污染食物，并常以多菌種生物被膜的形式存在[2]。微生物、接觸表面、存活環境三者之間發生各種相互作用，對生物被膜的結構與活性產生復雜影響[3-4]。

大腸桿菌（Escherichia coli）是評價食品污染常用指示菌之一，食品中大腸菌群含量表示食品被糞便污染的程度，一些血清型菌株攜帶毒力基因而具致病性[5-6]。在生豬屠宰、胴體分割、貯運銷售過程中極易導致肉類食品污染大腸桿菌。假單胞菌（Pseudomonas）是肉品貯藏末期典型的優勢腐敗菌，具有很強的分解蛋白質產生腐敗產物的能力[7]。研究表明，大腸桿菌和假單胞菌均可在肉品生產加工接觸表面以及肉品表面形成生物被膜，且假單胞菌已成為近年來生鮮肉研究中生物被膜的模型細菌[8]。生物被膜附著在接觸表面，使菌株細胞對外界不良環境的抵抗力增強，不易清除，成為細菌交叉污染源頭和傳播中心，對食品安全構成重大威脅。據報道，生物被膜中的細菌與浮游細菌相比，抗性增加10～1000 倍[9]。生物被膜還會增加人類患食源性疾病的風險，據估計80%的細菌性感染與生物被膜有關[10-11]。而多菌種混合被膜在食品生產環境中的存在更為廣泛，且近年研究發現混合生物被膜比單種生物被膜對抑菌劑、抗生素等表現出更強的抗性[12-14]，這將對肉品造成反復持久的交叉污染[14-16]，進一步加大安全風險。此外，大量研究表明生物被膜的形成具有顯著的菌株差異，研究肉源分離株混合生物被膜的形成對于肉品生產過程中微生物的污染控制更具實際指導意義[17-19]。

本實驗結合生產加工實際情況，以肉源大腸桿菌和肉源假單胞菌為研究對象，首先分析兩種菌不同菌株生物被膜形成能力；然后采用不銹鋼片計數法探討兩種菌不同菌株混合被膜形成過程中被膜量動態變化，進而研究兩種菌混合成膜時胞外聚合物（extracellular polymeric substances，EPS）組成和微觀結構的變化；采用實時聚合酶鏈式反應（real-time polymerase chain reaction，realtime PCR）絕對定量方法分析生物被膜和浮游菌中相關成膜基因表達差異及接觸表面基因表達絕對量的變化；旨在為揭示肉源腐敗微生物混合被膜形成規律提供科學基礎，以及為肉類生產加工中微生物風險評估及污染控制提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗用大腸桿菌共31 株，為本實驗室前期從某生豬屠宰車間（傳送帶表面、操作臺表面，以及車間刀具、手套表面）及豬酮體表面中分離所得[20]。假單胞菌共13 株，為本實驗室前期從腐敗豬肉中分離所得[21]。

食品級304不銹鋼片（75 mm×25 mm×1 mm，2B光潔面）南通順豐醫療器械有限公司；96 孔透明細胞培養板 美國Corning公司。

胰蛋白胨大豆瓊脂（tryptone soya agar，TSA）、胰蛋白胨大豆肉湯（tryptic soy broth，TSB）、酵母提取物（yeast extract，YE）、假單胞菌CFC選擇性培養基基礎、CFC基礎添加劑 北京陸橋技術有限公司；結晶紫、乙醇、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）、丙酮（均為分析純）南京藤春生物科技有限公司；苯酚（分析純）南京峰昌生物科技有限公司；濃硫酸（分析純）南京化學試劑有限公司；BCA蛋白濃度檢測試劑盒 南京建成生物科技有限公司；總RNA提取試劑盒（D9108A）、PrimeSTAR?Max DNA聚合酶、Prime Script? RT Master Mix反轉錄試劑盒、TB Green Premix ExTaq(Tli RNaseH Plus)熒光定量試劑盒日本Takara公司；DNA Marker（DL 2000）、Gel Red核酸染料 生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 儀器與設備

M2多功能酶標儀、Thermal Cycler普通PCR儀美國Molecular Devices公司；2-16KL高速冷凍離心機美國Sigma公司；Nano-30微量紫外分光光度計 杭州奧盛儀器有限公司；SW-CJ-2F超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術有限公司；HVE-50立式壓力蒸汽滅菌鍋 日本Hirayama公司；HX-4拍打式無菌均質器 上海瀘析實業有限公司；QL-200微型渦旋混合儀 海門其林貝爾儀器有限公司；ZQTY-70臺式振蕩培養箱 上海知楚儀器有限公司；DHP-9052電熱恒溫培養箱 上海一恒科技有限公司；LSM 710共聚焦激光掃描顯微鏡（confocal laser scanning microscope，CLSM）德國Carl Zeiss公司。

1.3 方法

1.3.1 菌液制備

將凍存的大腸桿菌和假單胞菌分別在TSA-YE平板上劃線活化兩次，分別在37 ℃培養24 h和28 ℃培養48 h。挑取兩菌單菌落分別接種于3 mL和6 mL TSB中，分別于37 ℃、220 r/min振蕩培養18 h和28 ℃、220 r/min振蕩培養24 h，連續活化2 次，使菌數達到穩定期。取1 mL培養好的菌液離心（8000×g、5 min、4 ℃），棄上清液，用PBS（pH 7.2）洗滌3 次，調整菌懸液濃度為108CFU/mL備用。

1.3.2 大腸桿菌和假單胞菌生物被膜形成能力測定

將1.3.1節菌懸液用新鮮TSB梯度稀釋至濃度為102CFU/mL，吸取180 μL至96 孔細胞培養板中，以無菌TSB為對照，封口膜封口，25 ℃培養72 h。培養結束后，棄去培養液，無菌蒸餾水漂洗3 次，室溫干燥30 min。吸取0.25 g/100 mL結晶紫200 μL于微孔中染色30 min，棄去染液，無菌蒸餾水漂洗3 次，使用200 μL體積分數95%乙醇溶液洗脫黏附菌體30 min，采用酶標儀測定570 nm波長處光密度（OD570nm）。每個菌株重復6 次。

將測得的各菌株平均OD值與臨界OD值（ODC=對照組OD值＋3 倍標準差[22]）進行比較，對被膜形成能力進行分類：無生物被膜形成能力：OD≤ODC；較弱生物被膜形成能力：ODC＜OD≤2×ODC；中等生物被膜形成能力：2×ODC＜OD≤4×ODC；較強生物被膜形成能力：4×ODC＜OD。

1.3.3 大腸桿菌與假單胞菌混合被膜形成動態曲線分析

根據1.3.2節結果，選取被膜形成能力不同的菌株進行大腸桿菌和假單胞菌混合被膜形成動態過程研究。

1.3.31 大腸桿菌與假單胞菌混合被膜制備

選用食品級304不銹鋼片（75 mm×25 mm×1 mm，2B光潔面）作為生物被膜形成的接觸載體。將1.3.1節制備的大腸桿菌和假單胞菌懸液單獨或共同接種至含新鮮TSB和不銹鋼片（一半浸入）的無菌玻璃盒中，分別為單菌生物被膜組和混合生物被膜組，其中兩種細菌濃度均為106CFU/mL。無菌保鮮膜封口，25 ℃靜置培養12、24、36、72、120 h和168 h。實驗重復3 次。

1.3.32 大腸桿菌與假單胞菌生物被膜的收集與計數

培養結束后取出不銹鋼片并用無菌生理鹽水漂洗3 次以去除表面未黏附菌體，置于均質袋中充分拍打均質（8 次/s、1 min），正反面各拍打1 次[23]。梯度稀釋后選擇合適稀釋度進行涂布，其中大腸桿菌單菌被膜組采用TSA-利福平平板，假單胞菌單菌被膜組采用CFC假單胞菌選擇性平板，混合被膜組采用上述兩種選擇性平板同時進行涂布。涂布結束后大腸桿菌于37 ℃培養24 h，假單胞菌于28 ℃培養48 h后計數。

1.3.4 生物被膜CLSM分析

將編碼含有紅色熒光蛋白基因的質粒pUC-mcherrystr（3830 bp）[24]和含有編碼綠色熒光蛋白基因的質粒sfgfp-MCS（5855 bp）[25]分別轉化到大腸桿菌和假單胞菌中。綠色熒光菌和紅色熒光菌的檢測波長分別為490～550 nm和560～700 nm。采用1.3.3.1節方法制備含有熒光蛋白菌株的單菌被膜和混合被膜，25 ℃靜置培養24、72 h和168 h。培養結束后取出不銹鋼片并用無菌生理鹽水漂洗3 次。采用CLSM觀察單菌和混合生物被膜在鋼片表面的分布情況。

1.3.5 大腸桿菌與假單胞菌混合被膜形成時EPS含量分析

按1.3.3.1節制備大腸桿菌與假單胞菌單菌被膜和混合被膜，培養72、168 h取出不銹鋼片并用無菌生理鹽水漂洗3 次。采用棉簽擦拭法收集不銹鋼片表面生物被膜，擦拭后棉球置于離心管中充分渦旋3 min，得到的菌懸液用于EPS含量測定。實驗重復3 次。

參考Cao Bin等[26]的方法制備菌懸液中松散型EPS（loose EPS，L-EPS）和緊密型EPS（bound EPS，B-EPS）。按照BCA試劑盒說明書操作測定L-EPS和B-EPS中的蛋白質含量，以牛血清蛋白為標準品，標準曲線方程為y=0.0018x＋0.1514（R2=0.9978），其中x為蛋白質量濃度/（μg/mL），y為吸光度；根據標準曲線方程分別計算L-EPS和B-EPS中蛋白含量，進而計算出總EPS（total EPS，T-EPS）中的蛋白含量。總糖含量采用苯酚-硫酸法[27]測定，以葡萄糖為標準品，標準曲線方程為y=0.1956x＋0.0818（R2=0.9973），其中x為葡萄糖質量濃度/（μg/mL），y為吸光度，根據標準曲線方程計算L-EPS和B-EPS中多糖含量，進而計算出T-EPS中多糖含量。

1.3.6 生物被膜和浮游菌中相關成膜基因的表達水平測定

采用real-time PCR絕對定量方法測定單菌被膜與混合被膜、單菌培養液與混菌培養液中浮游菌的相關成膜基因表達量變化，分別基于單位面積和單位菌數進行基因表達量分析。

1.3.6.1 生物被膜和浮游菌的收集及培養計數

以食品級304不銹鋼片為接觸載體，25 ℃靜置培養72 h和168 h后收集生物被膜，方法同1.3.3.1節。將均質液離心（12000×g、15 min、4 ℃），沉淀用于核酸提取。同時對不銹鋼片上的生物被膜進行選擇性平板計數，方法同1.3.3.2節，菌數結果用于生物被膜基于單位菌數基因表達量的計算。

取出鋼片后，充分渦旋剩余培養液，吸取2 mL培養液于離心管中，無菌生理鹽水離心洗滌3 次并等量重懸（8000×g、5 min、4 ℃），取菌體沉淀用于核酸提取。同時對培養液中的浮游菌進行選擇性平板計數，選擇性培養基和培養方法同1.3.3.2節，菌數結果用于培養液中浮游菌基于單位菌數基因表達量的計算。

1.3.62 總RNA提取及cDNA合成

按照總RNA提取試劑盒說明書進行，用核酸蛋白微量測定儀測定提取的總RNA濃度和純度，確定提取的RNA濃度、純度合格（OD260nm/OD280nm為1.8～2.0），調整RNA濃度后，根據反轉錄試劑盒進行反轉錄。反轉錄體系（10 μL）：2 μL 5×Prime Script RT Master Mix混合液、2 μL RNA、6 μL去RNA酶水。反應程序為：37 ℃、15 min，85 ℃反轉錄酶失活反應5 s，4 ℃，∞。將反轉錄得到的cDNA于-20 ℃保存進行后續實驗。

1.3.63 成膜基因特異性確定

查閱文獻共得到與大腸桿菌成膜相關的基因40 個[28-34]，與假單胞菌成膜相關的基因9 個[35-36]，采用real-time PCR驗證每個基因在兩種細菌內的擴增情況，并最終確定3 個僅與大腸桿菌成膜相關的基因（csgA、papC、fimH），2 個僅與假單胞菌成膜相關的基因（cbrA、phoR）。各基因引物序列如表1所示，引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。

表1 實驗所用引物序列Table 1 PCR primers used in this study

1.3.64 標準質粒構建及標準曲線建立

標準質粒由南京擎科公司構建合成。取測序結果正確的質粒作為標準檢測質粒，采用微量分光光度計測定純度和濃度，按下式計算質粒DNA拷貝數。

使用去RNA酶水梯度稀釋，使標準檢測質粒質量濃度為100～10-6ng/μL，作為模板。PCR體系（20 μL）：SYBR Green Master（2×）（ROX）10 μL，PCR正、反向引物（10 μmol/L）各0.25 μL，DNA模板2 μL，雙蒸水7.5 μL。反應條件：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，40 個循環；溶解程序：95 ℃、15 s，60 ℃、1 min，95 ℃停留15 s。以拷貝數對數值（lg（copies/μL））為橫坐標，循環閾（cycle threshold，Ct）值為縱坐標，得到標準曲線方程。

1.3.65 相關成膜基因real-time PCR分析

以1.3.6.2節制備的cDNA為模板進行real-time PCR，獲得相關基因的Ct值，根據標準曲線方程分別計算單菌生物被膜、混合生物被膜中基于單位面積的基因絕對表達量（copies/cm2），以探討混合生物被膜形成時接觸材料表面基因的絕對表達水平變化。進一步消除菌數差異，分別計算生物被膜、培養液浮游菌的基于單位菌數的基因絕對表達量（copies/CFU），以探討浮游菌形成生物被膜后菌體的基因表達差異。

1.4 數據處理與分析

利用GraphPad Prism 8軟件進行相應數據及圖表分析，采用SPSS v17.0（IBM公司）對數據進行單因素方差分析和Duncan多重比較檢驗，兩組之間顯著性差異分析采用t檢驗。結果以±s表示，P＜0.05，差異顯著。

2 結果與分析

2.1 大腸桿菌和假單胞菌生物被膜形成能力分析

采用微孔板結晶紫染色法評估25 ℃培養72 h時31 株肉源大腸桿菌的生物被膜形成能力。如圖1A所示，31 株肉源大腸桿菌中29 株（93.55%）菌株表現出生物被膜形成能力，但存在顯著的菌株差異性（P＜0.05）。進一步對生物被膜形成能力進行分類發現，強、中、弱、無4 種生物被膜表型的菌株數量分別為8、11、10、2 株，分別占菌株總數的25.81%、35.48%、32.26%、6.45%。如圖1B所示，13 株肉源假單胞菌于25 ℃培養72 h時，12 株（92.31%）菌株表現出生物被膜形成能力，亦存在顯著的菌株差異性（P＜0.05）。進一步對生物被膜形成能力進行分類，強、中、弱、無4 種生物被膜表型的菌株數量分別為3、6、3、1 株，分別占菌株總數的23.08%、46.15%、23.08%、7.69%。

圖1 大腸桿菌（A）和假單胞菌（B）微孔板表面生物被膜形成能力Fig.1 Biofilm-forming capacity of E. coli (A) and Pseudomonas (B) on polystyrene microplate surfaces

2.2 大腸桿菌和假單胞菌混合被膜形成曲線分析

根據2.1節結果，選取成膜能力強的大腸桿菌菌株D4-18和C-13與成膜能力強的假單胞菌菌株Y2-11和成膜能力弱的假單胞菌菌株Y2-210進行組合，探究大腸桿菌和假單胞菌不同菌株混合被膜的動態形成過程。

單菌生物被膜形成過程發現，兩株大腸桿菌D4-18和C-13成膜動態曲線不完全相同（圖2A），在36 h達到最大成膜量6.185（lg（CFU/cm2））和6.833（lg（CFU/cm2）），之后被膜量逐漸減少，而168 h時D4-18被膜量又增加；兩株假單胞菌成膜動態曲線差異明顯（圖2B），Y2-210波動明顯，生物膜形成量逐漸增加，至72 h達到最多（6.16（lg（CFU/cm2））），Y2-11增加較快，至36 h時達到最多（6.61（lg（CFU/cm2））），之后維持相對穩定。值得注意的是，根據上述微孔板結晶紫染色法培養72 h結果選取的強被膜形成能力假單胞菌Y2-210和弱假單胞菌Y2-11，與不銹鋼片被膜形成情況不完全相符，且二者在不銹鋼片表面培養72 h時成膜量相近，分別為6.16（lg（CFU/cm2））和6.33（lg（CFU/cm2））。

混合生物被膜中的大腸桿菌和假單胞菌形成曲線與其各自單菌被膜形成曲線存在較大差異，表明混合成膜時兩菌發生交互作用，且在不同成膜階段表現出不同的交互作用。大腸桿菌C-13被膜形成受假單胞菌Y2-11的影響與成膜階段有關，而假單胞菌Y2-11一直受到大腸桿菌C-13的抑制（圖2C）；大腸桿菌D4-18和假單胞菌Y2-210在培養初期發生相互促進，之后大腸桿菌D4-18始終受到假單胞菌Y2-210的抑制（圖2D）。結果表明，兩個菌株組合混合被膜形成過程中交互作用的動態變化具明顯的菌株差異。

2.3 生物被膜CLSM分析結果

如圖3所示，培養24 h，大腸桿菌單菌生物被膜的紅色熒光信號呈現一定強度并出現聚集，表明大腸桿菌在不銹鋼片表面黏附并聚集，假單胞菌單菌生物被膜的綠色熒光信號弱于大腸桿菌，而混合生物被膜的熒光信號則更弱。培養72 h，單菌培養的大腸桿菌和假單胞菌熒光信號均增多增強，呈現更致密的分布，而混合生物被膜中紅色熒光面積和綠色熒光面積均明顯少于兩種單菌，表明混合培養時兩種單菌的生物被膜形成受到抑制。168 h，大腸桿菌和假單胞菌的被膜分布更加致密，而混合生物被膜中兩菌的分布不如單菌致密，表明此時仍表現為相互抑制。對比被膜量培養計數結果，生物被膜形成過程中CLSM變化情況與被膜量的變化情況一致。

2.4 大腸桿菌和假單胞菌混合被膜形成過程中EPS的變化

2.4.1 EPS蛋白含量

如圖4所示，與72 h相比，168 h單菌生物被膜、混合生物被膜中L-EPS、B-EPS、T-EPS的蛋白含量均顯著增加（P＜0.05），表明隨著成膜時間延長3 種EPS的蛋白質分泌增多。混合生物被膜中3 種EPS的蛋白含量并非都高于兩種單菌生物被膜，但均顯著低于兩單菌生物薄膜中的EPS蛋白含量之和（P＜0.05），其中72 h和168 h混合生物被膜中T-EPS蛋白含量分別較兩單菌生物被膜T-EPS蛋白含量之和減少31%和48%，表明兩菌混合成膜時蛋白質的分泌受到抑制。此外，B-EPS的蛋白含量明顯低于L-EPS。

2.4.2 EPS多糖含量分析

如圖5所示，EPS多糖含量變化與蛋白含量變化類似，隨著成膜時間延長L-EPS、B-EPS、T-EPS的多糖含量均顯著增多（P＜0.05）。與單菌生物被膜相比，混合生物被膜3 種EPS的多糖含量均顯著低于兩單菌生物被膜之和（P＜0.05），其中72 h和168 h混合生物被膜T-EPS多糖含量分別比兩單菌生物被膜T-EPS多糖含量之和減少38%和56%。表明兩菌混合成膜時多糖的分泌受到抑制。此外，B-EPS多糖含量明顯低于L-EPS（P＜0.05）。

圖5 大腸桿菌D4-18和假單胞菌Y2-2 10生物被膜形成時EPS多糖含量變化Fig.5 Changes of polysaccharide content in EPS during biofilm formation by E. coli D4-18 and Pseudomonas Y2-2 10

2.5 生物被膜和浮游菌中相關成膜基因的表達變化

大腸桿菌D4-18的pap C基因標準曲線方程為y=-3.342x＋36.583（R2=0.993）；fimH基因標準曲線方程為y=-3.359x＋35.867（R2=0.997）；csgA基因標準曲線方程為y=-3.089x＋34.695（R2=0.996）。假單胞菌Y2-210的phoR基因標準曲線方程為y=-4.0661x＋41.946（R2=0.997）；cbrA基因標準曲線為y=-3.802x＋43.178（R2=0.991）；其中x為標準質粒拷貝數的對數值（lg（copies/μL）），y為測得的Ct值。5 種成膜基因標準曲線方程的相關系數R2均大于0.99，Ct值在5～30之間，滿足標準曲線要求。

2.5.1 生物被膜中單位面積基因絕對表達量的變化

如圖6所示，大腸桿菌、假單胞菌單菌生物被膜形成時，5 種基因均有一定水平表達，且隨著成膜時間延長不銹鋼片上的表達量增加。與單菌生物被膜相比，混合生物被膜形成過程中假單胞菌phoR、cbrA基因的絕對表達量未發生顯著變化，而大腸桿菌3 個基因的絕對表達量發生顯著變化，72 hpapC、csgA絕對表達量極顯著增加（P＜0.01），168 hcsgA絕對表達量仍極顯著增加（P＜0.01），而papC、fimH絕對表達量極顯著減少（P＜0.01）。

圖6 大腸桿菌D4-18和假單胞菌Y2-2 10單種被膜與混合被膜中單位面積基因表達量的變化Fig.6 Changes of gene expression per unit area in single and mixedspecies biofilms formed by E. coli D4-18 and Pseudomonas Y2-2 10

2.5.2 生物被膜和浮游菌中單位菌數基因的表達差異

考慮到生物被膜與培養液中浮游菌數存在差異，為消除此差異進一步計算生物被膜、培養液浮游菌的單位菌數基因表達量。如圖7所示，與浮游菌相比，大腸桿菌單菌生物被膜和混合生物被膜中3 種成膜基因papC、fimH、csgA的單位菌數表達量在72 h和168 h均極顯著增加（P＜0.01），表明生物被膜形成時相關成膜基因的表達均顯著上調。與單菌培養液中浮游菌相比，混合培養液中的大腸桿菌浮游菌在72 h和168 hcsgA的單位菌數表達量均極顯著降低（P＜0.01），papC基因的單位菌數表達量僅在72 h時極顯著降低（P＜0.01），而fimH的單位菌數表達量無顯著變化，表明混合培養時兩菌發生交互作用，對浮游菌中成膜相關基因的表達產生影響。與單菌生物被膜相比，混合生物被膜中papC和csgA的單位菌數表達量在72 h和168 h極顯著增加（P＜0.01），表明混合生物被膜形成時papC和csgA表達極顯著上調。

圖7 大腸桿菌D4-18和假單胞菌Y2-2 10單種被膜與混合被膜中單位菌數基因表達量的變化Fig.7 Changes of gene expression per unit cell number in single and mixed-species biofilm formed by E. coli D4-18 and Pseudomonas Y2-2 10

如圖7所示，與浮游菌相比，假單胞菌單菌生物被膜和混合生物被膜中2 種成膜基因phoR和cbrA的單位菌數表達量在72 h和168 h均極顯著增加（P＜0.01），表明生物被膜形成時相關成膜基因的表達均顯著上調。與單菌培養液中浮游菌相比，72 h時混合培養液中的假單胞菌浮游菌phoR表達量極顯著增加（P＜0.01），而cbrA基因表達量顯著減少（P＜0.05），其余均無顯著變化，表明混合培養時兩菌發生交互作用，對浮游菌中成膜基因表達產生影響。與單菌生物被膜相比，混合生物被膜中兩種成膜基因phoR和cbrA的表達量在72 h均極顯著減少（P＜0.01），表明混合成膜時兩種基因表達極顯著下調。

3 討論

食源性致病菌和腐敗菌黏附在食品表面并形成生物被膜是食品受到微生物持續性污染的主要來源，給食品工業帶來巨大損失[38]。研究表明，大多數食源性細菌例如沙門氏菌（Salmonella）、單核細胞性李斯特菌（Listeria monocytogenes）、氣單胞菌（Aeromonas）等均具有一定的生物被膜形成能力，且存在明顯菌株差異[39-41]。關于食源性大腸桿菌和假單胞菌的被膜形成能力比較也有相關報道。Bhardwaj等[42]從60 個乳制品和肉類樣品中分離出32 株大腸桿菌，發現30 株菌株具有成膜能力，其中15 株成膜能力較弱，存在明顯菌株差異。Radovanovic等[43]發現臨床環境及乳、肉制品中分離的108 株假單胞菌有98 株可以形成生物被膜，其中68 株具有中等成膜能力，8 株具有強成膜能力。本實驗評估25 ℃培養72 h肉源分離菌株的生物被膜形成能力發現，31 株肉源大腸桿菌和13 株肉源假單胞菌中大部分菌株具有一定的生物被膜形成能力，并且具有明顯菌株差異。但是，Feng Yuqing等[44]對食品環境中分離的68株大腸桿菌進行生物被膜形成能力分析，結果顯示所有菌株均不能形成生物被膜。Lianou等[45]研究發現沙門氏菌生物被膜的形成能力并沒有菌株差異。上述關于菌株生物被膜形成能力的報道并不完全一致，這可能是由于生物被膜的形成能力與菌種、菌株來源、培養條件、環境條件等有關[46]。微孔板結晶紫染色法是評價細菌生物被膜形成能力的常用方法，其簡便快捷，被廣泛應用于實驗室細菌生物被膜的檢測[47]。然而，Yuan Lei等[48]對從乳制品中分離出的假單胞菌分別采用微孔板結晶紫染色法和基于不銹鋼片的平板計數法分析生物被膜形成能力，發現兩種方法之間存在中等相關性；而Sadiq等[49]發現兩種方法之間沒有良好的一致性。本研究采用微孔板結晶紫染色法發現培養72 h大腸桿菌D4-18成膜能力顯著高于C-13，而基于不銹鋼片成膜72 h C-13被膜量反而顯著多于D4-18；同時微孔板結晶紫染色法發現被膜形成能力分別為強和弱的兩株假單胞菌，基于不銹鋼片成膜72 h并無顯著差異，表明兩種評估方法結論不一致。不同材質接觸面，由于表面粗糙度、疏水性、親水性等不同，可能影響細胞黏附和生物被膜形成[48]。

混合被膜內不同菌種之間可發生不同交互作用，呈現促進、競爭或中立效應[46]。有研究發現，假單胞菌可以抑制大腸桿菌[50-51]、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[52]、變形鏈球菌（Streptococcus mutans）和單核細胞李斯特菌等細菌生物被膜的形成[53]。相反，也有報道發現假單胞菌可以促進大腸桿菌[2]、鏈球菌[54]、氣單胞菌[55]和白色念珠菌（Monilia albican）生物被膜的形成。此外，大腸桿菌也有相關報道，它可以促進白色念珠菌、抑制金黃色葡萄球菌等生物被膜的形成[56-57]。本研究中，大腸桿菌和假單胞菌混合成膜時在不同培養時間表現不同的交互作用，且本實驗采用兩個菌株組合混合成膜，在成膜過程中表現出不同的交互作用變化，表明在混合被膜形成過程中，交互作用的變化與菌株和成膜階段有關[24]。本實驗利用CLSM結合導入熒光蛋白基因的方法較好地觀察到混合生物被膜形成過程中發紅色熒光大腸桿菌和發綠色熒光假單胞菌微觀分布情況，且CLSM變化情況與被膜量培養計數變化情況一致。

生物被膜內的細菌可以通過分泌EPS保護細菌免受惡劣環境的影響[58-59]。EPS是生物被膜中細胞周圍的厚基質，既可以與被膜細胞緊密結合形成B-EPS，也可以間接附著在細胞表面形成L-EPS[26]。EPS中胞外多糖可作為胞外基質的基本結構元素，通過相互作用決定生物被膜的機械穩定性和黏附情況，胞外蛋白有助于生物被膜的形成和維持其結構的穩定性。Chen Ping等[60]研究副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）和單核細胞李斯特菌混合生物被膜中EPS化學成分的變化，發現生物被膜EPS中蛋白質和多糖的含量均低于單菌生物被膜，這與本研究結果類似。本實驗發現大腸桿菌和假單胞菌混合成膜過程中，L-EPS和B-EPS中蛋白質和胞外多糖的分泌均受到了抑制，這可能是由于大腸桿菌和假單胞菌的相互作用影響蛋白質和多糖的分泌。此外，本研究發現多糖含量的減少程度高于蛋白質，表明胞外多糖是混合生物被膜結構減少的主要原因[60]。

生物被膜形成過程中，由于生存環境和狀態的改變以及復雜的相互作用，可能影響成膜基因的表達，進而改變細菌對食品表面的黏附情況，影響食品安全[61-62]。本實驗發現，與培養液浮游菌相比，生物被膜形成時大腸桿菌和假單胞菌菌體相關成膜基因的表達均顯著上調，表明這些基因參與調控生物被膜形成。混合生物被膜形成過程中相關基因的表達變化大多采用real-time PCR相對定量方法，與報道結果不完全一致；例如，在糞腸球菌（Enterococcus faecalis）存在下白色念珠菌的黏附相關基因表達上調，而糞腸球菌的被膜形成相關基因表達下調[63]。Xu Jingguo等[64]研究腸炎沙門氏菌與副蕈狀芽孢桿菌（Bacillus paramycoides）形成雙菌生物被膜中菌株的基因表達變化，發現屬于腸炎沙門氏菌生物被膜形成和環境抗性途徑的基因顯著上調。本研究采用絕對定量方法，消除菌數差異后也可反映菌體基因表達差異，發現與單菌生物被膜相比，混合生物被膜形成時大腸桿菌成膜基因papC、csgA的表達均顯著上調，而假單胞菌成膜基因phoR和cbrA表達在72 h顯著下調。上述關于混合生物被膜形成時相關基因表達變化的報道不完全一致，可能與菌種、菌株、成膜條件等因素有關[46]。本實驗相關基因表達量變化與混合成膜過程中交互效應的變化不相符，可能是混合成膜時多個基因共同參與，而本實驗采用絕對定量方法，僅分析了大腸桿菌特異性的3 個基因和假單胞菌特異性的2 個基因，關于其他成膜基因的變化尚需進一步研究探討。此外，本研究基于不銹鋼片單位面積基因絕對表達量發現，大腸桿菌、假單胞菌單菌生物被膜形成時，5 種基因均有一定量表達，且隨著成膜時間延長不銹鋼片上的菌株基因表達量增加；與單菌生物被膜相比，混合生物被膜形成時基因絕對表達量發生不同程度變化，這與大腸桿菌和假單胞菌的生物膜形成量差異及兩者之間的交互作用有一定相關性。real-time PCR絕對定量方法不僅可以通過消除菌數差異分析菌體相關基因的表達差異，還可直接定量反映接觸表面或生長環境中基因實際表達量，從而為評估環境和食品微生物安全風險水平提供更直接的科學依據。

4 結論

本研究對肉源分離的大腸桿菌和假單胞菌進行被膜形成能力比較，發現存在明顯的菌株差異。大腸桿菌和假單胞菌混合生物被膜形成過程中，不同成膜時間表現不同的交互作用變化。生物被膜形成過程中CLSM變化情況與被膜量培養計數的變化情況一致。在混合生物被膜形成過程中，EPS中蛋白質和多糖的分泌受到抑制。采用real-time PCR絕對定量方法分析成膜基因表達量，基于單位菌數基因表達量發現，單菌被膜與混合被膜、生物被膜黏附菌體與培養液浮游菌體相關基因的表達存在差異；基于不銹鋼片單位面積基因絕對表達量發現，5 種成膜基因均有一定量表達，混合成膜時基因絕對表達量發生不同程度變化。絕對定量方法不僅可以分析菌體相關基因的表達水平差異，還可直接定量反映接觸表面或生長環境中基因實際表達量，從而為評估環境和食品微生物安全風險水平提供更直接的科學依據，這也對今后食源性致病菌生物被膜形成時的毒性評估具有重要指導意義。