蘋果內生菌Torulaspora delbrueckii強化對蘋果醋風味物質合成的影響

宋雪苗，馬世源，李子健，羅惠波，黃 丹,2,*

（1.四川輕化工大學生物工程學院，四川 自貢 643000；2.四川省川南曬制麩醋生物釀造技術工程實驗室，四川 宜賓 644000）

蘋果醋作為一種健康風味飲品，具有較為廣泛的市場認可度。2021年我國蘋果醋飲料的市場規模已超50億 元且將持續增長。蘋果醋揮發性香氣成分豐富，對4 個品牌市售蘋果醋的揮發性風味物質進行分析，共鑒定到111 種化合物，其中相對含量較高的是醇類、醛類、酯類和其他雜環類化合物；而乙酸乙酯、乙酸丙酯、3-甲基丁酸乙酯、乙酸異戊酯、2-甲基丁基乙酸酯、3-甲基丁酸戊酯、己醛、苯甲醛和2,3-二氫呋喃9 種化合物則是4 種蘋果醋飲料中的共有化合物[1]。蘋果醋的營養風味物質主要來源于發酵過程中微生物對糖類等成分的轉化和微生物代謝，以及水果天然的香氣等。傳統上，僅使用釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）參與蘋果醋酒精發酵。使用單一菌種發酵易于獲得一致、穩定的味道和香氣，但會導致產品的香氣復雜性和典型性較少。與S.cerevisiae相比，非釀酒酵母具有改善發酵制品風味的潛力[2-4]。非釀酒酵母種類繁多，包括葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）、美極梅奇酵母（Metschnikowia pulcherrima）、戴爾凱氏有孢圓酵母（Torulaspora delbrueckii）、畢赤酵母（Pichiaspp.）等。Liu Qing等[5]采用熱帶假絲酵母（Candida tropicalis）和芳香酵母進行酒精發酵，發現混合培養的蘋果醋中水果風味和花香味均高于單一培養。另外，Ni Zhenghang等[6]通過T.delbrueckii與S.cerevisiae共培養發現，醇類、乙酯類和萜烯的含量增加，并使蘋果酒具有濃郁的水果和花香味。然而，關于T.delbrueckii對果醋風味的影響卻鮮有報道。

內生菌是棲息在植物組織內部而不對植物造成明顯傷害的微生物[7]，一般具有調節植物生長、抵御環境損傷和提高植物抗病性等功能[2,8-9]。通過與宿主的長期共存，這類微生物已經發展出強大的代謝途徑。據報道，一些內生菌合成的次級代謝產物與其宿主產生的生物活性物質類似[10]；Liu Feng等[11]發現咖啡豆表面的天然內生菌在改善咖啡風味特征方面具有重要貢獻。然而，在以往研究中，蘋果內生菌對蘋果醋風味的影響鮮有報道。

因此，為更全面地了解蘋果內生菌T.delbrueckiiS1對蘋果醋風味品質的影響，本研究將實驗室分離自蘋果的內生菌T.delbrueckiiS1用于蘋果醋發酵實驗，采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜（headspace solid-phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS）和高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）測定其風味成分，并探明T.delbrueckiiS1菌株對蘋果醋發酵過程揮發性風味物質間相互作用的影響。目前，涉及蘋果醋特征風味的研究很少，本研究就提高蘋果醋典型性蘋果香、花香和醋香以改善其風味品質提供支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅富士蘋果（Malus pumilaMill.）；T.delbrueckiiNJSYGA 2021（T.delbrueckiiS1）從蘋果中分離獲得，現保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC M 2022046，T.delbrueckiiS1的最適發酵溫度25 ℃，最適pH 3.5；葡萄酒活性干酵母BV818（S.cerevisiae）（活菌數1.5×1011CFU/g）湖北安琪酵母股份有限公司；醋酸菌（活菌數2×1010CFU/g）成都曲賦生物科技有限公司。

果膠酶（酶活力≥1000 U/g）山東科隆特酶制劑有限公司；蔗糖、檸檬酸（均為食品級）廣西珍露食品有限公司；乙酸戊酯 Adamas試劑有限公司；甲醇（色譜級）上海阿拉丁生化科技股份有限公司；草酸、酒石酸、L-蘋果酸、L-乳酸、乙酸、檸檬酸、琥珀酸（均為色譜級）成都德思特生物技術有限公司；其他試劑均為分析純 成都市科隆化學有限公司。

1.2 儀器與設備

ZHJH-C118C超凈工作臺、ZWYR-D2403恒溫培養振蕩器 上海智城分析儀器制造有限公司；ME20E/02電子天平、FE20K pH計 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；WZS80持式糖量計 上海物光儀器有限公司；離心機 德國Eppendorf股份公司；BXM-75VD立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海博迅醫療生物儀器股份有限公司；LC-2030C 3D Plus HPLC儀 島津企業管理（中國）有限公司；7890A/5975B GC-MS儀 美國Agilent公司；50/30 μm DVB/CAR/PDMS纖維萃取頭 美國Supelco公司；SPME裝置 蘇州安益譜精密儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 蘋果醋發酵實驗

參考已有報道[12-13]并進行適當修改。將成熟的蘋果去皮、去核，果肉與去離子水按質量比1∶1榨汁，加入20 mg/L果膠酶（（37±2）℃，60 min）和56 mg/L K2S2O5，添加蔗糖調節果漿的總可溶性固形物含量為15 °Brix，再用檸檬酸調節pH 3.5，以70 ℃巴氏殺菌15 min對果漿進行殺菌。

實驗組以各體積分數6%（106CFU/mL）的接種量同時接種S.cerevisiae和T.delbrueckiiS1于果漿中，在25 ℃條件下發酵至乙醇體積分數約6%，再以0.4 g/100 mL接種量接種醋酸菌，醋酸發酵階段采用8 層紗布密封發酵瓶，發酵溫度為31 ℃，搖床轉速為180 r/min，發酵時間為24 d。對照組在酒精發酵階段僅接種體積分數6%S.cerevisiae（106CFU/mL），醋酸發酵條件與實驗組一致。所有樣品均做3 份生物學重復。取樣時間為酒精發酵結束以及醋酸發酵的3、6、8、10、12、14、16、18、20、22 d和24 d（對照組A和實驗組H的1～11分別對應3～24 d）。

1.3.2 理化指標測定

總酸含量的測定：酸堿滴定法（以酒石酸計）[14]；乙醇體積分數的測定：酒精計法[15]。每份生物學重復測定3 次。

1.3.3 蘋果醋揮發性風味物質測定

采用HS-SPME-GC-MS法測定揮發性物質。將5.0 mL蘋果醋加入15 mL頂空瓶中，添加2.0 g氯化鈉，再添加6 μL乙酸戊酯作為內標。樣品在50 ℃條件下密封平衡15 min，再采用DVB/CAR/PDMS萃取頭于50 ℃條件下頂空吸附40 min，將萃取頭插入GC進樣口解吸2 min進行分析。每份生物學重復分析2 次。

色譜條件：色譜柱：DB-1MS熔斷石英毛細管（60 m×0.25 mm，0.25 μm）分離；升溫程序：45 ℃保持1 min，再以5 ℃/min升溫至190 ℃，保持25 min，總運行時間為55 min；不分流；載氣（He）流速為1.0 mL/min。質譜條件：離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃，離子化方式為電子電離源，電子能量70 eV，質量掃描范圍45～500 u。

定性：通過檢測得到香氣成分的保留時間和質譜數據，將這些數據與相關文獻以及NIST 05質譜庫進行匹配定性，僅報道Qual≥70的鑒定結果。定量：采用內標法進行定量，內標為乙酸戊酯。各揮發性成分含量計算公式如下：

1.3.4 蘋果醋主要有機酸測定

采用HPLC法測定有機酸。配制質量濃度為300、200、100、50、25 m g/L 的琥珀酸標準品溶液；配制質量濃度為200、100、50、20、10、5 mg/L的L-蘋果酸、L-乳酸、乙酸、檸檬酸、酒石酸、草酸標準品溶液。

取5 mL樣品6000 r/min離心2 min，上清液稀釋10 倍并用0.22 μm水相濾頭過濾，樣品通過ZORBAX SB-C18分析柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）進行分析，進樣量為15 μL。流動相為甲醇-0.01 mol/L磷酸二氫鉀（pH 2.5）（5∶95，V/V），流速為0.4 mL/min。柱溫為25 ℃，檢測波長為210 nm。

1.4 統計分析

通過計算代謝物的倍數變化和P值進行兩組之間的統計分析，如果相關的P＜0.05，則認為結果的差異顯著。使用Origin（2020版）繪制折線圖，使用R軟件（4.1.3版本）繪制熱圖和箱線圖。由SIMCA 14.1建立正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA）模型并計算投影變量重要性值（variable importance projection，VIP）。共現性網絡的構建使用Gephi（0.9.2版本）。

2 結果與分析

2.1 蘋果醋理化指標

如圖1所示，隨著發酵的進行，兩組蘋果醋的乙醇體積分數均呈不斷下降的趨勢，相反地，總酸含量則先迅速增加而后小輻波動，總酸含量趨于穩定標志著醋酸發酵結束。酒精發酵結束至醋酸發酵的第10天，兩組蘋果醋中乙醇體積分數的波動明顯，這可能是酒精發酵和醋酸發酵同時進行導致；酒精發酵結束至醋酸發酵的第6天，兩組蘋果醋的總酸含量均大幅增加，這可能是因為醋酸菌促進了醇類物質轉化為酸類。醋酸發酵結束時，實驗組和對照組蘋果醋的乙醇體積分數十分接近，實驗組的總酸含量比對照組高。

圖1 乙醇體積分數和總酸含量隨發酵時間變化情況Fig.1 Changes in ethanol and total acid contents during apple vinegar fermentation

2.2 T. delbrueckii S1菌株對蘋果醋揮發性風味物質合成的影響

以S.cerevisiae參與酒精發酵為對照組，T.delbrueckiiS1與S.cerevisiae混合發酵為實驗組，再分別接種醋酸菌進行蘋果醋醋酸發酵。通過HS-SPME-GC-MS法檢測實驗組和對照組蘋果醋發酵過程中的揮發性風味物質，分別鑒定出46 種和50 種主要揮發性物質，包括17 種醇、17 種酯、5 種醛、1 種酮、5 種酸、4 種酚和6 種其他物質。風味Heatmap圖可以直觀反映蘋果醋發酵過程中揮發性風味物質的變化和差異。如圖2所示，蘋果醋酒精發酵結束時，對照組中揮發性風味物質總量多于實驗組。2,3-丁二醇、3-羥基-2-丁酮、乙酸、癸酸和月桂酸乙酯為對照組的獨有物質；乙酸苯乙酯、正己醇、3-乙氧基丙醇、己酸和異丁酸乙酯則僅在實驗組中檢出。

圖2 蘋果醋酒精發酵結束揮發性風味物質聚類熱圖Fig.2 Clustering heatmap of volatile aroma components in apple vinegar at the end of alcoholic fermentation

分別對兩組蘋果醋醋酸發酵過程揮發性代謝物進行聚類，如圖3所示，對照組和實驗組均可分為兩個階段，但兩者的階段性差異不大。說明T.delbrueckiiS1對蘋果醋揮發性風味物質合成的階段性無明顯影響。

隨著蘋果醋醋酸發酵的進行，兩組蘋果醋中揮發性風味物質的種類和含量總體上均逐漸增加。其中，2,3-丁二醇、乙醛、苯乙醇、異丁醇、3-羥基-2-丁酮等物質在醋酸發酵初期的含量較高，隨著發酵的進行迅速減少再緩慢增加至發酵結束。這是由于醇類、醛類和酮類等物質常作為合成酸類、酯類和其他化合物的前體物質，例如苯乙醇含量的減少可能是在乙酸存在的條件下，苯乙醇與乙酸合成了乙酸苯乙酯[16]。醋酸發酵結束時，丙酸苯乙酯和N,N-二甲基丙酰胺僅在實驗組中檢出，辛酸、癸酸、辛酸乙酯和月桂酸乙酯等僅存在于對照組中。辛酸乙酯呈白蘭地酒香味，月桂酸乙酯帶有月桂油香氣；丙酸苯乙酯呈似香甜紅玫瑰香氣并帶有水果底香及似濃厚的甜的蜂蜜和草莓風味。結果表明，T.delbrueckiiS1菌株參與發酵對蘋果醋水果樣揮發性風味物質的合成具有重要作用。

2.3 T. delbrueckii S1強化對差異揮發性風味物質的影響

T.delbrueckiiS1菌株強化前后蘋果醋中揮發性風味物質種類的差異見圖4a。對照組與實驗組共有揮發性風味物質為41 種，對照組的獨有揮發性物質（9 種）多于實驗組（5 種）。這說明實驗組與對照組的揮發性風味物質種類具有明顯差異，而差異代謝物主要集中在對照組。另外，兩組蘋果醋醋酸發酵階段揮發性風味物質的組成差異見圖4b。醋酸發酵開始時，兩組樣品聚集在一起；隨著發酵的進行，兩組樣品呈明顯的分離趨勢，對照組和實驗組樣品分布分別趨向于第1象限和第2象限；至醋酸發酵第22天，兩組樣品徹底分開。這說明醋酸發酵前中期兩組蘋果醋的揮發性風味物質組成相似，隨著醋酸發酵的進行，其揮發性物質組成逐漸呈現出明顯的差異。通過排列檢驗對200 個排列的響應驗證了OPLSDA模型的正確性，如圖4c所示，所有R2和Q2值均低于原始值，藍色回歸線與垂直軸的交點小于零[17]。

圖4 蘋果醋醋酸發酵階段揮發性風味物質Venn圖（a）、OPLS-DA（b）、排列測試圖（c）及基于OPLS-DA的VIP值（d）Fig.4 Venn diagram (a),OPLS-DA plot (b),permutation test plot (c) and VIP values from OPLS-DA model (d) of volatile flavor substances during the acetic acid fermentation stage of apple vinegar

通過計算基于OPLS-DA的VIP值，明確了兩組蘋果醋的21 種差異代謝物（VIP＞1，P＜0.05），如圖4d所示。3-乙氧基丙醇、苯甲醇、癸酸、乙酸苯乙酯、正辛酸、苯甲醛、正丙醇、月桂酸乙酯、苯乙醇、2,3-丁二醇、己酸、正己酸乙酯、3-羥基-2-丁酮、正丁醇、2,4-二叔丁基苯酚、辛酸乙酯、異丁醇、丙酸苯乙酯、2,6-二叔丁基對甲酚、2,4,5-三甲基-1,3-二氧戊環和癸酸乙酯是兩組蘋果醋的差異揮發性風味物質。其中，3-乙氧基丙醇、乙酸苯乙酯、2,3-丁二醇、苯乙醇、丙酸苯乙酯、苯甲醇和苯甲醛在實驗組中的含量更高，對實驗組蘋果醋的特征風味具有重要影響。乙酸苯乙酯帶有似蘋果樣果香、玫瑰花香及蜂蜜樣底香[18]；苯甲醇賦予發酵產品花香和果香[19]；苯甲醛具有苦杏仁、櫻桃及堅果香[19]。苯乙醇是在厭氧過程中通過酵母的代謝反應由L-苯丙氨酸衍生而來[20]，其帶有柔和、愉快且持久的玫瑰香氣及微苦后甜的桃子味[21]并有助于醋味的形成[22-23]。同時，造成對照組蘋果醋風味區別于實驗組的揮發性物質包括癸酸、正辛酸、正丙醇、己酸、正己酸乙酯、月桂酸乙酯、3-羥基-2-丁酮、辛酸乙酯、異丁醇、正丁醇、癸酸乙酯及多種酚類物質。正丙醇具有令人愉悅的甜味[20]，正己酸乙酯帶水果香，癸酸乙酯具有似玫瑰香、微弱果香及明顯的脂肪臭味[24]?？梢奣.delbrueckiiS1強化發酵有助于增強蘋果醋的典型性蘋果香和花香。

2.4 T. delbrueckii S1對蘋果醋揮發性風味物質網絡結構的影響

基于共現網絡分別構建對照組和實驗組揮發性物質網絡以認識T.delbrueckiiS1對蘋果醋揮發性風味物質伴生關系的影響，結果見圖5。通過計算網絡模型的拓撲系數發現，對照組共現網絡共有30 個節點和130 條邊，模塊化為0.173；實驗組共現性網絡共有25 個節點和154 條邊，模塊化為0.033。實驗組網絡中的節點數目較對照組少，邊數卻明顯比對照組多，這說明實驗組揮發性物質之間的聯系更強、更復雜。共現網絡中的模塊化是指網絡中的節點構成內部聯系較強，而與外部聯系較弱的部分，模塊化越低說明物質之間相互作用的傳遞性越強。實驗組的模塊化系數（0.033）低于對照組（0.173），這可能是由于內生菌T.delbrueckiiS1產生的代謝產物與S.cerevisiae及醋酸菌產生的物質間的相互作用導致。結果表明，T.delbrueckiiS1強化增加了揮發性代謝產物的復雜性。

為進一步研究共現網絡中節點的作用及貢獻，計算了網絡中節點的拓撲性質，見表1。節點的中心性是指經過該節點的最短路徑數量，介數中心性的提出為衡量節點中心性提供了標準[25]。正辛酸、苯酚、琥珀酸二乙酯、苯乙醇和苯乙酸乙酯等在對照組中的介數中心性較高，而正丁醇和乙醛在實驗組中較高。節點的介數中心性越大，該節點在保持整個網絡緊密連接中的作用越重要?？梢?，正辛酸、苯酚等物質在對照組揮發性物質相互作用的傳遞及網絡的穩定性方面起重要作用。在實驗組中，乙醛與乙酸苯乙酯、苯乙醇等屬于一個模塊，正丁醇與乙酸等屬于同一模塊，這說明乙醛和正丁醇對實驗組特征揮發性風味物質的形成具有重要作用。實驗組和對照組的重要節點明顯不同，這可能也是兩組蘋果醋風味顯著不同的原因。

2.5 T. delbrueckii S1強化對蘋果醋有機酸合成的影響

采用HPLC法測定了7 種有機酸，分別為L-蘋果酸、L-乳酸、乙酸、檸檬酸、琥珀酸、酒石酸和草酸。以色譜峰面積對各個標準有機酸標準溶液濃度進行線性回歸分析，結果表明7 種有機酸標準曲線線性擬合系數均在0.9997～0.9999之間，說明該方法可以對有機酸進行準確的定量分析。兩種蘋果醋共檢測出5 種有機酸，如圖6所示，對照組中L-蘋果酸含量隨發酵進行先迅速減少然后趨于平穩，實驗組中L-蘋果酸則呈不斷增加的趨勢；發酵結束時實驗組中L-蘋果酸含量顯著高于對照組。L-蘋果酸是生物體代謝過程中的重要有機酸，其在線粒體產生能量物質ATP的過程中起重要作用。研究表明，L-蘋果酸可以縮小心肌梗死面積，抑制炎性細胞因子的表達，從而部分保留動物心臟功能并增加心肌損傷后的抗氧化活性[26]。兩組蘋果醋中L-乳酸含量的變化與L-蘋果酸相反；發酵結束時，實驗組中L-乳酸的含量顯著高于對照組。Kobayashi等[27]發現L-乳酸在糖尿病海馬功能障礙中具有重要作用，即側腦室注射L-乳酸可減輕糖尿病小鼠的認知功能障礙。在整個醋酸發酵過程中，對照組中的琥珀酸含量幾乎均高于實驗組；發酵結束時，對照組中琥珀酸的含量顯著高于實驗組。已有報道顯示，與S.cerevisiae相比，非釀酒酵母產生琥珀酸的能力更弱[28]；而Benito[29]通過研究也發現，T.delbrueckii比S.cerevisiae更利于產生琥珀酸，但這都是基于單一菌種發酵而言。當T.delbrueckiiS1菌株強化發酵時則可能因其與S.cerevisiae及醋酸菌的相互作用而降低產琥珀酸的能力；另一方面，琥珀酸是由丙酮酸通過蘋果酸、富馬酸和一些氨基酸的分解形成的代謝物，它很容易與其他分子反應形成酯[30]。特別地，實驗組中乙酸含量顯著高于對照組，乙酸是醋酸風味的主要來源，在一定范圍內乙酸含量越高，醋的特性越明顯；乙酸通過激活MAPK途徑可誘導血糖降低[31-32]。在整個醋酸發酵過程中，兩組蘋果醋中L-蘋果酸、L-乳酸、琥珀酸和乙酸的含量幾乎均呈現出顯著差異；而檸檬酸隨著發酵的進行逐漸減少且未呈現出顯著差異（P＜0.05）。實驗組中較多的L-蘋果酸可調和乙酸的酸味和刺激性，提高蘋果醋酸味的平和性[22]。

圖6 蘋果醋醋酸發酵階段有機酸箱線圖Fig.6 Box plot of organic acids during acetic acid fermentation of apple vinegar

3 結論

本研究采用HS-SPME-GC-MS及HPLC技術分別測定蘋果醋揮發性風味物質和有機酸，分析蘋果內生菌T.delbrueckiiS1對蘋果醋風味品質的影響。結果表明，兩組蘋果醋的主要揮發性風味物質在種類和含量上均有差異，而蘋果內生菌T.delbrueckiiS1對其合成的階段性無明顯影響。Venn圖結果表明，對照組的獨有揮發性物質比實驗組多，即差異代謝物多集中在對照組。基于OPLSDA的VIP值（P＜0.05，VIP＞1）進一步篩選到苯甲醇、癸酸、乙酸苯乙酯、正辛酸、苯甲醛、月桂酸乙酯、苯乙醇、正丙醇、己酸、正己酸乙酯、3-羥基-2-丁酮、辛酸乙酯、丙酸苯乙酯和癸酸乙酯等21種香氣物質在兩組蘋果醋中的含量差異達到顯著水平。通過比較發現，在實驗組中更加突出的乙酸苯乙酯、苯乙醇、苯甲醛、苯甲醇等具有典型性蘋果香等果香和花香；在對照組中較為突出的辛酸乙酯、己酸乙酯和月桂酸乙酯等具酒香、果香及精油香氣。基于共現網絡對兩組蘋果醋揮發性風味物質網絡及揮發性物質之間的伴生關系和相互作用進行分析，發現T.delbrueckiiS1強化發酵會增加揮發性代謝產物之間的聯系和復雜性，并且揮發性代謝物之間的相互作用導致其伴生關系發生變化。另外，箱線圖表明實驗組中L-蘋果酸、L-乳酸和乙酸含量顯著高于對照組。本研究探討了蘋果內生菌T.delbrueckiiS1對蘋果醋風味物質合成的影響，T.delbrueckiiS1與S.cerevisiae之間的底物競爭、細胞接觸機制及香氣化合物間的協同作用對風味物質合成的影響機制還有待進一步研究。