發酵溫度對低鹽蝦醬中主要風味物質的影響

楊兵兵，王利文，陳智慧，劉楊柳，陳椿江，孫紀錄,*

（1.河北農業大學食品科技學院，河北 保定 071000；2.云南省曲靖農業學校生物技術學部，云南 曲靖 655000；3.黃驊市眾信水產有限公司，河北 黃驊 061100）

蝦醬是由小毛蝦等低值蝦類與食鹽混合、發酵制成的糊狀食品，其味道鮮美，且富含蛋白質、脂肪、類胡蘿卜素和微量元素等多種營養物質[1]，深受消費者的喜愛。中國蝦醬每年產量約40000 t[2]，是全球最大的蝦醬生產國。傳統蝦醬的含鹽量通常在25%～33%之間，鹽含量較高。低鹽蝦醬是與傳統蝦醬發酵方法相似但含鹽量較低（10%～12%）的一種新型蝦醬，更為符合現代健康飲食的理念，因而更具有開發潛力與市場。

蝦醬的風味是評價蝦醬品質的重要指標，也是影響消費者購買的直接原因。蝦醬中富含的蛋白質、脂肪等營養物質，會在發酵過程中發生降解、氧化等反應，生成游離氨基酸、游離脂肪酸和揮發性化合物等物質[3]，從而賦予蝦醬特有的風味。然而，由于低鹽蝦醬鹽含量較低，為控制微生物引發的腐敗變質，目前低鹽蝦醬只能在寒冷季節通過自然發酵生產，從而導致發酵周期長，易受溫度、天氣等不可控因素的影響，產品質量不穩定，風味受影響較大。發酵溫度會對發酵產品中的風味物質產生極大影響。Zhao Yuzong等[4]通過不同溫度發酵黃酒研究得出，低溫發酵對黃酒中的風味物質有積極的影響。Tian Xuyan等[5]通過兩階段不同溫度發酵魚研究得出，使用不同溫度的兩階段發酵可以改良發酵魚的風味。

在適宜的溫度下進行低鹽蝦醬的恒溫發酵，是目前克服依賴寒冷季節自然發酵低鹽蝦醬諸多缺陷的一個重要途徑。然而，目前關于蝦醬的研究主要是集中于傳統的高鹽蝦醬[6-10]，對低鹽蝦醬的研究較少[11-12]。并且，在已報道的低鹽蝦醬研究中，也主要是集中于理化指標和微生物區系等方面[12]。目前，關于不同發酵溫度對低鹽蝦醬中風味物質的影響，信息十分匱乏。

因此，為了解發酵溫度對低鹽蝦醬中風味物質的影響，本研究分別在10、15、20 ℃和25 ℃條件下進行低鹽蝦醬的恒溫發酵。采用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法及氣相色譜（gas chromatography，GC）法分別檢測蝦醬中的游離氨基酸和游離脂肪酸的含量。利用氣相色譜-離子遷移譜（gas chromatography-ion mobility spectrometry，GC-IMS）分析鑒定蝦醬中的揮發性化合物種類，并結合主成分分析（principal component analysis，PCA）和正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least squaresdiscriminant analysis，OPLS-DA）等多元統計方法，從多個方面分析不同溫度發酵的低鹽蝦醬中揮發性化合物的差異，以期為推動低鹽蝦醬工廠生產中實現恒溫發酵提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蜢子蝦（Grasshopper sub），產自河北黃驊；精制鹽（未加碘）山東肥城精制鹽廠有限公司。

乙腈（色譜級）美國Fisher Chemical公司；2,4-二硝基氯苯 山東英朗有限公司；冰乙酸 天津新技術產業園區科茂化學試劑有限公司；碳酸氫鈉、碳酸鈉、乙酸鈉、氯仿、乙醚、正己烷、甲醇、三氟化硼甲醇絡合物（均為分析純）國藥集團化學試劑有限公司；17 種氨基酸混合標準品、十一烷酸標準品 美國Sigma公司。

1.2 儀器與設備

FlavourSpec?風味分析儀 德國G.A.S公司；LC-2030 Plus液相色譜儀 日本島津公司；7820A GC儀安捷倫科技（中國）有限公司；SPM-50智能生化培養箱寧波江南儀器廠；TGL-16MC低溫冷凍離心機 長沙湘銳離心機有限公司。

1.3 方法

1.3.1 低鹽蝦醬的制作

選取新鮮蜢子蝦為原料，清洗、瀝水、稱量，按照蜢子蝦質量的10%添加精制鹽，混勻后分裝于玻璃發酵罐（每罐800 g）中，用布密封，分別于10、15、20 ℃和25 ℃的培養箱中進行恒溫自然發酵，每個溫度處理組作兩個平行，待發酵結束后對低鹽蝦醬中游離氨基酸、脂肪酸和揮發性化合物進行檢測。其中未發酵的低鹽蝦醬記作0 d。

1.3.2 游離氨基酸的測定

參考Toh等[13]的方法。稱取0.5 g蝦醬樣品，用0.1 mol/L鹽酸定容至25 mL；對其溶解液進行衍生，95 ℃避光反應150 min；取出冷卻至室溫，上清液過有機膜，HPLC待測。HPLC條件：Waters symmetry C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，4.6 μm）；柱溫：40 ℃；流動相A：乙腈；流動相B：乙酸-乙酸鈉緩沖液；流速：1.5 mL/min；進樣量：10 μL。每個樣品做3 次平行。

1.3.3 游離脂肪酸的測定

參考Xu Yanshun等[14]的方法。稱取5 g蝦醬樣品，置于50 mL離心管中，加入15 mL氯仿-甲醇（2∶1，V/V）溶液，振蕩混勻，靜置1 h過濾，向濾液中加入5 mL生理鹽水，4000 r/min離心20 min，取下層濾液氮氣吹干。加2 mL 14%三氟化硼甲醇絡合物和25 μL 10 mg/mL的十一烷酸內標物，60 ℃甲酯化30 min。冷卻至室溫，加2 mL正己烷和2 mL蒸餾水，振蕩 1 min，靜置分層，取上層有機相過有機膜，GC待測。GC條件：HP-88安捷倫色譜柱（100 m×0.25 mm，0.25 μm）；流量：1 mL/min；進樣口溫度：270 ℃；分流比：30∶1。每個樣品做3 次平行。

1.3.4 揮發性化合物的測定

檢測樣品制備：取蝦醬樣品1 g，加入20 mL頂空瓶中備用，用于GC-IMS檢測。

進樣條件：樣品孵化溫度40 ℃，孵化時間20 min，孵化轉速500 r/min，采用自動頂空進樣單元的方式，進樣體積200 μL，進樣針溫度85 ℃。

GC條件：MXT-5色譜柱（15 m×0.53 mm，1 μm）；柱溫為60 ℃；運行時間為30 min；載氣為N2（≥99.99%）；不分流模式進樣。

IMS條件：溫度為45 ℃；漂移氣為N2（≥99.99%）；漂移氣流速150 mL/min。

1.4 數據統計與分析

采用IBM SPSS Statistic 22.0進行數據差異統計分析；通過Origin 8.5分析數據制圖；采用GC-IMS配套的VOCal軟件內置NIST數據庫和IMS數據庫對揮發性化合物進行定性分析；采用GalleryPlot插件繪制不同溫度發酵的低鹽蝦醬中揮發性成分的指紋圖譜；采用SIMCA Version 14.1對蝦醬中揮發性化合物進行多元統計分析和差異風味化合物分析。

2 結果與分析

2.1 不同溫度發酵的低鹽蝦醬中游離氨基酸組成分析

游離氨基酸是形成多種風味物質的前體[15]，因此低鹽蝦醬中游離氨基酸的組成及含量變化對低鹽蝦醬獨特風味的形成十分重要。由表1可以看出，不同溫度發酵的低鹽蝦醬中均檢出17 種游離氨基酸，但游離氨基酸總含量不同：10 ℃與15 ℃兩組低鹽蝦醬中游離氨基酸總量相近，分別為10.398%和10.174%；20 ℃與25 ℃兩組的游離氨基酸總量也相近，但卻顯著低于10 ℃與15 ℃兩組（P＜0.05），分別為6.405%和6.433%。進一步分析發現，每種游離氨基酸含量均呈現上述變化，即當發酵溫度達到或超過20 ℃時，低鹽蝦醬中的每種游離氨基酸含量將顯著降低。該結果表明，發酵溫度的升高不利于低鹽蝦醬中游離氨基酸的積累，這可能是由于較高溫度能夠加速促進蝦醬中游離氨基酸形成新的風味物質[16]。

游離氨基酸本身也具有風味特征，17 種游離氨基酸根據其呈味特性被分為鮮味氨基酸（Asp、Glu）、甜味氨基酸（Thr、Ser、Pro、Gly、Ala和Lys）、苦味氨基酸（Val、Met、Ile、Leu、Tyr、Phe、Arg和His）和無味氨基酸（Cys）4 類呈味氨基酸[17]。由圖1可知，甜味氨基酸和苦味氨基酸在各組低鹽蝦醬中均占主導位置，且10 ℃和15 ℃發酵的低鹽蝦醬中鮮味氨基酸、甜味氨基酸和苦味氨基酸的含量顯著（P＜0.05）高于其他兩組，表明低溫發酵能夠賦予低鹽蝦醬更濃郁的滋味。其中，Glu在各組低鹽蝦醬呈味氨基酸中含量均較高，并在10 ℃發酵的低鹽蝦醬中含量最高（表1），因此，Glu被認為是低鹽蝦醬味道鮮美的關鍵氨基酸[18]，這與江津津等[19]的研究結果相似。Ala能夠為發酵產品提供香甜的味道[20]，它在10 ℃和15 ℃發酵的蝦醬中含量較高，能夠賦予該溫度發酵蝦醬味道香甜溫和的特點；Ala還可以作為酸味矯正劑[21]，改善蝦醬中的酸味。Gao Ruichang等[22]研究也發現，Glu和Ala分別是傳統蝦醬中甜味與鮮味的關鍵氨基酸。綜上所述，低鹽蝦醬中游離氨基酸的存在能夠促進蝦醬風味的形成。

圖1 不同溫度發酵的低鹽蝦醬中呈味氨基酸含量Fig.1 Flavor amino acid contents in low-salt shrimp pastes fermented at different temperatures

2.2 不同溫度發酵的低鹽蝦醬中游離脂肪酸組成分析

游離脂肪酸的含量主要取決于脂肪分解及脂質氧化程度[14]，其存在有利于風味物質的產生。由表2可知，各組低鹽蝦醬中均檢出了26 種游離脂肪酸，其組成主要以肉豆蔻酸（C14:0）、棕櫚酸（C16:0）、硬脂酸（C18:0）、亞油酸（C18:2）以及順-5,8,11,14,17-二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）和順-4,7,10,13,16,19-二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）為主。然而，不同溫度發酵的蝦醬中游離脂肪酸含量存在顯著差異。其中，20 ℃發酵的蝦醬中游離脂肪酸總含量為786.814 μg/g，顯著高于其他溫度發酵的蝦醬。并且，飽和脂肪酸、單不飽和脂肪酸以及多不飽和脂肪酸在20 ℃發酵的蝦醬中含量均高于其他溫度發酵的蝦醬。

表2 不同溫度發酵的低鹽蝦醬中游離脂肪酸含量Table 2 Free fatty acid contents in low-salt shrimp pastes fermented at different temperatures

不同溫度發酵的蝦醬中，各種游離脂肪酸（除丁酸外）含量均隨著溫度升高呈先上升后下降的趨勢，并在20 ℃發酵的蝦醬中達到最高值。該變化可能是由于發酵溫度高，蝦醬中游離脂肪酸的氧化分解速度加快導致[23]。其中含量較高的C14:0、C16:0和C18:2與蝦醬的酸味相關，能夠賦予蝦醬酸味特征[14]；EPA和DHA具有抗腫瘤、抗炎癥的作用[24]，可增加蝦醬的營養價值。

2.3 不同溫度發酵的低鹽蝦醬中揮發性化合物分析

2.3.1 揮發性化合物的差異譜圖分析

為了能夠清晰地看出樣品之間的差異，利用GC-IMS對不同溫度發酵的低鹽蝦醬中揮發性化合物進行分析，結果如圖2所示。二維差異譜圖中每一個點代表一種揮發性化合物，紅色越深濃度越高，藍色反之。

圖2 不同溫度發酵的低鹽蝦醬中揮發性化合物的GC-IMS二維差異譜圖Fig.2 Two-dimensional GC-IMS spectra showing differential volatile compounds in low-salt shrimp pastes fermented at different temperatures

由圖2可知，不同溫度發酵的低鹽蝦醬中揮發性化合物的離子遷移時間基本都集中在1.0～1.5 ms，保留時間集中在300～700 s。以未發酵的蝦醬樣本（0 d）為背景參照時，不同溫度發酵的各組蝦醬樣本譜圖中均呈現大量高于參照樣本的紅色斑點，表明經過發酵，低鹽蝦醬中揮發性化合物種類或含量大幅度增多。并且發酵溫度不同，低鹽蝦醬中揮發性化合物變化也不同。該結果是由于發酵溫度會影響微生物的生長繁殖，從而影響揮發性化合物的生成。

2.3.2 揮發性化合物的定性分析

根據保留指數、保留時間以及離子遷移時間，利用NIST數據庫及IMS數據庫對不同溫度發酵的低鹽蝦醬中揮發性化合物進行定性分析，結果如表3所示，相對含量分布圖如圖3所示。

表3 不同溫度發酵的低鹽蝦醬中揮發性化合物的鑒定Table 3 Identification of volatile compounds in low-salt shrimp pastes fermented at different temperatures

從表3可以看出，不同溫度發酵的低鹽蝦醬中可明確定性的揮發性化合物共有69 種（單體、二聚體及三聚體），包括醇類19 種、醛類13 種、酮類13 種、酯類12 種、烯類2 種、醚類2 種、酸類1 種和其他揮發性化合物7 種。其中醇類最多，醛類、酮類次之，這與Yu Jing等[25]的研究結果相似。

結合表3和圖3可以看出，20 ℃和25 ℃發酵的蝦醬中氨相對含量較高，會為蝦醬帶來刺激性氣味。這可能是由于該溫度發酵會使蛋白質分解過度，生成大量氨物質。因此，其他揮發性化合物分類中由于氨的存在，其相對含量隨著發酵溫度的升高逐漸升高。除此之外，不同溫度發酵的低鹽蝦醬中揮發性化合物相對含量最高的均為醇類。醇類是發酵蝦醬中主要的揮發性化合物[26]，其在15 ℃發酵的蝦醬中相對含量最高，為45%。蝦醬中的不飽和脂肪酸能夠通過氧化降解產生揮發性羰基化合物和醇類物質[27]。20 ℃發酵蝦醬中不飽和脂肪酸含量最高，但醛類和醇類相對含量較低，這可能是因為該溫度發酵的蝦醬中氨的相對含量過高，導致其相對含量降低。其次是酮類，酮類是由不飽和脂肪酸的氧化或氨基酸降解產生，能夠賦予蝦醬花香和果香的氣味[28]。其在未發酵的蝦醬中相對含量最高，為17%。隨著發酵溫度的升高，含量逐漸降低。這可能是由于發酵溫度升高，不利于該物質的積累[29]。

2.3.3 揮發性化合物的指紋圖譜分析

為進一步直觀分析不同溫度發酵的低鹽蝦醬樣本中揮發性化合物的種類及含量差異。利用GalleryPlot插件繪制揮發性成分的指紋圖譜，結果如圖4所示。

圖4 不同溫度發酵的低鹽蝦醬中揮發性化合物指紋圖譜Fig.4 Fingerprint of volatile compounds in low-salt shrimp pastes fermented at different temperatures

由圖4可知，不同發酵溫度的低鹽蝦醬中揮發性化合物存在顯著差異。經過發酵后，蝦醬中的揮發性化合物明顯高于未發酵時的蝦醬（0 d）。

10 ℃發酵的低鹽蝦醬中，3-甲基丁醇、丁酮、丙酮、乙酸異戊酯、2,3-丁二酮等物質含量較高。3-甲基丁醇能夠由纈氨酸和異亮氨酸轉化而成[30]，賦予發酵蝦醬焦糖香味和香油味[8]，2,3-丁二酮是發酵蝦醬中蘑菇香氣的重要來源[2]。15 ℃發酵的蝦醬中，乙醇、乙酸乙酯、α-松油烯、3-羥基-2-丁酮、丁酸丁酯、戊醇等物質含量較高。3-羥基-2-丁酮能夠提供令人愉悅的奶油香味，該物質是傳統蝦醬中典型的特征揮發性化合物[31]，α-松油烯、乙酸乙酯能夠賦予蝦醬水果香氣。20 ℃發酵的蝦醬中，2-甲基戊酸乙酯、3-己烯醇、2,5-二甲基吡嗪、2-甲基丁醛、異戊酸甲酯、氨等物質含量較高。3-己烯醇、異戊酸甲酯可賦予蝦醬水果香氣，2,5-二甲基吡嗪能夠為蝦醬帶來烘培香氣[32]，有研究表明，溫度較高能夠促進美拉德反應產生吡嗪類化合物[33]。25 ℃發酵的蝦醬中，戊醛、2-庚酮、甲基庚烯酮、丙酸異丁酯、苯甲醛以及氨含量較高。戊醛[34]、2-庚酮[25]可賦予蝦醬水果、杏仁和麥芽香氣，甲基庚烯酮、丙酸異丁酯可賦予蝦醬水果香氣和清香香氣，較高濃度的苯甲醛有助于蝦醬有更明顯的堅果和杏仁香氣[35]。但是，20 ℃和25 ℃發酵的蝦醬中氨含量過高，導致整體風味較差。由此可以看出，發酵溫度對低鹽蝦醬中揮發性化合物的種類及含量具有較大影響，該指紋圖譜可實現對不同發酵溫度低鹽蝦醬的特征識別。

2.3.4 揮發性化合物的PCA

PCA能夠根據不同樣本中PC因子的貢獻率評估樣本之間的規律性和差異[36]。為檢測不同溫度發酵的低鹽蝦醬中揮發性化合物的差異，根據揮發性化合物譜圖數據，采用Origin 8.5對其進行PCA，結果如圖5所示。

圖5 不同溫度發酵的低鹽蝦醬中揮發性化合物的PCA圖Fig.5 PCA plot of volatile compounds in low-salt shrimp pastes fermented at different temperatures

從圖5可以看出，PC1和PC2的貢獻率分別為42.5%和32.1%，累計貢獻率為74.6%，可以很好地反映大部分蝦醬樣品中的特征[37]。蝦醬樣品中揮發性化合物在分布圖中有很好的區分，其中不同溫度發酵的低鹽蝦醬樣品中揮發物化合物之間距離較遠，同一溫度發酵的低鹽蝦醬樣品中揮發性化合物聚集在一起，表明不同溫度發酵低鹽蝦醬中揮發性化合物之間存在差異，并且單個樣品的重復性較好。該結果表明通過GC-IMS可以將不同溫度發酵的低鹽蝦醬中揮發性化合物區分開。

2.3.5 揮發性化合物OPLS-DA

為改善PCA方法的不足之處，并且強化組間的差異[38]，根據不同溫度發酵低鹽蝦醬的揮發性化合物譜圖數據，采用SIMCA Version 14.1對揮發性化合物進行OPLS-DA，結果如圖6所示。

圖6 不同溫度發酵的低鹽蝦醬中揮發性化合物的OPLS-DA得分圖（A）和置換檢驗圖（B）Fig.6 OPLS-DA score plot (A) and permutation test (B) of volatile compounds in low-salt shrimp pastes fermented at different temperatures

2.3.6 差異揮發性化合物的篩選與分析

變量投影重要性（variable importance in projection，VIP）能夠篩選出不同溫度發酵低鹽蝦醬中特征揮發性化合物[40]。根據OPLS-DA模型中的VIP值將每個變量對不同溫度發酵低鹽蝦醬中風味的貢獻進行量化[34]，結果如圖7所示。其中VIP值越高，揮發性化合物在不同溫度發酵的低鹽蝦醬中差異越明顯[41]。

圖7 不同溫度發酵的低鹽蝦醬中揮發性化合物的VIP值Fig.7 VIP scores of volatile compounds in low-salt shrimp pastes fermented at different temperatures

由圖7可知，不同溫度發酵的低鹽蝦醬共篩選出12 種特征揮發性化合物（VIP＞1），包括醇類5 種、酯類3 種、酮類2 種以及氨。在發酵過程中醇類和酮類由不飽和脂肪酸的氧化降解、氨基酸降解或微生物氧化產生[42]。其中3-甲基丁醇（單體和二聚體）、乙酸乙酯二聚體、丙烯酸乙酯、2-甲基丁醛二聚體和氨單體6 種特征揮發性化合物的P值小于0.05，可作為不同溫度發酵的低鹽蝦醬中差異揮發性化合物。為了更好地區別它們在不同溫度發酵的低鹽蝦醬中的差異，根據這些物質的峰面積值繪制聚類熱圖，結果如圖8所示。

圖8 不同溫度發酵的低鹽蝦醬中差異揮發性化合物的聚類熱圖Fig.8 Cluster heatmap of differential volatile compounds in low-salt shrimp pastes fermented at different temperatures

由圖8可知，6 種差異揮發性化合物能夠將不同溫度發酵的低鹽蝦醬分為兩類，分別為低溫發酵（10 ℃和15 ℃）和常溫發酵（20 ℃和25 ℃）。在低溫發酵的低鹽蝦醬中，3-甲基丁醇（單體和二聚體）表達呈正相關，2-甲基丁醛二聚體在10 ℃發酵的低鹽蝦醬中表達呈正相關，乙酸乙酯二聚體在15 ℃發酵的低鹽蝦醬中表達呈正相關；在高溫發酵的蝦醬中，氨含量達到最高，這會對蝦醬的風味造成一定的影響。由此可知，低鹽蝦醬中風味物質的形成與發酵溫度密切相關。

3 結論

本研究評估不同發酵溫度對低鹽蝦醬中主要風味物質的影響。結果表明，各組低鹽蝦醬均含有17 種游離氨基酸和26 種游離脂肪酸，其中10 ℃和15 ℃發酵的蝦醬中呈味氨基酸含量高于其他兩組，以甜味及苦味氨基酸為主；20 ℃發酵的蝦醬中游離脂肪酸含量最高。低鹽蝦醬中鑒別出69 種揮發性化合物，包括醇類19 種、醛類13 種、酮類13 種、酯類12 種、烯類2 種、醚類2 種、酸類1 種和其他化合物7 種。10 ℃發酵的低鹽蝦醬中，3-甲基丁醇、丁酮、丙酮、乙酸異戊酯、2,3-丁二酮等含量較高。15 ℃發酵的蝦醬中，乙醇、乙酸乙酯、α-松油烯、3-羥基-2-丁酮、丁酸丁酯、戊醇等含量較高。20 ℃發酵的蝦醬中，2-甲基戊酸乙酯、3-己烯醇、2,5-二甲基吡嗪、2-甲基丁醛、異戊酸甲酯、氨等含量較高。25 ℃發酵的蝦醬中，戊醛、2-庚酮、甲基庚烯酮、丙酸異丁酯、苯甲醛以及氨等含量較高。20 ℃和25 ℃發酵的低鹽蝦醬中氨含量較高，導致其風味較差。篩選出6 種差異揮發性化合物，分別為3-甲基丁醇（單體和二聚體）、乙酸乙酯二聚體、丙烯酸乙酯、2-甲基丁醛二聚體和氨單體。6 種差異揮發性化合物能夠將不同溫度發酵的低鹽蝦醬分為兩類，分別為低溫發酵（10 ℃和15 ℃）和常溫發酵（20 ℃和25 ℃）。本研究結果能夠為推進商品化低鹽蝦醬的恒溫發酵提供理論參考。