多組學技術融合電子感官的咖啡風味品質分析

李鈺蓮，鄭建祎，黃旭輝，董秀萍，趙保民，秦 磊,*

（1.大連工業大學食品學院，國家海洋食品工程技術研究中心，遼寧 大連 116034；2.江蘇派樂滋食品有限公司，江蘇 徐州 221112）

咖啡豆是茜草科咖啡屬植物的種子[1]，原產地為埃塞俄比亞，經處理后能制成世界三大無酒精的飲品之一——咖啡[2]。咖啡含有多種生物活性成分，具有提神醒腦、抗氧化等作用[3]。隨著國民生活水平的提升，咖啡文化日漸興起，促進了咖啡消費[4]，使中國咖啡市場處于高速發展階段，預計行業保持27.2%的增長率上升，2025年中國咖啡市場規模將達10000億 元[5]。

咖啡獨特的醇香口感、色澤和風味是由生豆烘焙后發生美拉德、焦糖化等化學反應形成的[6]。Hartman將“風味”定義為把食物放在口腔中及咀嚼時所產生的嗅覺（香味）和味覺（滋味）的一種整體感覺[7]。之前對咖啡風味的評價以感官評定為主，但由于主觀因素、不可重復性等缺點，并不能客觀有效地進行評價[8]。而電子鼻、電子舌系統能夠分別從香味及滋味兩個不同的角度對風味輪廓進行快速檢測。董文江等[9]利用電子鼻和電子舌技術評價不同干燥溫度下烘焙咖啡豆氣味和滋味的差異性，發現二者均能夠有效區分日曬干燥及不同熱泵干燥溫度處理所得的烘焙咖啡豆。

咖啡風味受品種、烘焙條件等因素影響，主要由揮發性風味成分和非揮發性呈味成分兩部分組成[10]。風味組學通過分析樣品中的揮發性物質，全面反映風味整體變化，采用多元統計分析篩選關鍵風味標記物[11]。陸羽霜等[12]利用固相微萃取-氣相色譜-質譜（solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，SPME-GC-MS）聯用技術在不同烘焙度的咖啡萃取液中共鑒定出74 種揮發性物質，并分別得到對各類香氣貢獻率最大的物質。而對于咖啡中非揮發性呈味組分如多糖、生物堿類[10]的研究相對較少。超高效液相色譜（ultra-high performance liquid chromatography，UPLC）與Q-Exactive HF-X質譜儀聯用具有極高的靈敏度、分辨率和質量精度[13]，能夠有效用于咖啡中非揮發性呈味組分及其揮發性香味組分前體物質的檢測分析[14]。代謝組學檢測到的化合物數量巨大，而風味組學則與消費者的喜好進行對接[15]。咖啡中大量的代謝組分，與風味組學方法相結合可挖掘與咖啡風味品質相關的化合物，進而得到其標志物。

本研究以6 種不同烘焙度及咖啡豆配比的咖啡產品作為研究對象，通過SPME-GC-MS分析揮發性組分，通過UPLC-MS/MS檢測代謝小分子，輔以電子鼻及電子舌的電子感官技術相結合探明不同樣品香味和滋味的差異性，對咖啡風味品質進行綜合性評價，篩選出不同類型咖啡的標志物，為工業化生產的品質控制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

不同烘焙度及不同產地咖啡豆配比的速溶咖啡由江蘇派樂滋食品有限公司提供。6 種咖啡均采用0～4 ℃加壓冷萃取，并用-50 ℃極速凍干得到凍干咖啡粉，以K1～K6代稱：K1為淺度烘焙（30%），咖啡配比為埃塞俄比亞西達摩60%和云南特高海拔精品咖啡40%；K2為淺度烘焙（40%），咖啡配比為埃塞俄比亞西達摩60%和云南特高海拔精品咖啡40%；K3為中度烘焙，咖啡配比為埃塞俄比亞西達摩60%和云南特高海拔精品咖啡40%；K4為中深度烘焙，咖啡配比為埃塞俄比亞西達摩60%和云南特高海拔精品咖啡40%；K5為中深度烘焙，咖啡配比為埃塞俄比亞西達摩30%，云南特高海拔精品咖啡30%以及埃塞俄比亞吉瑪40%；K6為中度烘焙，咖啡配比為埃塞俄比亞吉瑪70%和耶加雪啡30%。

纈氨酸-酪氨酸-纈氨酸、D3-N-甲基-乙酰左旋肉堿、D3-DL-丙氨酸、CUDA 美國Sigma-Aldrich公司；D9-咖啡因、D3-甲基煙酰胺（標準品）加拿大TRC公司；D9-氧化三甲胺、D3-DL-天冬氨酸 加拿大CDN isotopes公司；D3-DL-谷氨酸（同位素標準品）美國劍橋CIL公司。所有標準品的純度均大于98.5%。

1.2 儀器與設備

7890B/7010B GC-MS儀 安捷倫科技（中國）有限公司；Q-Exactive-HF-X UPLC-MS/MS 賽默飛世爾科技（中國）有限公司；CF16RXII高速冷凍離心機 日本日立公司；DN-12A氮氣吹干儀 天津市樂康科技有限公司；PEN3型電子鼻 德國Airsense公司。

1.3 方法

1.3.1 電子鼻檢測

分別取6 種速溶咖啡粉各1.5 g于20 mL頂空瓶，加入5 mL純凈水，混勻，60 ℃孵育15 min，進行電子鼻檢測。響應數據由1 s的間距得到，測量持續時間為100 s，空氣空白持續時間60 s。實驗采用電子鼻進行咖啡樣品檢測。電子鼻設備共有10 個傳感器，各傳感器的功能特性是對特定物質種類選擇性靈敏，其對應如下：W1C苯類芳香成分；W5S氮氧化合物；W3C氨類芳香成分；W6S氫化物；W5C短鏈烷烴；W1S甲基類；W1W無機硫化物；W2S醇、醛及酮類；W2W有機硫化物芳香成分；W3S長鏈烷烴。

1.3.2 電子舌檢測

分別取6 種速溶咖啡粉各1.4 g，加入300 mL常溫純凈水，渦旋至完全溶解，5000 r/min離心10 min取上清液，過濾。濾液倒入樣品杯，每杯容量約為40 mL。樣品測試進行4 次循環。

1.3.3 風味組學檢測

分別取6 種速溶咖啡粉各1.5 g于20 mL頂空瓶。SPME條件：采用50/30 μm DVB/Car/PDMS萃取纖維，60 ℃孵育20 min，萃取40 min后進行GC-MS分析[16]。

色譜條件：毛細管色譜柱型號為H P-5 m s（30 m×250 μm，0.25 μm）。升溫程序：起始溫度45 ℃維持3 min，以5 ℃/min的升溫速度升溫至250 ℃，維持10 min；進樣口溫度為250 ℃；載氣流量為1 mL/min。

質譜條件：使用電子電離源，Scan掃描模式，質量掃描范圍m/z40～400，電子能量70 eV，溶劑延遲設定為5 min。

1.3.4 代謝組學檢測

分別稱取6 種速溶咖啡粉各0.4 g，加入10 mL純凈水，渦旋30 s。冰溫下取250 μL混合液于1.5 mL離心管中，加入750 μL混合溶液（甲醇∶異丙醇=1∶1，V/V），渦旋30 s，4 ℃靜置30 min，20000×g離心10 min。取20 μL上清液濃縮離心至干燥。以纈氨酸-酪氨酸-纈氨酸、D3-N-甲基-乙酰左旋肉堿、D3-DL-丙氨酸、CUDA、D9-咖啡因、D3-甲基煙酰胺、D9-氧化三甲胺、D3-DL-天冬氨酸、D3-DL-谷氨酸標準品作為內標，甲醇和乙腈作為溶劑，配制復溶溶液，每個樣品用100 μL復溶液進行復溶，渦旋10 s，20000×g離心10 min，取上清液進行測定[17]。3 次平行。

色譜條件：Waters ACQUITY UPLC BEH Amide色譜柱（2.1×150 mm，1.7 μm）。柱溫45 ℃。流動相A為水，流動相B為體積分數95%乙腈溶液，均含有0.125%甲酸和10 mmol/L甲酸銨。洗脫梯度如下：0.00～2.00 min，0% A，100% B；2.00～7.70 min，0%～30% A，100%～70% B；7.70～9.50 min，30%～60% A，70%～40% B；9.50～10.25 min，60%～70% A，40%～30% B；10.25～12.75 min，70%～0% A，30%～100% B；12.75～17.00 min，0% A，100% B。進樣量為1 μL，流速為0.4 mL/min。

質譜條件：采用電噴霧電離源，以正離子模式進行檢測，其采集范圍m/z60～900。鞘氣流量為60%，輔助氣流量為25%，吹掃氣流量為2%。噴霧電壓為3.6 kV，毛細管溫度為380 ℃，輔助氣體加熱器溫度為370 ℃。

1.4 數據處理

揮發性成分定性分析是通過NIST 14譜庫檢索比對，用歸一法計算各化學成分的相對含量。數據使用Excel 2017計算、繪制雷達圖。使用MS-DIAL 3.96整理、篩選UPLC與質譜聯用的數據[18]。利用MetaboAnalyst 4.0進行主成分分析（principal component analysis，PCA）、偏最小二乘判別分析（partial least squares-discriminant analysis，PLS-DA）和熱圖分析。相關性分析繪圖在https://www.omicstudio.cn.完成，選用Duncan進行顯著性方差分析；Spearman相關性分析各指標間關聯性。

2 結果與分析

2.1 不同咖啡的氣味輪廓分析

利用電子鼻對不同烘焙程度以及不同產地咖啡的風味輪廓進行快速檢測分析，圖1A結果表明，傳感器W5S、W1W、W2W的響應值較大，這3 種傳感器分別對氮氧化合物、有機硫化物和無機硫化物反應靈敏。各樣品在W1W、W2W傳感器響應值的差異更大，表明二者對咖啡揮發性氣味的區分效果更好。6 種樣品的雷達圖輪廓相似，為分辨不同樣品是否存在差異性，利用PCA模型降維后進一步分析，不同咖啡樣品能夠得到初步區分。叢莎等[19]利用電子鼻PCA將不同貯藏階段的咖啡豆在二維得分投影圖上區分開，各自聚為一類。如圖1B所示，6 個樣品分為3 組，各組整體輪廓較為接近。K1～K4樣品具有相同的咖啡配比，烘焙程度依次增加。K1與K2咖啡輪廓相交，說明淺度烘焙樣品之間相似，與中度、中深度烘焙樣品的差異較大。電子鼻可以區分不同烘焙程度的咖啡。如圖1C所示，對氮氧化合物敏感的傳感器W5S與淺度烘焙的樣品呈正相關性。K3與K6咖啡同為中度烘焙；K4與K5咖啡同為中深度烘焙，然而K4與K6咖啡由于甲基類物質的含量相似使二者輪廓有所重疊，同時K3與K5咖啡在硫化物成分含量的影響下輪廓相似。這說明不同種咖啡的調配會影響烘焙程度感觀的差異，使中度烘焙的咖啡具有與中深度烘焙類似的感官，反之亦然。

圖1 不同咖啡的電子鼻傳感器響應值分析Fig.1 Analysis of electronic nose responses to different coffees

2.2 不同咖啡的滋味輪廓分析

利用電子舌快速分析滋味輪廓，如圖2A所示。6 種樣品的雷達圖輪廓類似，只有酸味傳感器的響應值為負，說明酸味對咖啡整體滋味的貢獻較小。各樣品在鮮味與咸味傳感器上的響應值差異最大，表明這兩種傳感器對滋味特征的區分效果最好[20]。為根據滋味特征進一步區分6 種咖啡，對電子舌傳感器響應值結果進行PCA（圖2B）。6 種咖啡輪廓未重疊，滋味特征明顯，易被區分。K3、K5和K6咖啡在PC1的正方向，主要受鮮味、咸味、厚味影響；K1、K2和K4咖啡在PC1的負方向，主要由澀味、酸味、苦味影響（圖2C）。每個樣品聚類的距離與滋味特征接近度相關，有相同咖啡配比的K1～K4樣品，烘焙程度不同，距離較遠，說明電子舌可以區分不同烘焙度的咖啡。K5、K6咖啡分別與K1、K3咖啡輪廓接近，說明不同的咖啡配比在一定程度上能夠彌補烘焙程度的差異，使不同烘焙度的咖啡具有類似的滋味輪廓。

圖2 不同咖啡的電子舌傳感器響應值分析Fig.2 Analysis of electronic tongue responses to different coffees

2.3 不同咖啡的揮發性化合物分析

咖啡中各揮發性成分的產生機理相同，即通過美拉德反應、斯特萊克降解和脂質氧化等過程形成，可賦予咖啡不同的香氣。6 種咖啡樣品的66 種揮發性成分如表1所示。K1～K4咖啡隨著烘焙程度增加，揮發性化合物種類增多。這是由于輕度烘焙的熱加工時間較短，則各類反應持續的時間較短，所以產生的化合物較少。含硫化合物是咖啡中常見的揮發性組分[21]，電子鼻中對硫化物靈敏的傳感器響應值較高，但氣質結果中并未檢出硫化物，可能是其種類多而各個化合物的含量較低導致。K5、K6咖啡的埃塞爾比亞咖啡豆配比更高，可能是導致其揮發性物質種類較少的原因。K1～K4咖啡的呋喃類物質含量均隨烘焙程度的增加呈先上升后下降的趨勢，這與Moon[22]和Hashim[23]等研究的結果一致。呋喃類產生于糖類物質的熱分解，具有令人愉悅的烘焙香氣[24]。烷基吡嗪主要由含羥基的氨基酸，如絲氨酸和蘇氨酸受熱分解形成[10]，表現為燒烤味和泥土味。二甲基吡嗪被描述為堅果味、可可味，而三甲基吡嗪則帶來烘烤味或泥土味。吡嗪類物質隨烘焙程度的增加而減少，可能是因為六元環受熱斷裂加劇，生成烯烴類進一步揮發[25]。為進一步探究揮發性成分的差異，進行PLS-DA，尋找導致組間區別的影響變量[26]。由圖3A可知，各樣品間輪廓沒有重疊，K1～K4咖啡隨著烘焙程度的增加，由PC1的負半軸遷移至正半軸；與其產地、混合配比不同的K5與K6咖啡十分接近，但仍不重疊。顯然利用GC-MS檢測得到的揮發性成分進行不同咖啡的鑒別與區分的效果優于電子鼻。如圖3B所示，影響淺度烘焙咖啡香氣的化合物有2-乙基-3,5-二甲基吡嗪、2-己酮、2-乙基-1-己醇等。影響中度烘焙咖啡香氣的化合物有丙酮、戊酸甲酯、4-吡啶醇等。影響中深度烘焙咖啡香氣的化合物有愈創木酚、2,6-二甲基吡嗪、苯甲醛等。聚類熱圖結果與得分圖結果一致。K1咖啡的特異性化合物主要是酮類和酸類，如2-己酮和異戊酸，使其有酸味和醚味。K2咖啡的特異性化合物包括十九烷、4-乙基-5-甲基壬烷等烷烴類。K3咖啡的特異性物質有戊酸甲酯，為其增添水果味。K4咖啡獨特的木質香、堅果香及花香分別由酚類、吡嗪類和醇類帶來，例如丁香酚、2,6-二甲基吡嗪、2-乙基-1-己醇。

2.4 不同咖啡的代謝小分子分析

如圖4A所示，6 種咖啡中共檢測出388 種代謝小分子，其中有機酸及其衍生物92 種、核苷及類似物8 種、脂質和類脂分子26 種和生物堿及其衍生物8 種。從中篩選出28 種直接與滋味相關的化合物見圖4B。糖類化合物能降低咖啡的苦澀，有助于保留咖啡的揮發性風味組分，增加咖啡的黏度[27]。淺度烘焙的咖啡含有較多的木糖、甘露醇三糖和蜜二糖。麥芽三糖在中度烘焙咖啡中的含量較高。埃塞俄比亞地區豆種配比較云南地區豆種配比更高的混合咖啡樣品含有更多的新橙皮糖和蔗糖。氨基酸類物質通過斯特克降解反應生成醛酮類，形成特有的香氣和滋味[28]。淺度烘焙的咖啡中呈甜味的丙氨酸、脯氨酸與呈苦味的異亮氨酸、苯丙氨酸的含量較高。賴氨酸在各樣品中含量相似。色氨酸、精氨酸與酪氨酸在埃塞俄比亞豆種配比較多的咖啡樣品中含量較高。生物堿是咖啡中的主要苦味物質，在埃塞俄比亞咖啡豆配比更高的咖啡中含量更高。中度烘焙的咖啡中肌苷含量較少。

圖4 不同咖啡中代謝小分子分析Fig.4 Analysis of small metabolites in different coffees

通過PLS-DA對不同咖啡代謝小分子的關系進行綜合分析。由圖4C可知，K1、K2是淺度烘焙咖啡，在PC1的負半軸，中度、中深度烘焙咖啡在PC1的正半軸、原點附近，可以明顯區分。由圖4D可知，L-酪氨酸乙酯、色氨酸-丙氨酸、纈氨酸-天冬酰胺等12 種氨基酸及肽類似物，巴豆酸、戟葉馬鞭草苷等5 種脂類，鳥嘌呤、1-甲基腺苷等48 個化合物是引起各樣品差異的主要差異代謝物（變量投影重要性（variable importance in projection，VIP）＞1.5）。區分6 種不同咖啡的烘焙度及產地，可直接選用部分呈滋味化合物，如胞嘧啶核苷、賴氨酸、新橙皮糖等，但更多的是與咖啡的非呈滋味代謝物有關。有研究通過超高效液相色譜串聯質譜進行代謝組學分析得到36 種云南小粒咖啡與埃塞俄比亞咖啡的潛在標志物，包括多酚16 種、脂質類8 種、糖類6 種以及少量生物堿類、有機酸類、萜類[29]。

2.5 香味與滋味的相關性分析

為探究咖啡中電子鼻傳感器、電子舌傳感器與揮發性香氣物質、非揮發性滋味物質之間的關系，采用Spearman相關性分析。如圖5A所示，明顯分為2 組，對短鏈烷烴、氫化物、苯類、氨類敏感的傳感器與厚味、咸味和鮮味傳感器存在正相關性，其余傳感器與酸味、苦味和澀味傳感器呈正相關。不同產地的咖啡本身代謝成分不同，代謝中間產物可能是氣味前體成分，所以特征香氣成分與代謝成分直接相關。將篩選出的呈滋味代謝物與揮發性香氣組分進行相關性分析，如圖5B所示，從代謝物角度來看，可以分為3 組，其中一組大多數是呈苦味物質如腺苷、可可堿和肌苷，與乙酰丙酮、2-呋喃甲醇和5-甲基糠醛等呈強烈的正相關。另一組大部分是呈甜味物質如1,4-D-木糖、脯氨酸和丙氨酸，與5-羥甲基糠醛和4-乙基-2-甲氧基苯酚等存在強烈相關性。從揮發性化合物角度來看，與呈滋味代謝物存在強烈相關性的物質大多是呋喃、酚類與吡嗪類。可能原因是加工過程中脂質氧化、美拉德反應等反應并存，且不同階段對揮發性成分的貢獻占比不同，占比大的反應涉及到的物質之間相關性可能會顯著[30]。

電子鼻與電子舌作為新興電子感官分析技術，相對于感官評定員的分析有速度快、檢測結果穩定等優點，可以輕松完成原本需要大量實驗才能完成的檢測[31]。滋味變化與香味變化存在直接相關性，因此電子鼻和電子舌的聯用可以在風味解析預測、風味快速檢測、真偽鑒別及產地識別等方面應用。

3 結論

本研究全面分析了6 種不同咖啡的風味品質差異。電子感官數據經PC降維可用作咖啡工藝的相似性分類分析。影響淺度、中度、中深度烘焙咖啡的揮發性化合物分別為酚類、吡嗪類和醇類，酮類和酸類，烷烴類和酯類。L-酪氨酸乙酯、纈氨酸-天冬酰胺和巴豆酸等可作為區分不同產地咖啡粉及其混合樣本的差異代謝物。淺度烘焙的咖啡含有較多木糖、甘露醇三糖和蜜二糖。麥芽三糖在中度烘焙咖啡中的含量較高。蔗糖、精氨酸等在埃塞俄比亞地區豆種配比更高的咖啡樣品中含量更高。5-羥甲基糠醛、愈創木酚、2-呋喃甲醇等特征香氣成分與呈滋味的代謝成分如蔗糖、可可堿、L-酪氨酸強烈相關。本研究結果可從香味和滋味角度為咖啡的科學研究提供數據支撐，有助于更好地鑒定識別咖啡種類，為咖啡的工業化生產品質控制提供潛在標志物，為咖啡風味品質標準化評價的建立奠定基礎。