基于UPLC-MS/MS的毛竹筍不同生長階段差異代謝物分析

郭明陽，賀曰林，潘凱婷，鮑方艷，應葉青

（浙江農林大學 省部共建亞熱帶森林培育國家重點實驗室，浙江 杭州 311300）

毛竹（Phyllostachys edulis）是我國分布范圍最廣、面積最大的經濟竹種[1]，具有生長迅速且環境適應力強的特點。毛竹筍是我國傳統的“森林蔬菜”之一[2]，其味道鮮美，富含蛋白質、氨基酸、膳食纖維、多糖等多種營養物質以及微量元素[3]，并且具有抗氧化、抗炎癥、降壓等多種功能，是一種天然的保健品。

果蔬的生長發育是一個復雜的代謝過程，代謝產物的動態變化與果蔬品質變化密切相關。代謝組學是一種能夠對樣本中所有內源性小分子代謝物進行識別和量化的分析方法[4]，在許多果蔬中已被廣泛應用。例如在百香果[5]中證實了脂類、有機酸和酚酸含量的顯著減少和糖醇的積累與果實口感和香氣變化密切相關；在棗果皮[6]中揭示了其顏色變化不同時期黃酮化合物的富集情況；在獼猴桃中識別了不同發育階段5 種營養代謝物水平的動態變化。而在竹筍中，通過代謝組學手段確定了竹筍的苦味主要由L-苯丙氨酸、尿苷、L-丙氨酸、L-色氨酸、腺嘌呤等組成[7]，還對竹筍采后低溫環境下的木質化網絡進行了研究[8]。

毛竹筍的生長速度極快，在條件適宜的春季，甚至一天能生長1 m，因此筍生長過程中營養物質會發生劇烈變化。Song Xinzhang等[9]研究表明在毛竹筍快速生長期，母竹可以為竹筍提供大量的碳水化合物。Wang Shuguang等[10]發現竹筍出土時筍中的淀粉和蔗糖會分解為單糖，用于竹筍生長。李紫陽等[11]證明隨著毛竹筍高度增加，木質化程度和木質素含量顯著增加。然而對于竹筍不同出土高度的代謝物變化情況尚不明晰。因此本研究基于廣泛靶向代謝組學方法對3 個不同生長階段的毛竹筍進行分析，同時與基本營養指標測定結果相結合，闡明毛竹筍差異代謝物的動態變化情況，旨在為毛竹筍的營養價值研究以及毛竹資源的開發與科學利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

毛竹筍樣品采集于浙江省杭州市臨安區毛竹示范培育基地（30°13’54”N；119°48’2”E），為比較毛竹筍生長不同時期的代謝產物變化，采集5、20、40 cm出土高度的竹筍，根據竹筍的生物學特性，劃分為竹筍生長的3 個不同時期，5 cm代表破土期、20 cm代表生長期、40 cm代表快速生長期，并將其編號為S1、S2、S3，各時期毛竹筍生長情況如圖1所示。每個時期樣本采集3 個生物學重復（每個重復3 顆筍），竹筍剝去筍殼切去基部不可食用部分后，采集竹筍中部，然后立即于液氮中冷凍，并在-80 ℃冰箱中貯藏。

圖1 毛竹筍不同時期生長情況Fig.1 Photographs of P. edulis shoots at different growth periods

甲醇、乙腈（均為色譜純）德國Merck公司；標準品（色譜純）美國Sigma-Aldrich公司。

1.2 儀器與設備

Nexera X2超高效液相色譜（ultra-high performance liquid chromatography，UPLC）儀 島津（中國）有限公司；4500 QTRAP串聯質譜（tandemmass spectrometry，MS/MS）儀 美國Applied Biosystems公司；Scientz-100F普通型冷凍干燥機 寧波新芝生物科技股份有限公司；MM 400研磨儀 德國Retsch公司；CR-10 plus型色差儀 日本Konica Minolta公司；TA.XT plusC質構分析儀 英國Stable Micro Systems公司。

1.3 方法

1.3.1 生理指標測定

色度使用色差儀進行測定[12]；硬度使用質構分析儀進行測定[13]；可溶性糖、淀粉和纖維素含量采用蒽酮比色法進行測定[14]；游離氨基酸含量采用茚三酮顯色法測定[15]；總酚含量采用福林-酚比色法進行測定[16]；黃酮含量采用亞硝酸鈉-硝酸鋁顯色法進行測定[17]；全氮采用凱氏定氮法進行測定[15]；VC含量采用紅菲咯啉比色法測定[18]；可溶性蛋白質含量采用考馬斯亮藍G-250染色法測定[15]；木質素含量采用乙酰化法進行測定[19]；總灰分按照GB 5009.4—2016《食品中灰分的測定》進行測定；粗脂肪含量采用GB 5009.6—2016《食品中脂肪的測定》中的酸水解法進行測定。

1.3.2 樣品的提取

將竹筍樣品放置于凍干機中真空冷凍干燥，用研磨儀在30 Hz條件下研磨至呈粉末狀；精確稱取100 mg研磨后的粉末，將其溶解于1.2 mL 70%甲醇溶液中，在4 ℃條件下過夜；將溶解后的溶液每30 min渦旋1 次，每次持續30 s，共渦旋6 次；然后12000 r/min離心10 min，在UPLCMS/MS分析前，上清液采用0.22 μm微孔濾膜過濾。

1.3.3 基于UPLC-MS/MS系統的廣泛靶向代謝組學分析

樣品提取物分析使用UPLC-MS/MS系統。UPLC分析條件：色譜柱Agilent SB-C18（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；流動相A為超純水（0.1%甲酸），流動相B為乙腈（0.1%甲酸）；洗脫梯度：0.00 min，95% A，5% B；0.00～9.00 min，95%～5% A，5%～95 % B；9.00～10.00 min，5% A，95 % B；10.00～11.10 min，5%～95 % A，95%～5% B；11.10～14.00 min，95% A，5% B。將后續流出物連接到三重四極桿線性離子阱質譜儀上。質譜條件：電噴霧電離源，溫度550 ℃；離子噴霧電壓5500 V（正離子模式）/-4500 V（負離子模式）；離子源氣體I、氣體II和氣簾氣分別設置為50、60 psi和25.0 psi，碰撞誘導電離參數設置為高。通過進一步去簇電壓（declustering potential，DP）和碰撞能（collision energy，CE）優化，完成各個多反應監測離子對的DP和CE。

1.4 數據分析

生理指標測定中單個因素重復測定3 次，利用IBM SPSS Statistics 25.0進行單因素方差分析，并采用隸屬函數法對毛竹筍各生長階段的營養指標進行綜合評價，其公式為：

式中：Xij為i階段j成分的測量值；Xjmin為所有階段j成分的最小值；Xjmax為所有階段j成分的最大值；i為某個生長時期；j為某項指標。

廣泛靶向代謝組學數據利用邁維（武漢）生物技術有限公司自建MWDB數據庫、MultiaQuant軟件以及Analyst 1.6.3軟件進行代謝物定性定量分析。結合主成分分析（principal component analysis，PCA）、正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA）以及聚類分析對代謝組學數據完成多角度分析。基于OPLS-DA結果，將獲得的多變量分析OPLS-DA模型的變量重要性投影（variable importance in projection，VIP）與單變量分析的差異倍數（fold change，FC）結合，篩選出不同生長階段差異的代謝物。熱圖采用邁維云平臺繪制。

2 結果與分析

2.1 毛竹筍不同生長階段的形態及營養成分變化

如圖2所示，S1期竹筍整體呈乳白色，到S3期變為黃綠色。色度值也印證了這一點（表1），S1到S3總色差顯著增加，亮度值無顯著差異，黃度值顯著增加。竹筍硬度隨竹筍高度的增加也呈顯著上升的趨勢。

表1 毛竹筍不同生長階段形態與營養指標Table 1 Changes in hardness,color and nutritional indexes of P. edulis shoots at different growth stages

圖2 不同生長階段毛竹筍表觀形態變化Fig.2 Changes in visual appearance of P. edulis shoots at different growth stages

糖類可以直接為人體提供能量，總糖是影響竹筍風味的因素之一[20-21]。如表1所示，毛竹筍中可溶性總糖含量隨生長高度的增加呈下降趨勢，由S1期的5.88 mg/g下降到S3期3.88 mg/g。與此同時，淀粉和纖維素的含量隨生長高度增加而上升，在S3期含量達到最高。筍是人類潛在的蛋白質來源，在毛竹筍S3階段，筍體內可溶性蛋白含量顯著下降，全氮含量也呈相同的趨勢。筍中蛋白質的消耗速率增加會導致其存儲的蛋白質大量減少，因此可溶性蛋白和全氮含量的下降可能與S3期竹筍生長速率加快密切相關。游離氨基酸含量在毛竹筍的S2～S3階段顯著下降，氨基酸也是筍品質的重要評價指標[22]。此外，灰分與粗脂肪含量隨生長高度的增加含量上升，S3期灰分質量分數達到了9.52%，粗脂肪含量達到4.50%。

如表1所示，隨生長高度增加，毛竹筍中總酚含量在生長期S2達到最高，在S3期顯著下降到5.87 mg/g。總黃酮和VC含量在S1到S2期間顯著下降，S3期含量基本不變。此外，竹筍中的木質素含量由S1期的6.33%迅速上升，到S3含量達到9.27%，竹筍中木質素含量的增加會導致口感品質的下降。

2.2 竹筍不同生長階段營養品質綜合評價

如表2所示，破土期、生長期與快速生長期平均隸屬函數值分別為0.75、0.45和0.15，隸屬函數值越大，代表綜合品質越好，說明毛竹筍破土期具有較好的營養和風味品質。

表2 主要營養品質指標的隸屬函數值Table 2 Membership function values of major nutritional quality indexes

2.3 毛竹筍不同生長階段代謝物總體分析

通過UPLC-MS/MS手段對毛竹筍3 個階段的代謝產物進行鑒定，共鑒定出765 個化合物。這些代謝物被分為13 類（圖3）。檢測到的所有代謝產物中，脂類化合物數量最多（19.3%），其次是酚酸類（18.8%）、氨基酸及其衍生物（12.4%）、生物堿（9.3%）、有機酸（9.2%）、糖及醇類（7.8%）、核苷酸及其衍生物（7.1%）、黃酮（5.5%）、木脂素和香豆素（2.5%）、維生素（2.5%）、萜類（2.2%）和醌類（0.4%）。

圖3 毛竹筍所有代謝產物的分類Fig.3 Classification of all metabolites of P. edulis shoots

為確定不同生長階段竹筍的總體代謝差異和組內樣本之間的變異度大小，對9 個樣品（3×3 個生物重復）進行PCA和相關性分析。PCA結果表明（圖4），PC1可以解釋不同生長階段的總方差和分離樣本的32.9%，PC2能解釋總方差的15.7%，說明在毛竹筍生長的不同階段，代謝產物的積累模式存在較大差異。通過相關性分析（圖5）發現竹筍各重復間的相關均大于0.92。上述結果表明，不同生長階段組內有較好的重復性，所獲得的代謝組數據可靠。

圖4 毛竹筍不同生長階段代謝組樣品間PCAFig.4 PCA plot of metabolome samples in P. edulis shoots at different growth stages

圖5 毛竹筍不同生長階段代謝組樣品間相關性分析Fig.5 Correlation analysis among metabolome samples of P. edulis shoots at different growth stages

2.4 毛竹筍不同生長階段差異累積代謝物分析

為了進一步了解竹筍生長不同階段（S1 vs S2，S2 vs S3）之間的代謝差異，對差異累積代謝物（differentially accumulated metabolites，DAMs）進行分析，在篩選條件FC≥2或FC≤0.5且VIP＞1下，共篩選到203 個DAMs，每組的DAMs數量如圖6所示。S1與S2共鑒定到90 個DAMs，其中有51 個呈上調趨勢，39 個呈下調趨勢。在S2與S3中共鑒定到63 個DAMs，其中23 個呈上調表達，40 個呈下調表達。

圖6 不同對比下DAMs的統計Fig.6 Statistics of DAMs under different contrasts

進一步通過聚類分析對發育過程中代謝組的動態變化進行概述。對203 個差異代謝物進行評估后識別出了9 種表達模式Sub Class 1～9（圖7）。其中占比最高的Cluster 5（占總體22%）隨生長階段變化不斷積累，在竹筍快速生長期含量顯著增加，主要是酚酸類（44%）和脂質（16%）表現出這種聚類；第2大類群Cluster 9，包括38 種代謝物，在S2～S3階段含量顯著積累，主要是脂質（32%）、酚酸（16%）、有機酸（13%）和氨基酸及其衍生物（11%）。此外，Cluster 6和7主要包含黃酮、脂質和部分氨基酸，在竹筍生長過程中呈現下降趨勢，只在S1期顯著富集。

圖7 DAMs表達模式熱圖（A）和K-means圖（B）Fig.7 Heatmap (A) and K-means plots (B) of DAM expression patterns

為了更直觀展示代謝物的總體差異情況，通過FC值計算，繪制代謝物含量差異動態分布圖，標注其中上調和下調前10 個代謝物。如圖8所示，隨著竹筍生長，S2相比S1階段顯著上調物質有S-烯丙基-L-半胱氨酸、L-酪胺、松香酸和苯基乙醇胺以及多個酚酸類物質，下調的物質有12-羥基氫化松香酸甲酯、褪黑激素、新綠原酸和多個黃酮類物質如槲皮素-3-O-蕓香糖苷（蘆丁）、槲皮素-7-O-蕓香糖苷等。而在S2生長到S3過程中，芹菜素、肉桂酸和9-(阿拉伯糖基)次黃嘌呤等含量顯著增加，色胺、順-N-阿魏羥色胺、1-氨基環丙烷-1-羧酸、甘磷酸膽堿GPC等顯著下降。可以看到顯著變化的差異代謝物中，上調類物質以酚酸為主，下調類物質S1 vs S2以黃酮為主，S2 vs S3以生物堿為主，其中也有多個氨基酸和脂質類物質發生變化。結合聚類分析結果，發現毛竹筍生長動態變化的差異代謝物主要集中在脂質類、氨基酸類、有機酸類、酚酸類以及黃酮和生物堿類化合物。

圖8 不同生長時期代謝物含量差異動態分布Fig.8 Dynamic distribution of differences in metabolite contents at different growth stages

2.4.1 脂質類化合物

脂質是人體重要的營養素之一，能夠供給機體所需的能量和脂肪酸[23]。脂質還是酯類化合物合成的前體代謝物，竹筍中已有研究表明酯類是主要的風味物質之一[24]。毛竹筍中共檢測到37 個差異累積脂質（圖9），其中多數脂質隨生長高度的增加相對含量呈上升趨勢，其中以溶血磷脂酰乙醇胺類表現的最為顯著，這類物質與促進果實成熟、提高果實品質穩定性及延緩植物組織衰老密切相關[25-26]。但也有例外，甘油酯類、甘磷酸膽堿GPC以及部分游離脂肪酸均在竹筍S1階段顯著富集，在S2～S3階段顯著下降（圖8、9）。其中甘磷酸膽堿GPC是一種水溶性磷脂代謝產物，具有降脂健腦等多種功效[27]。

圖9 差異累積脂質在竹筍生長中的變化情況Fig.9 Variation of differentially accumulated lipids during bamboo shoot growth

2.4.2 氨基酸及其衍生物

竹筍中氨基酸含量豐富，能夠提供人體所需的17 種氨基酸[22,28-29]。通過靶向代謝組測定，發現毛竹筍中有22 種氨基酸及其衍生物在不同生長階段出現顯著差異（圖10）。不同階段差異顯著氨基酸包含L-纈氨酸、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-高甲硫氨酸和L-精氨酸，其中L-天冬氨酸、L-纈氨酸與L-精氨酸在S1期顯著富集，L-谷氨酸與L-高甲硫氨酸在S2具有較高的表達水平。而對于氨基酸衍生物，5-氧化脯氨酸、N-甲酰-L-蛋氨酸、N-α-乙酰基-L-鳥氨酸等在S1期顯著富集，N-單甲基-L-精氨酸、S-烯丙基-L-半胱氨酸、N-乙酰基-半胱氨酸等在S2期顯著富集，L-酪胺、谷胱甘肽還原型、γ-L-谷氨酸-L-半胱氨酸等在S3期顯著富集。在竹筍高生長中，天冬氨酸和谷氨酸作為鮮味氨基酸，其相對含量在S1和S2表達量高，說明竹筍在S1、S2階段鮮味特征明顯[30-31]。而谷胱甘肽代謝通路中谷胱甘肽還原型及其前體化合物γ-L-谷氨酸-L-半胱氨酸含量在S1到S3階段含量不斷增加，表明在S3期毛竹筍的谷胱甘肽氧化型向還原型轉化，該階段毛竹筍的抗氧化性提高。

圖10 差異累積氨基酸及其衍生物在竹筍生長中的變化情況Fig.10 Variation of differentially accumulated amino acids and their derivatives during bamboo shoot growth

2.4.3 有機酸類化合物

有機酸是一類具有羧基的化合物，在植物中的有機酸可作為碳源、增強植物抗性、影響氨基酸合成、抑菌等[32-33]。毛竹筍中多數有機酸在竹筍生長的S2、S3期具有較高表達（圖11），如1-氨基環丙烷-1-羧酸、γ-氨基丁酸、苯丙酮酸、琥珀酸和蘋果酸等。檸檬酸、異檸檬酸、奎寧酸和α-酮戊二酸等除外，在S1、S2期含量維持較高水平，S3期含量最低。其中1-氨基環丙烷-1-羧酸、γ-氨基丁酸都與乙烯合成有關[34]，苯丙酮酸是木質素合成途徑的前體化合物[35]。此外，有機酸中琥珀酸、檸檬酸、異檸檬酸、酮戊二酸等都是三羧酸循環的中間產物，隨著竹筍生長高度增加，琥珀酸、蘋果酸呈上調趨勢，而檸檬酸、異檸檬酸、酮戊二酸與之相反，從S1～S3積累水平不斷下降。

圖11 差異累積有機酸在竹筍生長中的變化情況Fig.11 Variation of differentially accumulated organic acids during bamboo shoot growth

2.4.4 酚酸類化合物

植物性食物中的酚酸類化合物在維持人體健康方面表現出多種益處，具有優異的抗氧化、抗炎、調節膽固醇等功能[36-39]，酚酸主要通過果蔬和谷物攝入，而竹筍是一種富含兒茶素、咖啡酸、綠原酸等酚酸類物質的植物性食物[40-41]。毛竹筍中檢測到了大量的酚酸類物質（圖12），多數在竹筍S2～S3階段相對含量較高，如苯甲酸、芥子醇、松柏醇、肉桂酸、熊果苷。但三羥基肉桂酰奎寧酸、丁香酸、新綠原酸、2-氨基-3-甲氧基苯甲酸、苯甲酰胺和2-苯乙醇這6 個酚酸例外，在S1期表達量顯著高于S2與S3期。其中在毛竹筍生長期與快速生長期，作為木質素合成前體的松柏醇、芥子醇，以及能夠提高植物耐受性的苯甲酸、肉桂酸等酚酸相對含量顯著提高，新綠原酸相對含量顯著降低，表明竹筍快速生長期部分功能性成分減少，但許多酚酸與增強環境適應能力密切相關。

圖12 竹筍不同生長階段酚酸類化合物的差異累積Fig.12 Differential accumulation of phenolic acids in bamboo shoots at different growth stages

2.4.5 黃酮和生物堿類化合物

黃酮類化合物對生物體代謝調節有重要作用，可以起到清除自由基、抗腫瘤、抗癌、抑菌等作用[42]，因此近年來，黃酮的生物活性開始在食品行業中被應用[43-44]。許多研究表明竹筍中含有豐富的黃酮類化合物[45-46]。通過代謝組學測定，發現毛竹筍中的黃酮主要以黃酮、黃酮醇、二氫黃酮、黃酮碳糖苷的形式存在（圖13A），在竹筍的生長過程中，多數黃酮在S1期顯著富集，S2期顯著降低，槲皮素-3-O-半乳糖苷（金絲桃苷）、異金絲桃苷、槲皮素-3-O-葡萄糖苷（異槲皮苷）、槲皮素-3-O-蕓香糖苷（蘆丁）、柚皮素、紫鉚素等均表現出下降趨勢。然而，香葉木素、麥黃酮、沙可林B、水仙苷、異鼠李素-3-O-新橙皮糖苷和芹菜素及其下游代謝物牡荊素在S3期含量顯著增加。

生物堿類物質是植物中的重要活性成分，且其含量變化與調節植物生長和應對環境脅迫密切相關[47]。毛竹筍中共監測到生物堿17 種，其中有6 種在S2～S3階段變化極為顯著（圖13B），對香豆酰基腐胺、色胺、N-阿魏酰五羥色胺和順-N-阿魏羥色胺相對含量顯著下降，褪黑激素含量顯著上升。其中色胺是褪黑激素合成途徑的上游代謝物，說明快速生長期消耗大量色胺用于合成褪黑激素。褪黑激素能夠協同多種植物激素調控植物生長發育，提高植物應對脅迫的能力[48]。

3 結論

本研究通過廣泛靶向代謝組學分析方法結合生理指標測定，對毛竹筍不同生長階段的成分進行了鑒定。研究結果顯示，毛竹筍隨生長高度增加黃度值和硬度值均顯著增加，與此同時，口感相關指標如木質素和纖維素含量顯著上升，糖類、蛋白質、游離氨基酸等決定竹筍營養品質的指標顯著下降，竹筍總酚、黃酮和VC含量在3 個生長階段中也呈現下降趨勢，隸屬函數分析表明毛竹筍破土期具有較好的營養風味品質。進一步對不同生長期的代謝物分析，共鑒定出765 個化合物，其中有203 個代謝物出現差異累積，并通過熱圖對毛竹筍差異代謝物的動態變化情況進行全面分析。結果表明多數黃酮類（蘆丁等）、游離脂肪酸（9-羥基-12-氧代-10E,15Z-十八碳二烯酸等）、氨基酸（天冬氨酸、精氨酸等）以及少量酚酸（新綠原酸等）富集在破土期，這些化合物可能與毛竹筍的風味和營養品質密切相關。大部分脂質類（溶血磷脂乙醇胺、溶血磷脂酰膽堿等）、氨基酸衍生物（谷胱甘肽還原型、L-酪胺等）、有機酸類（苯丙酮酸、1-氨基環丙烷-1-羧酸等）、酚酸類（芥子醇、肉桂酸等）以及褪黑激素隨生長高度增加相對含量呈上升趨勢，說明盡管毛竹筍生長期與快速生長期風味品質降低，但依舊含有豐富的功能活性物質，而且這些化合物可能與增強竹筍抗性、促進生長發育密切相關。本研究通過代謝組學方法闡述了毛竹筍不同生長階段主要差異代謝產物的動態變化，為毛竹筍的營養價值研究以及毛竹資源的開發與利用提供理論依據。