基于代謝組學技術結合智能感官探究臨床乳房炎對牛乳風味和滋味物質的影響

盧 璇，張 茜，趙宇軒，易宇文，唐俊妮，鄧 靜，楊發龍，朱成林,*

（1.西南民族大學食品科學與技術學院，四川 成都 610041；2.西南民族大學畜牧獸醫學院，四川 成都 610041；3.四川旅游學院 烹飪科學四川省高等學校重點實驗室，四川 成都 610100）

牛乳是最受歡迎的天然飲品之一，因其高營養價值，被稱為“白色血液”。牛乳中含有水、蛋白質、脂肪、乳糖、無機鹽等多種成分。在新冠肺炎疫情背景下，居民對牛乳營養保健的認可較之前有大幅度提升，認為乳制品對于提升機體抵抗力有一定作用[1]。國家衛生健康委發布了合理營養膳食和每天食用牛乳的科學飲食指導，并將其作為提高免疫力、防控與救治新冠肺炎的重要途徑[2]。因此，我國乳制品消費迎來新的發展機遇，消費需求呈現蓬勃的增長趨勢。近年來我國乳業發展迅速，但由于疾病、遺傳、環境、營養等因素的影響，奶牛普遍存在乳產量低和乳品質不合格等問題，不利于我國奶業的持續壯大發展。奶牛乳房炎是全世界奶牛業中最常見、治療最昂貴、造成損失最大的疾病之一，嚴重影響牛乳營養品質。臨床乳房炎在我國發病率高，更有不良商家在健康原料乳中摻雜乳房炎牛乳，不僅嚴重影響乳制品的風味品質，更對消費者的健康影響極大。

代謝組學是對生物體內代謝物進行定量分析并尋找代謝物與生理病理變化關系的一種新型研究方式。代謝組學在小分子代謝物水平將細胞、組織和生物體整個過程進行聯系[3]。代謝物與乳成分之間的關系可以幫助理解乳品的品質特性，并且可以突出生物標記物小分子的特征。在代謝組學研究手段中，核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）以其穩定、可靠、無損和樣品制備簡單等優點，較為廣泛地應用于代謝組學分析，并已被證明可以快速、準確地監測牛乳中小分子代謝物的變化規律[4]。Klein等[5]利用基于核磁共振氫譜的代謝組學技術研究奶牛泌乳階段的生理變化和潛在生物標志物，發現3-羥基丁酸可作為酮癥的標志物。Maher等[6]采用1H NMR技術研究牛乳與奶牛血清代謝產物的關系，發現血清中三甲胺水平與牛乳中三甲胺水平高度相關。孫雨航等[7]應用1H NMR技術鑒定乳熱癥奶牛血清內的差異性標志代謝產物，從小分子物質、能量代謝的角度探究乳熱癥奶牛體內的代謝變化。

電子鼻和電子舌統稱智能感官，是一種模擬人類味覺和嗅覺的仿生儀器。電子鼻和電子舌可以對樣品的香氣物質和滋味信息進行對比分析，快速分析復雜的揮發性氣體混合物，并用于牛乳的區分和檢測[8]。Tong Lingjun等[9]采用電子鼻和感官評價比較不同預熱處理脫脂牛乳的風味變化，發現采用適宜的預熱溫度能使脫脂牛乳香味、甜味等感官屬性增強。郭奇慧等[10]利用電子鼻對不同原乳進行氣味分析，結果表明，電子鼻可以區分優質原乳和異味原乳。毋思敏等[11]利用電子鼻、電子舌技術分析鮮牛乳在不同貯藏溫度下的品質變化情況，并建立了牛乳貨架期預測模型。許凌云等[12]應用電子鼻結合電子舌技術分析不同熱處理對牛乳風味的差異。

本研究以健康牛乳與臨床乳房炎牛乳為研究對象，采用代謝組學技術結合智能感官比較樣品的風味和滋味物質差異，旨在為鑒別健康牛乳和臨床乳房炎牛乳提供數據支持，為原料乳質量控制提供科學依據，進而提高乳制品的風味品質。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

健康牛乳樣品和乳房炎牛乳樣品均來自四川成都某奶牛養殖牧場。采集產后150 d的健康牛乳和乳房炎牛乳各100 mL，在4 ℃冷藏，并在2 h內運送到實驗室。

三氯甲烷（CHCl3）、磷酸鹽緩沖液、疊氮化鈉（NaN3）（均為分析純）西格瑪奧德里奇（上海）貿易有限公司；2,2,3,3-D4-3-(三甲基硅基)-丙酸鈉鹽（2,2,3,3-D4-3-(trimethylsilyl group)-sodium propionate，TSP）、氘代水（D2O）美國Cambridge Isotope Laboratories公司。

1.2 儀器與設備

AVANCE Ⅲ型NMR波譜儀 德國Bruker公司；4000乳成分分析儀 丹麥FOSS公司；FOX 4000電子鼻、α-ASTREE型電子舌 法國Alpha MOS公司。

1.3 方法

1.3.1 乳成分分析

采用乳成分分析儀測定樣品中蛋白質含量、脂肪含量、非脂乳固體含量、密度、乳糖含量、固形物含量、摻水率、溫度、冰點。乳成分分析儀使用前預熱3 h。

1.3.2 電子鼻分析

準確吸取樣品1 mL，置于10 mL頂空瓶，密封、編號。分析條件：手動進樣，頂空溫度75 ℃，加熱時間5 min，載氣流量150 mL/s，進樣量2000 μL，進樣速率2000 μL/s；數據采集時間120 s，時間延遲180 s。每個樣品平行測試5 次，取傳感器后3 次在120 s時獲得的穩定信號進行主成分分析（principal component analysis，PCA）。

1.3.3 電子舌分析

自動進樣，數據采集時間2 min，每個樣品平行檢測5 次，取傳感器后3 次在2 min時采集的穩定信號作為分析數據。

1.3.41H NMR分析

量取0.7 mL牛乳樣品于2 mL EP管中，加入0.8 mL CHCl3，旋渦混合3 min，在4 ℃、14000 r/min離心15 min，去除樣品中的脂肪。取0.5 mL上清液，添加10 mmol/L TSP重水溶液0.2 mL，用作NMR化學位移參考。利用磷酸鹽緩沖液調整溶液pH值為7.00±0.02，并添加10 μL 2 mmol/L NaN3溶液，以避免微生物繁殖。最后每個樣品在14000 r/min、4 ℃條件下離心5 min。

參考葉婷婷等[13]的方法并適當優化，確定1H NMR譜測定條件：載波頻率600.13 MHz，檢測溫度298 K，譜寬1×107，弛豫時間5 s，獲取數據點32000，掃描次數32，同時通過預飽和CPMG序列抑制水信號，回波數量400。NMR光譜處理和標峰借助Topspin（3.5）和Chenomx（8.4）軟件完成。在計算各化合物峰值時采用全局光譜去卷積算法對重疊區域進行反卷積，以對在擁擠光譜區域出現共振的化合物進行絕對定量。在1H NMR譜中信號面積與樣品中存在的質子數呈正比，分別對1H NMR譜圖中單個信號進行積分，并通過與內標信號比較，計算極性和非極性組分含量。

1.4 數據處理

數據使用R 語言進行獨立樣本t檢驗和作圖，P＜0.05，差異顯著。

2 結果與分析

2.1 乳成分分析結果

如表1和圖1所示，脂肪質量分數、密度、蛋白質量分數、冰點4 個指標P值均小于0.05，具有顯著差異，與健康組相比，乳房炎組牛乳脂肪質量分數顯著降低（P＜0.05）。脂肪在體細胞數量較多的牛乳中顯著下降，可能是由于乳房發炎期間乳腺細胞合成和分泌能力下降。王化江等[14]發現，體細胞數量增多會顯著降低乳脂肪含量，且游離脂肪酸含量增加，會產生不同程度的澀味和苦味。而密度、蛋白質量分數和冰點在乳房炎牛乳中均顯著上升（P＜0.05）。乳房炎牛乳中蛋白質含量增加，可能是由于奶牛患乳房炎后會增加乳房毛細血管的通透性，從而使蛋白含量增加。其余指標在兩種牛乳間差異不顯著（P＞0.05）。

圖1 顯著性差異指標箱線圖Fig.1 Box plots of significantly differential indicators

表1 乳房炎牛乳和健康乳成分含量及變化趨勢Table 1 Comparison of chemical composition between mastitic milk and normal milk

2.2 電子鼻分析結果

由圖2可知，電子鼻可以有效區分臨床乳房炎牛乳和健康牛乳樣品，PC1貢獻率達92.7%，可以很好地反映樣品的整體信息。電子鼻的18 個傳感器對兩種牛乳的風味化合物皆有響應，并且響應值各不相同。除LY2/LG傳感器響應強度差異不顯著，其余17 個傳感器對兩種牛乳的響應值均表現出顯著差異（P＜0.05）。在健康牛乳中，T70/2、T40/2傳感器有顯著響應，對應香氣增加。在乳房炎牛乳中，P30/1、LY2/gCT、P40/2、LY2/G等傳感器具有顯著響應，對應的不愉快臭味增加。結合傳感器對應參考化合物的風味特征（表2）可知，奶牛患乳房炎后，其分泌的乳汁不新鮮，存在一定的刺激性氣味，加工價值降低。

圖2 健康和乳房炎牛乳的電子鼻PCA得分圖（A）和載荷圖（B）Fig.2 PCA score plot (A) and loading plot (B) of electronic nose data for normal and mastitic milk

表2 不同傳感器對應的參考化合物[15]Table 2 Flavor characteristics of reference compounds from different sensors

2.3 電子舌分析結果

由電子舌PCA圖（圖3）可知，乳房炎組和健康組牛乳滋味不同，有明顯區分，PC1貢獻率為67%，所占權重大，PC2貢獻率為33%。所用傳感器包括CTS（咸）、NMS（鮮）、AHS（酸）、SCS（苦）、ANS（甜）5 個專一屬性和2 個綜合屬性（PKS、CPS）。健康牛乳中ANS傳感器有顯著響應，乳房炎牛乳中SCS傳感器響應強度較高。其余傳感器探頭響應強度有差異但不顯著。

圖3 健康和乳房炎牛乳的電子舌PCA得分圖（A）和載荷圖（B）Fig.3 PCA score plot (A) and loading plot (B) of electronic tongue data for normal and mastitic milk

2.4 1H NMR分析結果

采用1H NMR對健康牛乳和乳房炎牛乳中的小分子代謝產物進行測定，在其1H NMR譜中每種代謝物均有其對應的特征峰。參考前人的研究[16-18]及Chenomx化學物標準峰數據庫，如圖4所示，利用基于1H NMR的代謝組學技術從牛乳樣本中共精確定性和定量54 種分子，主要為氨基酸、有機酸、碳水化合物、核苷、核苷酸及其衍生物等化合物。

圖4 乳房炎牛乳1H NMR波譜圖Fig.4 1H NMR spectra of mastitic milk

由圖5可知，23 種定量分子在兩組間差異顯著（P＜0.05），分別是乳酸、異亮氨酸、醋酸、精氨酸、纈氨酸、亮氨酸、3-羥基丁酸、乙酰肉堿、組氨酸、丙二酸鹽、二甲基砜、麥芽糖、胞嘧啶核苷、三甲胺氮氧化物、肌酸、膽堿、檸檬酸、延胡索酸酯、順烏頭酸、2-氧戊二酸鹽、肌酸酐、乳糖、甘氨酸。

圖5 健康和乳房炎牛乳中顯著差異分子的含量對比Fig.5 Comparison of contents of significantly differential molecules in normal and mastitic milk

乳酸、異亮氨酸、醋酸、亮氨酸、3-羥基丁酸、精氨酸、纈氨酸在乳房炎牛乳中含量較高，其中4 種屬于氨基酸類，其余3 種屬于有機酸類。研究表明，在臨床乳房炎牛乳樣中，游離氨基酸（異亮氨酸、亮氨酸、精氨酸、纈氨酸）含量明顯增加[19]。氨基酸含量顯著增加的原因可能是較高的病原特異性發酵和蛋白質降解活性增強[20]。周常義等[21]根據氨基酸的呈味特性與味覺強弱，將纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、精氨酸歸類于苦味氨基酸。因此，可以判斷乳房炎牛乳具有明顯的苦味。乳酸可以由牛乳中的微生物產生，也可以通過乳房炎癥后上皮細胞無氧呼吸產生[22]。研究表明，牛乳中的細菌會導致獨特的代謝圖譜，表現為乳酸含量升高[23]。在本研究中，臨床乳房炎組的乳酸代謝水平顯著增加，與前人報道一致。醋酸是牛乳關鍵風味成分，具有較強的酸味，在較高濃度下會產生異味[24]。丁酸在低濃度時具有奶香味，而含量過高時就會呈現較強的酸臭味[25]。

與健康牛乳相比，乙酰肉堿、組氨酸、丙二酸鹽、二甲基砜、麥芽糖、胞嘧啶核苷、三甲胺氮氧化物、肌酸、膽堿、檸檬酸、延胡索酸酯、順烏頭酸、2-氧戊二酸鹽、肌酸酐、乳糖、甘氨酸在乳房炎牛乳中含量下降。這些分子主要參與能量和碳水化合物代謝、蛋白質代謝。三羧酸循環是主要的代謝途徑，參與此代謝的化合物如檸檬酸、順烏頭酸、2-氧戊二酸鹽在乳房炎牛乳樣品中含量顯著減少。Thomas[26]的研究結果表明，奶牛患乳房炎后，碳水化合物和能量代謝均將下降。檸檬酸可與糖共同代謝，在酶的催化下經多次轉化最終形成丙酮酸，而丙酮酸的消耗則可能會產生其他揮發性風味物質[27]。延胡索酸酯是三羧酸循環和尿素的中間產物。體細胞數量高的乳房炎牛乳中延胡索酸酯含量下降的原因可能是因為細菌感染或酮癥導致三羧酸循環功能受損，影響能量代謝，從而引起延胡索酸酯從乳腺上皮分泌或泄漏到牛乳中[19]。甘氨酸是結構最簡單的天然氨基酸，參與體內多種代謝過程，是肝臟中合成肌酸的主要氨基酸。肌酸大部分以磷酸肌酸的形式存在于肌肉中，參與能量代謝。乳糖是牛乳中一種重要的碳水化合物，當奶牛患臨床乳房炎后，乳腺細胞膜被破壞，血液成分流入牛乳中[28]。為維持滲透壓穩定，乳糖含量下降。肉堿是機體內一種氨基酸衍生物，參與體內骨骼肌能量代謝、脂代謝、糖代謝等過程[29]。肉堿在中間代謝的主要功能是將長鏈脂肪酸從細胞質運輸到線粒體基質[30]，其前體物質是賴氨酸和甲硫氨酸，因此肉堿的缺乏會導致氨基酸代謝譜異常[31]。肉堿在臨床乳房炎牛乳中含量下降的原因可能是能量代謝受損。

3 結論

利用基于1H NMR的代謝組學技術結合智能感官、乳成分分析儀，探究臨床乳房炎對牛乳理化特性、風味和滋味物質的影響。結果表明，電子鼻和電子舌能夠成功區分健康牛乳和乳房炎牛乳氣味和滋味的差異。采用1H NMR技術對健康牛乳和乳房炎牛乳的小分子物質進行測定，共分析鑒定出54 種化合物，其中23 種分子含量在兩組牛乳樣本中差異顯著。具體表現為乳房炎牛乳中氨基酸和有機酸的含量明顯增加，導致乳制品產生不愉悅的酸臭味。本研究為鑒別健康牛乳和臨床乳房炎牛乳提供數據支持，為原料乳質量控制提供科學依據，有助于提高乳制品的風味品質。