植物乳桿菌發酵人參中活性成分改變及抗氧化作用

劉士偉，劉勝楠，米倩雯，陰 裴，薛婷芳，于曉然，孟星堅，王麗娜，畢云楓,*

（1.吉林農業大學食品科學與工程學院，吉林 長春 130118；2.吉林醫藥學院藥學院，吉林 吉林 132013）

人參為五加科人參屬草本植物，主要分布于亞洲大陸東部的山林地帶，在我國的東北地區常見，被譽為東北三寶之一。人參中富含多種成分，包括人參皂苷[1-2]、多糖、多肽、氨基酸[3]、酚酸、揮發油、甾醇、炔醇及維生素等[4]，不同人參成分的性質及藥理活性也各不相同。人參中天然皂苷Rb1、Rc、Rb2、Re和Rg1占人參皂苷總含量的70%～80%，但這些皂苷極性較大，不利于人體吸收，而人參中的稀有人參皂苷卻具有較高的藥理活性。大量研究表明稀有人參皂苷具有抗疲勞、抗氧化[5]、抗腫瘤[6]、增強免疫力[7]、抗炎[8]、輔助降低血糖、保護神經系統[9]等作用。人參于2012年被批準為新資源食品，對于人參發酵的研究成為近年來的研究熱點。人參發酵的主要目的是使人參皂苷通過微生物酶的作用轉化生成某些稀有人參皂苷。微生物轉化法因其特異性強、節約成本、操作簡單等優點已被廣泛使用于稀有人參皂苷的轉化[10]。夏晚霞等[11]篩選出發酵轉化人參皂苷的乳酸菌，并分析發酵過程中人參皂苷的生物轉化路徑，證實發酵過程中常見皂苷向稀有皂苷的轉化，使得稀有皂苷含量提高。陳旸等[12]探究發酵對中間產物人參皂苷Rd的轉化作用，結果表明其轉化機制為Rb1→Rd→Rg3，發酵后人參皂苷Rd含量顯著提高。與之相比，使用人參粗提取物進行發酵，可以最大程度利用微生物分泌的酶分解消耗掉糖、蛋白質等雜質，提高人參皂苷純度，同時得到更多種類的轉化產物，也顯著提高了稀有皂苷轉化率。

本實驗以人參提取物（ginseng extract，GE）為研究對象，采用益生菌植物乳桿菌對GE進行發酵，通過高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法對稀有人參皂苷成分進行定性和定量分析，測定并分析GE與發酵后人參提取物（fermented ginseng extract，FGE）中活性成分含量的變化，同時對GE與FGE的抗氧化能力進行評價。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

干參、黑參購于通化市人參交易市場，經吉林農業大學中藥材學院教授鑒定均為五加科植物人參；植物乳桿菌B1由吉林農業大學食品科學與工程學院食品新資源團隊篩選并鑒定。

人參皂苷標準品（Rh1、Rg2、Rd、Rk3、Rh4、Rg3、PPT、Ck、Rk1、Rg5、Rh2、PPD）成都曼思特生物科技有限公司；β-胡蘿卜素、亞油酸、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2,2’-聯氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）上海源葉生物科技有限公司；乙腈、甲醇（均為色譜純）賽默飛世爾科技有限公司；苯酚、濃硫酸、冰乙酸 北京化工廠有限責任公司；過硫酸鉀、水楊酸、鐵氰化鉀、三氯乙酸 成都科隆化學品有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

HH-4數顯恒溫水浴鍋 江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；FLEXARTM型HPLC儀 美國Perkin Elmer有限公司；DGL-50B型滅菌鍋 中國力辰科技有限公司；UV-2600I型可見分光光度計 島津（中國）有限公司；GRP-9160型數顯電熱培養箱 上海深信實驗儀器有限公司；TG16高速離心機 上海盧湘儀離心機儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 植物乳桿菌發酵制備FGE

將干參以料液比1∶10分別用水和70%乙醇溶液在85 ℃提取2 h，將得到的人參提取液濃縮干燥后得到的粉末即為GE。將實驗室保存的植物乳桿菌B1在37 ℃活化，將一定比例GE與無菌水加入到已滅菌的發酵罐中，隨后加入在MRS培養基中活化好的植物乳桿菌使得乳桿菌終濃度為4%，活菌數達到3.15×108CFU/mL，37 ℃恒溫發酵6 d。測定發酵過程中的pH值，使用0.1 mol/L NaOH溶液進行滴定，確定可滴定酸度，在發酵完成后將發酵液真空冷凍干燥，得到的粉末即為FGE。

1.3.2 HPLC法分析樣品的制備

取適量GE、FGE、黑參粉分別過60 目篩，然后加入2 倍體積乙酸乙酯渦旋振蕩，充分混勻進行萃取，5000 r/min離心5 min后吸取上清液，再次重復以上操作，將2 次上清液于85 ℃水浴加熱直至蒸干，然后加入等體積的色譜甲醇，充分溶解，0.22 μm濾膜過濾，濾液用于HPLC檢測。

1.3.3 GE與FGE中活性物質含量的測定

1.3.31 總酚含量的測定

使用沒食子酸作為標準品，參考白周亞等[13]方法采用福林-酚比色法測定總酚含量。以沒食子酸質量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，于750 nm波長處測定吸光度，繪制標準曲線為y=0.94729x＋0.01119，R2=0.9993，總酚含量以每克干物質中沒食子酸的質量表示。

1.3.32 多糖含量測定

使用葡萄糖作為標準品，參考李萬從等[14]方法采用苯酚-硫酸法測定多糖含量。以葡萄糖質量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，于490 nm波長處測定吸光度，繪制標準曲線為y=7.95657x-0.00716，R2=0.9993，多糖含量以每克干物質中葡萄糖的質量表示。

1.3.33 總黃酮含量測定

使用蘆丁作為標準品，參考Kim等[15]方法采用氯化鋁比色法測定總黃酮含量。以蘆丁質量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，于500 nm波長處測定吸光度，繪制標準曲線為y=2.81714x-0.00745，R2=0.9991，總黃酮含量以每克干物質中蘆丁的質量表示。

1.3.34 總皂苷含量測定

使用人參皂苷Re作為標準品，參考杜金鳳等[16]方法采用香草醛-冰醋酸法測定總皂苷含量。以人參皂苷Re質量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，于465 nm波長處測定吸光度，繪制標準曲線為y=2.97523x＋0.01902，R2=0.9995，總皂苷含量以每克干物質中皂苷Re的質量表示。

1.3.4 人參皂苷成分的鑒定及定量分析

用HPLC對1.3.2節中制得樣品液進行稀有人參皂苷成分鑒定，HPLC條件參考李秋陽等[17]方法，色譜柱：采用PerkinElmer C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為乙腈（A）-0.05%磷酸鹽水溶液（B）；檢測波長203 nm，流速：1.0 mL/min，進樣量10 μL，柱溫35 ℃，進行梯度洗脫。梯度洗脫步驟：0～5 min，18% A，82% B；5～20 min，21% A，79% B；20～22 min，21%～26% A，79%～74% B；22～26min，26%～32% A，74%～68% B；26～46 min，32%～33.8% A，68%～66.2% B；46～51 min，33.8%～38% A，66.2%～62% B；51～57.7min，38%～49% A，62%～51% B；57.7～58 min，49%～49.1% A，51%～50.9% B；58～62 min，49.1% A，50.9% B；62～63 min，49.1%～50.6% A，50.9%～49.4% B；63～68 min，50.6%～59.6% A，49.4%～40.4% B；68～69.8 min，59.6%～65% A，40.4%～35% B；69.8～77 min，65% A，35% B；77～94min，65%～85% A，35%～15% B；94～120 min，18% A，82% B。根據人參皂苷標準曲線定量計算出樣品中稀有皂苷的含量，按照每克提取物中的稀有皂苷質量表示，單位為mg/g。

1.3.5 抗氧化活性測定

1.3.51 DPPH自由基清除能力測定

參考Chen Fang等[18]方法對DPPH自由基清除能力進行測定。配制不同質量濃度發酵前后樣品溶液（0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 mg/mL），以抗壞血酸（VC）作為陽性對照。于517 nm波長處測定吸光度。按式（1）計算DPPH自由基清除率：

式中：A0為1 mL DPPH自由基溶液＋1 mL雙蒸水吸光度；A1為1 mL DPPH自由基溶液＋1 mL樣品吸光度；A2為1 mL無水乙醇＋1 mL樣品吸光度。

1.3.52 ABTS陽離子自由基清除能力測定

參考Cho等[19]方法并稍作修改，配制不同濃度發酵前后樣品溶液（同1.3.5.1節），以VC作為陽性對照。于734 nm波長處測定吸光度，按式（2）計算ABTS陽離子自由基清除率：

式中：A0為4 mL ABTS陽離子自由基乙醇溶液＋1 mL雙蒸水的吸光度；A1為4 mL ABTS陽離子自由基乙醇溶液＋1 mL樣品的吸光度；A2為4 mL雙蒸水＋1 mL樣品的吸光度。

1.3.53 羥自由基清除能力測定

參考Ganguly[20]和趙磊[21]等方法，配制不同質量濃度發酵前后樣品溶液（同1.3.5.1節），以VC作為陽性對照，于510 nm波長處測定吸光度。按式（3）計算羥自由基清除率：

式中：A0為乙醇-水楊酸溶液＋FeSO4溶液＋H2O2溶液＋雙蒸水的吸光度；A1為乙醇-水楊酸溶液＋FeSO4溶液＋H2O2溶液＋樣品的吸光度；A2為乙醇-水楊酸溶液＋FeSO4溶液＋雙蒸水＋樣品的吸光度。

1.3.54 還原力測定

參考李青等[22]方法，配制不同質量濃度發酵前后樣品溶液（同1.3.5.1節），以VC為陽性對照。以蒸餾水代替FeCl3溶液作為空白調零，以去離子水為參比，于700 nm波長處測定吸光度。

1.3.55β-胡蘿卜素漂白實驗

參考Park等[23]方法，配制不同質量濃度發酵前后樣品溶液（同1.3.5.1節），以2,6-二叔丁基對甲酚（butylated hydroxytoluene，BHT）為陽性對照，于470 nm波長處測定吸光度，以蒸餾水代替樣品作為空白對照，按式（4）計算β-胡蘿卜素和亞油酸偶聯自氧化的抑制率：

式中：A1和分別為加入樣品后0 h和6 h的吸光度；A0和分別為空白對照組0 h和6 h的吸光度。

1.3.56 抑制脂質過氧化能力測定

參考Jung等[24]采用硫氰酸鐵法評估抑制脂質過氧化的能力。配制不同質量濃度發酵前后樣品溶液（同1.3.5.1節），以BHT為陽性對照。于500 nm波長處測定吸光度，按式（5）計算對脂質過氧化的抑制率：

式中：A0為第0小時樣品的吸光度；A1為第72小時樣品的吸光度。

1.4 數據處理與分析

2 結果與分析

2.1 發酵過程中酸度變化

如圖1所示，植物乳桿菌發酵GE過程中，pH值由6.61降至3.31，可滴定酸度由0.24%升至2.81%。因為在發酵過程中產生乳酸等有機酸，使產物的pH值降低，可滴定酸度增加[25]。

圖1 植物乳桿菌發酵GE過程中pH值與可滴定酸度的變化Fig.1 Changes in pH and titratable acidity in GE during the fermentation process

2.2 發酵對GE中活性物質含量的影響

如圖2 所示，與G E 相比，F G E 總酚的含量由11.775 mg/g提高到16.400 mg/g，提高了39.28%。這是由于在發酵過程中pH值的變化，影響了酚類物質的釋放，微生物把復雜的大分子酚類物質轉化成小分子酚類物質，使總酚含量增加[26]。這與之前研究[27]，由釀酒酵母發酵黑參中總酚含量高于生參和黑參的結果相似。

圖2 發酵對GE中總酚、多糖、總黃酮和總皂苷含量影響Fig.2 Effect of fermentation on the contents of total phenols,polysaccharides,total flavonoids and total saponins in GE

多糖的含量從630 mg/g降低到350 mg/g，降低了44.44%。這是由于發酵的進行，微生物不斷生長，多糖作為微生物進行增殖和合成代謝的重要來源被不斷的消耗。因此多糖含量的降低與微生物的生長利用有關。

總黃酮的含量從2.36 mg/g提高到4.18 mg/g，提高了79.01%。根據微生物的生長代謝特點，推測造成總黃酮含量提升可能是由于發酵過程中微生物分泌的酶類破壞了植物細胞壁，從而提高了FGE中總黃酮的含量。

總皂苷的含量從250.1 mg/g降低到156.2 mg/g，降低了37.54%。隨著發酵時間延長，總皂苷含量降低，是由于人參中天然皂苷發酵過程中轉化成了稀有人參皂苷所連糖基被水解掉，分子質量降低所致。

2.3 人參皂苷的轉化結果分析

通過HPLC法對樣品的稀有人參皂苷生成情況進行對比分析，圖3為HPLC測定色譜圖的對比。依據標準曲線算出樣品中稀有人參皂苷的含量，結果如表1所示，經過發酵，人參皂苷含量與種類發生改變。發酵前，不含有Rk3、Rh4、Rg5等稀有人參皂苷，發酵后，生成了上述稀有人參皂苷，且與黑參中稀有皂苷含量對比，發現益生菌發酵生成稀有人參皂苷的含量高于黑參。夏晚霞等[11]和趙彩秀[28]根據研究結果推測，二醇型人參皂苷轉化路徑為Rb1/Rb2→Rd→Rg3→Rh2、Rb1/Rc→Rd→Rg1、Rb1→Rd→Rg3→Ck、Rg3→Rg5＋Rk1。參考劉偉等[29]三醇型人參皂苷轉化機理圖，結合表1稀有皂苷含量結果，可以推測出人參皂苷的轉化路徑，二醇型人參皂苷為Rb1、Rb2、Rc→Rd→Rg3→Rg5＋Ck＋Rh2＋Rk1→PPD（圖4A），三醇型人參皂苷為Rg1、Re→Rh1＋Rg2→Rh4＋Rk3→PPT（圖4B）。

表1 發酵前后稀有人參皂苷含量對比Table 1 Comparison of rare ginsenoside contents before and after fermentation mg/g

圖3 HPLC色譜圖對比結果Fig.3 Comparison results of HPLC chromatograms

圖4 二醇型人參皂苷（A）和三醇型人參皂苷（B）轉化路徑Fig.4 Transformation pathways of diol ginsenosides (A) and triol ginsenosides (B)

GE中主要二醇型人參皂苷為Rb1、Rc、Rb2，經發酵生成的次級代謝產物主要為稀有人參皂苷Rg3、Ck、Rk1、Rg5和Rh2，這幾種稀有人參皂苷的含量分別增加了1.8075、0.7706、0.7348、1.3648 mg/g和1.4796 mg/g。GE中主要三醇型人參皂苷為Rg1和Re，經發酵生成的次級代謝產物主要為稀有人參皂苷Rh1、Rg2、Rk3和Rh4，這幾種稀有人參皂苷的含量分別增加了2.0996、0.8271、0.9493 mg/g和3.3924 mg/g。菌體發酵過程中產生的酶能夠將GE中人參二醇型皂苷的C3和C20位、三醇型皂苷的C6和C20位的糖基結構進行水解，使天然人參皂苷失去糖基，轉化為稀有皂苷和苷元。

2.4 GE與FGE的抗氧化活性分析

2.4.1 對DPPH自由基的清除能力

DPPH自由基清除活性測定原理為紫色DPPH自由基被抗氧化劑還原為淡黃色聯氨[30]。如圖5A所示，GE和FGE都對DPPH自由基有清除能力。當質量濃度為0.5～20.0 mg/mL時，GE對DPPH自由基的清除率為3.43%～65.18%，FGE為14.64%～86.18%。與之相比，陽性對照VC的DPPH自由基清除率為83.15%～95.53%。隨著GE和FGE質量濃度的增加，GE和FGE的DPPH自由基清除率均有明顯提升，在同一質量濃度下，FGE的DPPH自由基清除率比GE更高，且發酵前后差異顯著（P＜0.05），說明發酵能夠提升對DPPH自由基的清除能力。

圖5 GE及FGE在不同質量濃度下3 種自由基清除活性Fig.5 Three free radical scavenging activities of GE and FGE at different concentrations

2.4.2 對ABTS陽離子自由基的清除能力

如圖5B所示，當質量濃度為0.5～20.0 mg/mL時，GE對ABTS陽離子自由基的清除能力為1.73%～64.75%，FGE為4.43%～81.24%。與之相比，陽性對照VC的ABTS陽離子自由基的清除率為99.05%～99.35%。隨著GE和FGE質量濃度的增加，GE和FGE的ABTS陽離子自由基清除率均有明顯提升，在同一質量濃度下，FGE的ABTS陽離子自由基清除率比GE更高，且發酵前后差異顯著（P＜0.05）。

2.4.3 對羥自由基的清除能力

如圖5C所示，當質量濃度為0.5～20.0 mg/mL時，GE對羥自由基的清除能力為22.29%～68.14%，FGE為35.17%～82.29%。與之相比，陽性對照VC的羥自由基清除率為97.35%～99.37%。隨著GE和FGE質量濃度的增加，GE和FGE的羥自由基清除率均有明顯提升，在同一質量濃度下，FGE的羥自由基清除率比GE更高，且發酵前后差異顯著（P＜0.05）。

由于發酵提高了黃酮和酚類活性物質的含量，并將天然人參皂苷轉化成了大量具有高抗氧化性的稀有人參皂苷。樣品中稀有皂苷的含量越高，清除自由基能力越強，抗氧化能力越強，這也是FGE清除3 種自由基能力高于GE的原因，但同時多糖含量、分子質量下降也會影響自由基清除效果。

2.4.4 總還原能力測定

總還原能力的測定原理是將鐵氰化鉀的三價鐵還原成二價鐵，二價鐵進一步和三氯化鐵反應生成在700 nm波長處有最大吸收峰的普魯士藍，吸光度越高則表示樣品的還原能力越強[31]。如圖6所示，當質量濃度為0.5～20.0 mg/mL時GE吸光度為0.0741～0.6411，FGE為0.0821～0.9244。與之相比，陽性對照VC的吸光度為2.0145～4.2041。隨著GE和FGE質量濃度的增加，GE和FGE的還原能力均有明顯提升，在同一質量濃度下，FGE的吸光度高于GE，且發酵前后差異顯著（P＜0.05）。這是由于在發酵過程中形成了能夠與自由基反應穩定的還原劑，提高了還原能力。

2.4.5 對β-胡蘿卜素與亞油酸偶聯自氧化的抑制作用

β-胡蘿卜素是一種多烯橘黃色素，被氧化時易褪色，乳化液中的亞油酸會自動氧化，生成的自由基可以與β-胡蘿卜素反應，使β-胡蘿卜素顏色衰減，抗氧化劑可以減緩β-胡蘿卜素顏色衰減的速度[32]，因此該實驗可用于測定抗氧化能力，并確定對亞油酸和β-胡蘿卜素偶聯自氧化的抑制作用。如圖7所示，當質量濃度為0.5～20.0 mg/mL時，GE的抑制率為0.98%～75.76%，FGE的抑制率為4.04%～81.19%。與之相比，陽性對照BHT的抑制率為89.54%～99.69%。隨著GE和FGE質量濃度的增加，GE和FGE的抑制率均有明顯提升，在同一質量濃度下，FGE的抑制率高于GE，且發酵前后差異顯著（P＜0.05）。說明發酵能夠提高對亞油酸和β-胡蘿卜素偶聯自氧化的抑制作用，FGE可作為天然抗氧化劑。

2.4.6 對脂質過氧化的抑制作用

如圖8所示，在0.5～20.0 mg/mL下GE和FGE的脂質過氧化抑制率分別為28.43%～86.59%和47.58%～92.58%。與之相比，陽性對照BHT的脂質過氧化抑制率為83.65%～94.11%。結果表明，FGE的脂質過氧化抑制率高于GE，在同一質量濃度下，FGE脂質過氧化抑制率比GE更高，且發酵前后差異顯著（P＜0.05）。這是由于產生的稀有人參皂苷能抑制脂質過氧化活性、增加抗氧化酶[33]，并且酚類化合物能夠與金屬離子發生絡合作用，與脂類氧化生成的羰基化合物發生反應[34]，使FGE具有更強的抑制脂質過氧化能力。

圖8 GE及FGE在不同質量濃度下脂質過氧化抑制率的對比Fig.8 Comparison of inhibition of lipid peroxidation by GE and FGE at different concentrations

3 結論

人參皂苷是人參的主要功能性成分，利用微生物產生的葡萄糖苷酶的去糖基化作用，可將其轉化為功能更強的稀有人參皂苷。植物乳桿菌發酵GE對pH值、可滴定酸度、總酚、多糖、總黃酮、皂苷含量、人參皂苷成分和抗氧化效果影響顯著?？偡雍涂傸S酮的含量增加，經HPLC分析發現，皂苷組成發生變化，天然人參皂苷經過水解作用，轉化為稀有皂苷和苷元，如Ck、Rk1、Rh4、Rg5等。通過不同的方法評估發酵對抗氧化活性影響，FGE對3 種自由基具有明顯的清除作用，均呈劑量依賴性增加，其中FGE對亞油酸的自氧化有著更強的抑制作用。本研究證明，發酵GE能夠產生稀有人參皂苷，能夠提高抗氧化能力的同時抑制脂質氧化。因此，FGE可作為潛在的天然抗氧化劑應用于食品和藥品工業中。