核桃主要致敏蛋白Jug r 1的分離純化、鑒定與分析

沈明娟，李云嵌，楊 曦，王永琴，沙小梅，張雪春,3,*

（1.西南林業大學生命科學學院，云南 昆明 650224；2.江西師范大學生命科學學院，國家淡水魚加工技術研發專業中心，江西 南昌 330022；3.西南林業大學 云南省森林災害預警與控制實驗室，云南 昆明 650224）

泡核桃（Juglans sigillata）別名胡桃、羌果，為胡桃科胡桃屬木本植物，是我國最重要的經濟類堅果之一，其可食部位為核桃仁，富含蛋白、氨基酸及不飽和脂肪酸等營養成分，其中蛋白占比可達22.18%[1-2]。核桃蛋白是一種較為優質的植物蛋白資源，但同時也是世界上主要的食物過敏原之一。調查顯示，堅果等“八大過敏原”導致了90%的食品過敏現象，其中核桃產生的過敏反應約占所有堅果過敏的34%，約15%的兒童過敏體質者對核桃過敏[3]。核桃過敏可作用于人體呼吸道、胃腸道等部位，導致惡心、唇腫、呼吸困難等臨床癥狀，嚴重影響人們尤其是兒童的身體健康[4-5]。因此，明確核桃中的過敏原蛋白，深入研究其結構和性質，對人類膳食健康有重要意義。

截至目前，世界過敏原數據庫（http://www.allergenonline.org）共收錄了6 種核桃過敏原的信息，分別為Jug r 1、Jug n 1（2S蛋白），Jug r 2、Jug n 2（7S蛋白），Jug r 3（脂質轉移蛋白）和Jug r 4（11S球蛋白）[6]。其中Jug r 1是一種分子質量約16.4 kDa的2S蛋白種子貯藏蛋白，由139 個氨基酸組成，研究發現在32 例核桃過敏患者中，約96.9%的患者對抗原Jug r 1過敏，說明Jug r 1是引發核桃過敏反應的主要原因[7]。Sordet等[8]利用大腸桿菌表達重組Jug r 1，同樣證實了Jug r 1是核桃中的主要過敏原蛋白。但目前國內外關于Jug r 1的相關研究較少，主要集中在其致敏原線性表位[9-10]及基因表達[8,11]等方面，且使用的幾乎都是Jug r 1含量較低的粗蛋白，與Jug r 1相關的過敏研究如人體血清學分析、免疫學分析和生物信息學分析等仍較為匱乏[6,12]。因此，迫切需要采用各種分離純化手段制備高純度的Jug r 1以開展進一步研究。

蛋白純化的主要方法有尺寸排阻色譜、鹽析沉淀法、離子交換層析、疏水層析、親和層析等[13-14]，其中尺寸排阻色譜一般又被稱作凝膠過濾層析或分子篩層析，因具有分離效果好、操作簡單等優點而被廣泛使用[13]。目前已有對花生[15]、巴西堅果[16]、榛子[17]以及其他植物蛋白中過敏原蛋白[13,18]進行分離純化的相關報道，但對核桃致敏蛋白Jug r 1分離純化及鑒定的研究鮮有報道。

云南是我國核桃主產區，其種植面積和產量均居全國第一，且由于其獨特的氣候和地理環境，云南核桃的品質和品種隨地域分布呈現豐富的多樣性，但目前鮮見對云南不同產地核桃的致敏性及其Jug r 1含量的相關研究。因此，以云南不同產地的泡核桃為研究對象，采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）、雙抗夾心酶聯免疫吸附（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）等方法，從中篩選出Jug r 1含量最高的品種，進一步采用硫酸銨分級沉淀、凝膠過濾層析、液相色譜-串聯質譜等手段對Jug r 1進行提取、分離純化和鑒定，并利用圓二色譜和紫外光譜法對其結構進行表征，旨在為深入研究Jug r 1提供科學基礎，以期為核桃致敏的診斷、治療和機理研究提供一定的參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

7 個核桃品種（產地）：臨滄大泡（云南臨滄市），大姚三臺（云南楚雄自治州大姚縣三臺鄉），昌寧細香（云南保山市昌寧縣），大理娘青、大理漾濞、大理龍佳（云南大理自治州），保山隆陽（云南保山市隆陽區）。選擇品質較佳、大小均一、新鮮干燥的核桃，手工破碎后取核桃仁，置于4 ℃冰箱用于下一步實驗。

硫酸銨（純度≥99%）廣東光華科技股份有限公司；三羥甲基氨基甲烷（tris(hydroxymethyl)aminomethane，Tris）、蛋白分子質量標準Marker 北京索萊寶科技有限公司；植物Jug r 1蛋白酶聯免疫分析試劑盒 上海酶聯生物科技有限公司；1.0 mol/L Tris-HCl緩沖液（pH 6.8）、1.5 mol/L Tris-HCl緩沖液（pH 8.8）、牛血清白蛋白標準品（純度≥98%）上海源葉生物科技有限公司；Superdex 200 pg 美國GE公司；鹽酸、冰乙酸等試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

5427R高速冷凍離心機 德國Eppendorf公司；mini Protean3Cell垂直電泳槽、Powerpac Universal電泳儀美國伯樂公司；Gel-Pro Imager Kit電泳凝膠成像系統美國Media Cybernetics公司；15 mm×75 cm中壓特制玻璃層析柱 北京索萊寶科技有限公司；MD SpectraMax Plus 384酶標儀 美國BioTek公司；BRIGHTTIME Chirascan-1500圓二色譜儀 日本分光JASCO公司；UV-2600紫外-可見分光光度計 島津儀器（蘇州）有限公司；Easy nLC 1200色譜系統、Q-Exactive HF-X質譜儀美國Thermo Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1 脫脂核桃粉的制備

參考文獻[19]并稍作修改。將不同產地的核桃仁用0.125 mol/L的NaOH溶液在室溫下浸泡30 min，清水漂洗3～4 次，手工剝去核桃皮，50～60 ℃烘干后，按照核桃與石油醚料液比1∶6（g/mL）進行攪拌粉碎和脫脂3 h，旋蒸回收石油醚，重復上述操作步驟，直至濾液無色透明。收集脫脂后的核桃仁碎粒，最后過80 目篩得到脫脂核桃粉末。

1.3.2 核桃粗蛋白的制備

參考黃子林[20]方法稍作修改。將脫脂核桃粉與蒸餾水按料液比1∶10（g/mL）混合，用0.1 mol/L的NaOH溶液將pH值調為8.5，室溫攪拌提取1 h后，于4 ℃、5000 r/min離心30 min，取上清液用0.1 mol/L HCl溶液調pH值至5.0，同樣于4 ℃、5000 r/min離心30 min后取沉淀物，為消除酸性環境對實驗結果的影響，向沉淀物加入適量的蒸餾水和NaOH溶液調至中性，冷凍干燥后即為核桃粗蛋白，收集備用。

1.3.3 雙抗夾心ELISA法測定Jug r 1含量

參照植物Jug r 1蛋白酶聯免疫分析試劑盒說明書進行，配制質量濃度為1 mg/mL的核桃粗蛋白溶液，按照核桃粗蛋白溶液和樣品稀釋液體積比1∶4進行混合稀釋。分別設置空白孔（不加樣品和酶標試劑）、標準孔、待測樣品孔，以空白孔調零，在450 nm波長處測定光密度（OD值），在相同條件下測定試劑盒自帶質量濃度為2.5、5、10、20、40 ng/L標準品的吸光度，以標準品質量濃度（X）為橫坐標，以OD值（Y）為縱坐標，繪制標準曲線，得到標準方程Y=0.0449X-0.0119（R2=0.9974），依據標準曲線計算Jug r 1含量。

1.3.4 硫酸銨分級沉淀法提取Jug r 1

在4 ℃環境下，將脫脂核桃粉與25 mmol/L Tris-HCl中鹽緩沖液（pH 7.5，含0.5 mol/L NaCl）按料液比1∶10（g/mL）混合攪拌12 h，然后10000 r/min離心20 min，取上清液并調節pH值至7.5[6]。在4 ℃環境下預冷后，于30 min內邊攪拌邊緩慢加入一定質量的硫酸銨，完全溶解后靜置2 h，在12000 r/min離心30 min，收集沉淀與上清液。按相同的操作使離心后上清液的硫酸銨飽和度依次為0%～20%、20%～40%、40%～60%、60%～80%、80%～100%，每個梯度得到的沉淀透析48 h，凍干備用[21]。

1.3.5 凝膠過濾層析法分離純化Jug r 1

填料預處理：將20%乙醇溶液已溶脹的Superdex 200 pg填料用適量超純水反復清洗至無味。

裝柱：選取已清洗干凈的15 mm×75 cm中壓特制玻璃層析柱，垂直固定在鐵架臺上，出口連接乳膠管，將上述清洗好的Superdex 200 pg填料與適量超純水充分攪拌至均勻懸濁液后，用玻璃棒引流至層析柱上端管口1～2 cm處，連接進水口并打開恒流泵，用Tris-HCl緩沖液進行壓柱與平衡，待凝膠液面不再改變。

上樣：將1.3.4節中的硫酸銨沉淀蛋白用Tris-HCl緩沖液配制成質量濃度50 mg/mL的蛋白液，過0.22 μm水系膜，上樣至已完全平衡的層析柱，流速為1 mL/min。

洗脫收集：待Tris-HCl中鹽緩沖液洗脫至完全出峰后，收集各完整洗脫峰溶液待下一步測定[22]。

1.3.6 SDS-PAGE測定

將1.3.4節和1.3.5節中得到各洗脫峰分別采用12%、15%的分離膠與5%的濃縮膠進行SDS-PAGE分析，上樣量為10 μL，恒壓80 V，待樣品全部進入分離膠后更改電壓為120 V，電泳結束后，染色40 min，脫色至背景無色，用凝膠電泳成像系統進行圖像采集并分析電泳條帶[23]，使用Image J軟件對蛋白條帶進行灰度掃描，分析蛋白純度[13]。

1.3.7 液相色譜-串聯質譜（liquid chromatographytandem mass spectrometry，LC-MS/MS）鑒定

將硫酸銨分級沉淀得到的Jug r 1粗提取組分或分離純化得到目標蛋白質條帶使用Easy nLC 1200色譜系統進行色譜分離。對于粗提取物組分，流動相：A為0.1%甲酸溶液，B為0.1%甲酸-乙腈溶液（乙腈為80%）；梯度洗脫程序：0～3 min，95%～92% A、5%～8% B；3～43 min，92%～74% A、8%～26% B；43～48 min，74%～60% A、26%～40% B；48～50min，60%～10% A、40%～90% B；50～60 min，10% A、90% B。

對于純化后的蛋白質條帶，其色譜分離條件為：流動相：A為0.1%甲酸溶液，B為0.1%甲酸-乙腈和水混合溶液（乙腈體積分數80%）；梯度洗脫程序：0～2 min，98%～95% A、2%～5% B；2～44 min，95%～72% A、5%～28% B；44～51min，72%～60% A、28%～40% B；51～53min，60%～0% A、40%～100% B；53～60 min，0% A、100% B。肽段分離后用Q-Exactive HF-X質譜儀進行數據依賴采集質譜分析。質譜條件：分析時長為60 min；檢測模式為正離子；母離子掃描范圍m/z350～1800；二級質譜采集：每次全掃描后觸發采集20 個最高強度母離子的二級質譜圖譜。使用質譜數據庫檢索軟件MaxQuant 2.0.1.0進行數據庫搜索及鑒定。

1.3.8 凝膠過濾層析條件優化

凝膠過濾層析法受洗脫液pH值、上樣質量濃度、上樣體積與洗脫流速的影響較大[24]，參照1.3.5節方法已確定Jug r 1目標蛋白在pH 7.5時溶解性最好，故改變上樣質量濃度、上樣體積與洗脫流速，研究其對Jug r 1目標蛋白含量和得率的影響，從而對Jug r 1的凝膠過濾層析條件進行優化。其優化條件如表1所示，分別收集各洗脫峰組分并測定Jug r 1含量，按下式計算Jug r 1得率：

表1 凝膠過濾層析單因素試驗因素與水平Table 1 Levels of variables used in single-factor experiments on GFC

1.3.9 圓二色譜檢測二級結構

參考Sun Lingge等[25]方法，先用0.01 mol/L的磷酸緩沖液（pH 7.4）將蛋白樣品配制為質量濃度1 mg/mL的溶液，12000 r/min離心10 min后取上清液稀釋至0.1 mg/mL進行分析，測定條件：室溫，帶寬0.2 nm，測定范圍190～240 nm，平均掃描速率100 nm/min，光徑1 mm。將所得樣品的圓二色性值轉換成平均摩爾橢圓度[θ]（deg·cm2/dmol），使用圓二色譜在線分析軟件（http://dichroweb.cryst.bbk.ac.uk/html/process.shtml）對結果進行分析轉換，計算各二級結構的相對含量。

1.3.10 純化前后核桃蛋白中Jug r 1含量的測定

選取核桃蛋白、40%～80%硫酸銨沉淀蛋白，以及經凝膠過濾層析后的目標峰組分，測定其Jug r 1含量，具體操作同1.3.3節。

1.4 數據處理

所有實驗重復3 次，采用Excel處理數據，利用SPSS 25中單因素方差（ANOVA）進行差異顯著性統計分析（P＜0.05），并用Origin 2018和Image Lab 3.0（Beta 3）作圖。

2 結果與分析

2.1 不同產地核桃蛋白的Jug r 1含量

研究表明，核桃蛋白中的主要蛋白是谷蛋白（主要分布于17～19、33～35、55～70 kDa和250 kDa及以上）和球蛋白（主要分布于10～15、32～34、38～40、50～70 kDa）[26-27]。不同產地核桃蛋白SDS-PAGE如圖1A所示，不同產地的核桃蛋白條帶分布基本一致，分子質量均在10～75 kDa范圍，說明含多種相同的蛋白亞基[28]，即這7 種核桃成分組成較為一致，同源性高。另外，不同產地核桃蛋白彼此間條帶明暗略有差異，其中保山隆陽的核桃蛋白條帶最多，且在11、17、28 kDa和35 kDa附近顏色較深，條帶較寬，說明其蛋白含量較高，種類較多。

圖1 不同產地核桃蛋白SDS-PAGE圖譜與Jug r 1含量Fig.1 SDS-PAGE profiles and Jug r 1 contents of walnut proteins from different regions

雙抗夾心ELISA法可以有效用于各種食物中過敏原蛋白的檢測[29]，不同產地核桃蛋白Jug r 1含量如圖1B所示。核桃中Jug r 1含量為：保山隆陽＞臨滄大泡＞昌寧細香＞大理龍佳＞大理娘青＞大理漾濞＞大姚三臺，其中，保山隆陽核桃中Jug r 1含量最高，為49.73 ng/L，約為大姚三臺核桃的2 倍，進一步驗證了SDS-PAGE結果。雖然臨滄大泡核桃與保山隆陽相比，二者蛋白中Jug r 1的含量沒有顯著差別，但根據SDS-PAGE結果來看，保山隆陽產地的蛋白分子質量條帶比臨滄大泡產地的條帶更多、顏色更深，各種蛋白分布的特征更明顯，更適合于下一步的觀察分析和分離純化。且保山隆陽為云南核桃主產區，選擇該地區的核桃進行研究更有意義。因此選取保山隆陽的核桃進行后續分離純化。

2.2 最佳硫酸銨分級沉淀提取Jug r 1的確定

如圖2所示，脫脂核桃粉經Tris-HCl中鹽緩沖液提取后，小分子質量條帶主要出現在浸提物的上清液中（泳道2），鑒于Jug r 1分子質量在16 kDa附近，故選擇上清液進一步硫酸銨分級沉淀。

圖2 硫酸銨分級提取后核桃蛋白的SDS-PAGE圖譜Fig.2 SDS-PAGE profiles of walnut proteins obtained after ammonium sulfate fractionation

結果顯示，硫酸銨飽和度在0%～40%區間的沉淀蛋白主要為大分子質量蛋白（25～75 kDa，泳道3～5），小分子質量蛋白在該區間的條帶顏色較淺，隨硫酸銨飽和度的增加，飽和度在40%～80%區間（泳道5～6）為小分子質量蛋白集中沉淀區，其條帶顏色較深。張煜等[30]研究發現，當硫酸銨飽和度達到50%～65%的情況下，可將分子質量為14～30 kDa的大豆蛋白分離開，其分子質量為30 kDa以下的亞基條帶顏色加深，說明這些亞基含量相對較多，且蛋白的分級分離效果最好，這與本實驗結果相似。考慮到飽和度在80%～100%區間的沉淀蛋白中硫酸銨飽和結晶過多，蛋白含量較少，難以收集且影響實驗結果。因此，后續選擇硫酸銨飽和度為40%～80%區間收集沉淀蛋白。

2.3 硫酸銨分級沉淀粗提Jug r 1的鑒定

對40%～80%飽和硫酸銨的沉淀進行SDS-PAGE分析，結果如圖3A所示。將符合目標蛋白分子質量范圍的凝膠（11～17 kDa左右凝膠，紅色標記范圍）切下。硫酸銨飽和度為40%～80%區間獲得的目標沉淀蛋白經LC-MS/MS鑒定分析，如圖3B所示，該區域的凝膠檢測出致敏蛋白Jug r 1、Jug r 4、Jug r 6以及其他非致敏蛋白的存在。通過Uniprot蛋白質序列數據庫（http://www.uniprot.org/）對其蛋白含量檢索發現，其中致敏蛋白Jug r 1的相對含量最高達到37.70%，占總致敏蛋白含量的76.03%。此外，經LC-MS/MS鑒定和相對定量結果可以看出（圖3C和表2），硫酸銨飽和度為40%～80%區間蛋白條帶的蛋白數量與豐度較大，質譜所收集到的關鍵峰以及組分復雜。圖3C中標注有出峰時間的均為目標蛋白Jug r 1，其主要集中在20～30 min附近出峰，當出峰時間在27.0446 min時，目標蛋白Jug r 1相對豐度最高，峰面積最大。由表2可以看出，P93198序列蛋白為致敏蛋白Jug r 1，其相對分子質量達到16.4 kDa，Jug r 1的覆蓋率最高達到44%。以上結果表明，采用飽和度為40%～80%硫酸銨分級沉淀的方法可較好地初步分離純化核桃致敏蛋白Jug r 1。

圖3 40%～80%飽和硫酸銨沉淀提取后核桃蛋白的SDS-PAGE圖譜和總離子流圖Fig.3 SDS-PAGE profiles and total ion current chromatogram of walnut proteins obtained after 40%–80% saturated ammonium sulfate fractionation

表2 40%～80%飽和硫酸銨沉淀提取后核桃蛋白的LC-MS/MS鑒定結果Table 2 LC-MS/MS identification of walnut proteins obtained after 40%-80% ammonium sulfate fractionation

2.4 Jug r 1凝膠過濾層析純化條件的確定

凝膠層析柱中的Superdex 200 pg是一種惰性的多孔網狀結構的凝膠物質，可利用不同蛋白分子大小流經的途徑差異將其分離[31]。如圖4A所示，飽和度區間為40%～80%的粗蛋白液經凝膠層析過濾后，當洗脫時間約為40 min時出現第1個峰，直至240 min左右結束出峰，共計出現6 個洗脫峰，按照出峰順序標記為F1～F6。除F2外，幾乎所有峰的峰高較高，峰形窄而尖，說明分離效果較好。對6 個洗脫峰進行SDS-PAGE分析，結果如圖4 B 所示，F 1 所含蛋白組分較少，且條帶顏色較淡；F2、F3蛋白組分冗雜，其分子質量主要集中在20～75 kDa之間，屬于高分子質量蛋白；F4收集的蛋白質組分只有1 條清晰的條帶，其分子質量主要集中在11～17 kDa左右，符合目標蛋白Jug r 1的分子質量范圍；F5、F6處的蛋白濃度較低，幾乎檢測不到蛋白條帶。采用Image J軟件對凝膠過濾層析后F4組分的SDS-PAGE蛋白條帶進行灰度值掃描，結果如圖5所示，根據蛋白電泳條帶峰面積，計算得到F4組分的蛋白純度占總蛋白的96.83%。因此，選擇F4組分的蛋白進行后續研究。

圖4 40%～80%飽和硫酸銨沉淀提取后核桃蛋白的凝膠層析分離結果Fig.4 Gel filtration chromatographic separation and SDS-PAGE analysis of walnut proteins obtained after 40%-80% ammonium sulfate fractionation

圖5 凝膠層析分離后F4組分的SDS-PAGE灰度掃描峰面積圖Fig.5 SDS-PAGE grayscale scanning peak area of F4 obtained after gel filtration separation chromatography

2.5 LC-MS/MS鑒定分析

將F4組分樣品經透析除鹽、凍干后進行LC-MS/MS檢測，其總離子流圖如圖6所示。經過凝膠過濾層析分離純化后的目標蛋白Jug r 1與硫酸銨沉淀法初級分離純化的粗蛋白相比，質譜收集的關鍵峰組分較少，表明分離純化之后，目標蛋白Jug r 1純度提高，其關鍵出峰時間主要集中在57 min附近，經數據比對發現，出峰時間分別在56.545、57.579、58.087、58.153 min附近的為目標蛋白Jug r 1。綜合表3可知，F4組分的肽段數量單一，豐度較高，其中序列號為P93198的蛋白分值最高，其分子質量為16.373 kDa，氨基酸序列為139，符合Jug r 1的典型特征[8]。此外質譜共檢測到14 條肽段，均為對應蛋白質組中的唯一肽段，其中2 條肽段（GEEMEEMVQSAR、QQQQQGLR）為目標蛋白Jug r 1所唯一對應的肽段，總肽段長度最長（100～119），肽段分值最高（表4），故將其鑒定為Jug r 1。其他肽段使用UniProt蛋白質序列數據庫（http://www.uniprot.org/）檢索發現，均為非致敏蛋白，其蛋白質類型主要為蛋白組功能、分子功能、生物過程物質，如細胞骨架（A0A834CXD8）、脂肪酸結合（A0A2I4E8T0）、DNA轉錄（A0A6P9EG14）等。

圖6 目標組分的LC-MS/MS總離子流圖Fig.6 Total ion current chromatogram of of the target fraction

表3 目標組分的LC-MS/MS鑒定結果Table 3 Results of LC-MS/MS identification of the target fraction

表4 目標組分的LC-MS/MS肽段鑒定Table 4 LC-MS/MS peptide identification table of the target fraction

2.6 凝膠過濾層析條件優化

單因素試驗結果如圖7A、B所示，Jug r 1的蛋白含量隨上樣質量濃度的增加呈上升的趨勢，但蛋白得率卻呈下降趨勢，原因在于樣品質量濃度隨著上樣質量濃度的增加而增大，而上樣體積、洗脫流速保持固定不變，這導致Jug r 1增加的比例遠小于樣品增加的比例。綜合蛋白吸收信號峰值及目標蛋白Jug r 1得率，選擇上樣質量濃度為30 mg/mL。由圖7C、D可知，Jug r 1的蛋白吸收信號峰值隨上樣體積的增加而增大，當上樣體積為4 mL時，此時的樣品質量濃度最高，Jug r 1含量最高，而Jug r 1得率卻與上樣體積為3 mL的相比無顯著差異（P＞0.05），為了更方便檢測Jug r 1的蛋白含量，綜合考慮選擇上樣體積為4 mL。圖7A～D結果與趙春燕等[32]報道一致，當上樣質量濃度與上樣體積繼續增加時，蛋白吸收信號峰寬會有所增加，致使峰與峰之間分離不徹底，同時對蛋白質的得率無顯著提高作用，反而造成蛋白的浪費。

圖7 凝膠過濾層析影響因素優化Fig.7 Optimization of influential factors of gel filtration chromatography

由圖7E、F得知，Jug r 1含量和得率隨著洗脫流速的增加呈上升后下降的趨勢，當洗脫流速為1 mL/min時，Jug r 1含量和得率分別達到最高（P＜0.05）。當洗脫開始后，樣品質量濃度隨著洗脫流速的增加而增加，此時Jug r 1含量和得率有所上升，但持續增加洗脫流速，洗脫流速過快造成部分樣品直接沒有分離而被洗脫，導致Jug r 1含量和得率下降。綜合而言，過快或過慢的洗脫流速都會降低對Jug r 1分離純化的效果，故選擇洗脫流速為1 mL/min。

綜上所述，確定凝膠層析最佳條件為上樣質量濃度30 mg/mL、上樣體積4 mL、洗脫流速1 mL/min，在此條件下Jug r 1目標蛋白含量和得率最高，分別為19.90 mg/120 mg上樣量和16.58%。

2.7 二級結構的表征

蛋白的二級結構是組成高級結構的基礎，圓二色譜是研究蛋白質溶液二級結構的有效方法，其中肽鍵的吸收范圍在遠紫外區能通過電子躍遷產生這個區域的信號，從而揭示肽鏈骨架結構信息[33-34]。過敏原Jug r 1的圓二色譜圖及其二級結構（α-螺旋、β-折疊、β-轉角以及無規卷曲）的相對含量如圖8所示。由圖8A所示，過敏原Jug r 1在190～200 nm間有一正譜峰，于195 nm波長處為最大吸收峰，并顯示出209 nm和223 nm的雙負峰譜帶的存在，其中209 nm負峰是α-螺旋肽鍵的π-π*躍遷所致，223 nm負峰是α-螺旋肽鍵的n-π*躍遷所致[16,35]，表明過敏原蛋白Jug r 1明顯存在α-螺旋結構。另外，通過圓二色譜在線軟件分析得到其二級結構相對含量結果如圖8B所示，過敏原Jug r 1的二級結構中α-螺旋相對含量最大為49.89%（P＜0.05），然后依次為無規卷曲（24.50%）、β-轉角（17.70%）、β-折疊（7.95%），這說明核桃過敏原Jug r 1以多種構象共存，并以α-螺旋結構為主。目前鮮見過敏原Jug r 1二級結構的報道，因此本實驗結果可為核桃過敏原蛋白Jug r 1的后續研究提供一定參考。

圖8 Jug r 1的圓二色譜圖譜和二級結構單元組分圖Fig.8 CD spectrum and secondary structure composition of Jug r 1

2.8 核桃蛋白純化前后Jug r 1的含量

雙抗夾心ELISA具有靈敏度高、特異性強、操作方便等優點，廣泛應用于致敏蛋白的定性和定量分析[36]。采用雙抗夾心ELISA法檢測核桃蛋白分離純化前后Jug r 1的含量變化如圖9所示，核桃蛋白的Jug r 1含量最低，經40%～80%硫酸銨分級沉淀后，其Jug r 1含量呈顯著上升趨勢（P＜0.05），最后再經凝膠過濾層析后，Jug r 1的含量最高（16.73 ng/L），顯著高于核桃蛋白和硫酸銨分級沉淀蛋白中Jug r 1含量（P＜0.05），說明經過“兩步”分離純化可提高過敏蛋白Jug r 1的含量，為后續深入研究核桃蛋白的致敏性奠定基礎。

圖9 核桃蛋白純化前后Jug r 1的含量變化Fig.9 Changes in Jug r 1 content of walnut protein before and after purification

3 結論

針對云南不同產地的核桃，篩選出Jug r 1含量最高的保山隆陽產地核桃為原料，對其進行硫酸銨分級沉淀、Superdex 200 pg凝膠過濾層析以分離純化Jug r 1，并采用SDS-PAGE、ELISA和LC-MS/MS等手段對Jug r 1進行鑒定。在純化過程中，確定了目標蛋白Jug r 1的最佳硫酸銨沉淀飽和區間以及凝膠過濾層析的最佳條件，“兩步”分離純化可獲得蛋白含量為19.90 mg/120 mg上樣量、蛋白純度占總蛋白96%以上的Jug r 1。圓二色譜表明，純化的Jug r 1以α-螺旋結構為主，雙抗夾心ELISA結果顯示，經“兩步”分離純化后的核桃蛋白中Jug r 1含量顯著上升。本研究技術路線簡單、設備要求低、耗時短、重復性好，適合實驗室少量制備，也可為核桃致敏蛋白Jug r 1后續的相關研究和應用提供科學參考。