植物乳桿菌素LPL-1的異源表達及理化性質分析

王 玉，王 瑤，李平蘭

（中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京 100083）

近年來，抗生素的過度使用，導致在多種食物中檢測到抗生素耐藥菌的存在，對人類健康造成潛在威脅[1-2]，故開發不易產生耐藥性的天然生物防腐劑具有重要意義。乳酸菌細菌素是菌體代謝時，經核糖體機制產生的具有抗菌活性的多肽或前體多肽[3]。與抗生素不同，乳酸菌細菌素不僅對食源性致病菌具有抗性，且在自然狀態下，不易出現細菌素耐藥性菌株[4]。根據乳酸菌細菌素生化和遺傳特性的不同，將其主要分為3 類[5-6]：I類為羊毛硫細菌素；II類為含有熱穩定、不含羊毛硫氨酸的肽，可細分為4 個亞類；III類為對熱敏感的大分子蛋白質物質。目前對I類、IIa類的乳酸菌細菌素研究較為廣泛，其中I類細菌素中的Nisin是唯一被商業許可的乳酸菌細菌素，已在50多個國家授權使用，但因其pH值耐受性較差而應用受限[7-8]。IIa類細菌素因其分子質量小，除二硫鍵形成之外無其他翻譯后修飾，對單核細胞性李斯特菌（Listeria monocytogenes）具有強烈抑菌活性，有良好的pH值穩定性，易被人體內蛋白酶降解等特點，已成為天然食品防腐劑研究與開發的熱點[9-10]。

目前，IIa類細菌素主要通過天然生物合成獲得，但因受到機體調控系統的影響，其產量往往較低，嚴重制約了工業化生產及應用[11]。大腸桿菌（Escherichia coli）表達外源蛋白具有成本低、周期短、產率高等優點[12]，因此，開展IIa類細菌素在E.coli中的表達研究具有重要實踐意義。E.coli胞質處于還原性狀態，在這種狀態下二硫鍵難以形成或穩定存在[13]，因此IIa類細菌素在E.coli中的異源表達多以包涵體形式存在。目前，已有研究報道可以將IIa類細菌素與大分子標簽蛋白融合表達以改變包涵體形式。例如，Wang Qing等[14]在E.coliBL21（DE3）中將細菌素E50-52與泛素融合表達后，切除泛素標簽獲得具有活性的細菌素；Chen Haiqin等[15]將細菌素NB-C1與綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）在E.coli無細胞蛋白質系統融合表達，然后通過切除GFP標簽獲得具有活性的細菌素；同樣地，以類似的方法在E.coli中實現了Plantaricin 423和Mundticin ST4SA可溶性表達[16]。以上方式雖然可以解決IIa類細菌素在E.coli中的包涵體表達問題，但都需要通過切除融合標簽實現活性，不僅增加了純化步驟，而且增加了工業生產成本。已有研究報道可以利用基因編輯技術，將E.coli過氧化物酶基因（ahpC）突變，同時將硫氧還蛋白還原酶基因（trxB）、谷胱甘肽還原酶基因（gor）敲除，以此降低E.coli胞質中的氧化還原電勢，促使含有二硫鍵的蛋白折疊形成正確的空間結構[17]。

本實驗室前期從發酵魚中篩選得到1 株植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）LPL-1，其所產細菌素為新的IIa類細菌素，因含有2 個二硫鍵，該細菌素不僅對李斯特菌表現出強烈抑菌活性，而且具有良好的穩定性，具有作為天然食品生物防腐劑的應用潛力[18-19]。本研究以植物乳桿菌素LPL-1為研究對象，利用CRISPR/Cas9基因編輯技術改變E.coli細胞質中的還原環境構建適宜IIa類細菌素表達的細胞工廠，產生的細菌素不需要通過切除融合標簽實現活性，可以優化細菌素的純化步驟，解決植物乳桿菌素LPL-1在E.coli中的包涵體表達問題，旨在為IIa類細菌素的異源表達及包涵體問題提供了新的解決策略。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

L.plantarumLPL-1分離自中國傳統發酵魚；L.monocytogenesATCC 54002為本實驗室保存；E.coliBW25331、E.coliDH5α 天根生化科技（北京）有限公司。

表達載體pWL-A為本實驗室保存；pCAS和pTargetF質粒 長沙艾碧維生物科技有限公司；限制性內切酶、PrimeSTAR DNA聚合酶、In-Fusion試劑盒 寶日醫生物技術有限公司；MRS、LB和自誘導培養基各組成分西隴科學股份有限公司。

1.2 儀器與設備

DNP-9162恒溫培養箱 上海精宏實驗設備有限公司；SCL-1300垂直潔凈工作臺 北京賽伯樂實驗儀器有限公司；XQ-LS-S高壓蒸汽滅菌鍋 上海博迅實業有限公司；超聲波破碎儀 寧波新芝生物技術股份有限公司；聚合酶鏈式反應 力新儀器（上海）有限公司；恒溫金屬浴、紫外檢測儀 上海滬析生物技術有限公司；Ni-NTA純化柱 金斯瑞生物科技股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 gRNA質粒的構建

通過http://crispor.tefor.net/設計敲除基因的前間隔序列鄰近基序（protospacer adjacent motif，PAM）序列。以pTargetF為模板，采用全質粒聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）方法將設計出的PAM序列加入質粒pTargetF中。使用引物對trxB-F/trxB-R、gor-F/gor-R、ahpC-F/ahpC-R進行全質粒PCR，對PCR產物進行DpnI消化處理，純化后轉化E.coliDH5α，挑選單克隆測序驗證，得到的質粒分別命名為gRNA-trxB、gRNA-gor、gRNA-ahpC。引物序列如表1所示。

表1 實驗所用引物Table 1 Primers used in this study

1.3.2 打靶片段的構建

以E.coilBW25331基因組為模板，trxB-up-F、trxBup-R為引物，PCR擴增獲得基因trxB的上游片段，以trxBdown-F、trxB-down-R為引物，PCR擴增獲得基因trxB的下游片段，以trxB-up-F、trxB-down-R為引物，trxB的上游片段和下游片段為模板，用重疊延伸PCR法獲得trxB的打靶片段。以同樣方法構建gor和ahpC的打靶片段。引物序列如表1所示。

1.3.3 基因敲除菌株的構建

利用化學轉化法將pCAS質粒轉入E.coilBW25331中，挑選含有正確轉化子的菌株，按Jiang Yu等[20]的方法制備含有pCAS質粒的E.coilBW25331（pCAS）感受態。trxB基因的敲除：將100 ng gRNA-trxB質粒、400 ngtrxB打靶片段與50 μL感受態細胞混勻，轉入預冷的0.2 cm電轉杯，電擊后加入預熱的LB培養基，30 ℃復蘇2 h，涂布至含有卡那霉素（50 mg/L）和壯觀霉素（50 mg/L）的LB瓊脂培養基上，30 ℃培養過夜。用驗證引物trxB-Identi-F、trxB-Identi-R（表1）對轉化子進行PCR擴增，測序驗證，檢測trxB基因是否敲除成功。gor基因的敲除和ahpC基因的突變，方法同上。

1.3.4 質粒pTargetF和pCAS的消除

按照Jiang Yu等[20]描述的方法進行pTargetF和pCAS質粒的消除，將鑒定正確的重組菌培養在含有50 mg/L卡那霉素和0.5 mmol/L異丙基-β-D-硫代半乳糖苷的LB液體培養基中，培養8～16 h后涂布于含50 mg/L卡那霉素的LB平板上繼續培養，根據菌株對壯觀霉素敏感性的變化確認gRNA質粒是否消除。將消除gRNA質粒的菌株在37 ℃的LB培養基中培養，以消除pCAS質粒。

1.3.5 重組表達質粒的構建

根據植物乳桿菌素LPL-1基因序列設計引物LPL-F、LPL-R（表1），以植物乳桿菌LPL-1基因組為模板，使用PrimeSTAR DNA聚合酶擴增植物乳桿菌素的編碼基因。PCR體系：模板50 ng，2×PrimeSTAR 25 μL，上、下游引物各1 μL（10 μmol/L），添加ddH2O至50 μL；PCR條件：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30 個循環；72 ℃延伸10 min。將基因片段采用1.5%的瓊脂糖凝膠回收。

利用NcoI和XhoI酶切表達質粒pWL-A，純化試劑盒回收酶切后的質粒，利用In-Fusion試劑盒將回收的質粒與擴增的植物乳桿菌素LPL-1基因片段進行連接。連接產物轉化至E.coliDH5α感受態細胞中，菌落經PCR篩選陽性克隆并進行測序驗證。

1.3.6 重組植物乳桿菌素LPL-1的表達和純化

將植物乳桿菌素LPL-1表達質粒轉化至E.coliBW25113和構建的其余基因敲除菌中，于固體平板挑取單菌落于5 mL LB液體培養基，37 ℃、230 r/min培養至OD600nm=0.4。按照0.5%的接種量轉接至100 mL自誘導液體培養基[21]，37 ℃、230 r/min培養12 h；5000 r/min離心10 min收集菌體，5 mL 0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）重懸，超聲波破碎菌體（功率30%、破碎3 s、間隙2 s，工作時間10 min），收集上清液與沉淀，用Tricine-十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）[22]分析目的蛋白的表達情況。

收集含有重組蛋白的上清液，經0.45 μm濾膜過濾后裝入Ni-NTA純化柱，在220 nm下對蛋白進行檢測。用5～10 倍柱床體積的PBS（含10 mmol/L咪唑）洗去未結合的蛋白。之后用PBS（含300 mmol/L咪唑）洗脫帶有His標簽的重組蛋白，流速為1 mL/min，收集洗脫峰，Tricine-SDS-PAGE分析目的蛋白的純化情況，1 kDa超濾管對目標峰蛋白脫鹽濃縮。

1.3.7 重組植物乳桿菌素LPL-1抑菌活性的檢測

采用瓊脂擴散法[23]檢測重組植物乳桿菌素LPL-1的抑菌活性，每孔添加量為100 μL。將純化的細菌素進行2 倍稀釋，取100 μL進行抑菌實驗，檢測不到抑菌圈出現的最高稀釋度定義為一個活力單位（1 AU），其倒數即細菌素的相對抑菌效價（AU/mL），以肉眼觀察到的產生抑菌圈的最低濃度為重組植物乳桿菌素LPL-1對指示菌的最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）。

1.3.8 重組植物乳桿菌素LPL-1的生化特性分析

1.3.81 溫敏性

將純化的植物乳桿菌細菌素LPL-1置于60、80 ℃與100 ℃，處理15 min和30 min，恢復室溫后，檢測其抑菌活性變化。以未處理組（25 ℃）為對照，計算細菌素活性保留百分比。

1.3.82 pH值穩定性

用1 mol/L HCl溶液和1 mol/L NaOH溶液將純化的植物乳桿菌素LPL-1 pH值調節至2～11，37 ℃孵育2 h后，調回細菌素pH 6.0，檢測其抑菌活性變化。以pH 6為對照，計算細菌素活性保留百分比。

1.3.83 表面活性劑穩定性

將純化的植物乳桿菌細菌素LPL-1分別與1%的乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）、Tween-20、Tween-80和尿素混合，37 ℃孵育2 h，檢測其抑菌活性變化。以未處理組為對照，計算細菌素活性保留百分比。

1.4 數據處理與分析

采用Excel軟件對原始數據進行整理，采用GraphPad Prism軟件對實驗數據進行單因素方差分析及繪圖，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 重組植物乳桿菌素LPL-1的表達載體構建

L.plantarumLPL-1基因組信息顯示，植物乳桿菌素LPL-1基因大小為126 bp，用引物LPL-F、LPL-R擴增得到的植物乳桿菌素LPL-1基因片段大小在100～250 bp之間（圖1），連接至pWL-A表達載體，對重組子進行測序驗證，得到含有正確克隆的表達載體pWL-A-LPL-1，可用于后續的蛋白表達。

2.2 基因敲除菌株的構建

2.2.1 基因敲除菌株E.coil（ΔtrxB）和E.coil（Δgor）的構建

構建的trxB-gRNA與trxB打靶片段成功轉入含有pCAS質粒的E.coilBW25331菌株中。trxB基因長度為966 bp，用橫跨trxB基因500 bp的上下游引物進行鑒定，正確敲除trxB后，擴增產物為500 bp，未敲除trxB基因擴增產物長度為1466 bp；以同樣的方法對gor基因進行敲除和鑒定，基因gor長度為1353 bp，gor基因敲除后，擴增產物長度為500 bp，gor未敲除擴增產物長度為1853 bp。通過核酸電泳（圖2）分析發現，基因trxB與gor敲除成功，基因測序后未發現基因突變，因此得到敲除菌株E.coil（ΔtrxB）和E.coil（Δgor），可用于重組植物乳桿菌素LPL-1的表達。

圖2 基因敲除菌株E. coil（ΔtrxB）和E. coil（Δgor）構建的菌落PCR鑒定圖Fig.2 Colony PCR identification of gene knockout strains E. coil(ΔtrxB) and E. coil (Δgor)

2.2.2 基因敲除菌株E.coil（ΔtrxB＋Δgor＋ahpCM）的構建

E.coli中氧化還原反應兩個關鍵基因trxB和gor同時缺失會導致菌體死亡，而細胞質內ahpC基因突變（TTCTACCC→TTCTCTTACCC）可以減少過氧化氫和烷基氧化物的積累，保護細胞免受損傷，進而抑制菌體的死亡[24]。構建的ahpC-gRNA質粒與ahpC打靶片段成功轉入含有pCAS質粒的E.coilBW25331菌株中。通過基因測序（圖3），成功篩選到含有正確突變體的目標菌株。在此突變株基礎上分別對trxB和gor基因進行敲除，最終成功得到基因敲除菌株E.coil（ΔtrxB＋Δgor＋ahpCM），可用于重組植物乳桿菌素LPL-1的表達。

圖3 基因ahpC點突變前后比對圖Fig.3 Comparison of target gene ahpC before and after mutation

2.3 重組植物乳桿菌素LPL-1的表達分析

構建成功的表達載體pWL-A-LPL-1分別轉化至E.coliBW25113、E.coil（ΔtrxB）、E.coil（Δgor）和E.coil（ΔtrxB＋Δgor＋ahpCM）進行表達分析，將誘導表達后的菌體進行超聲破碎，利用Tricine-SDS-PAGE對超聲破碎后的上清液與沉淀進行分析，由圖4可知，以E.coliBW25113為宿主時，只有沉淀中可觀察到目的條帶（5.2 kDa），由此說明植物乳桿菌素LPL-1在野生型菌株中主要以包涵體形式表達；植物乳桿菌素LPL-1以敲除菌株E.coil（ΔtrxB）和E.coil（Δgor）為表達宿主時，在上清液中可見痕量表達，但細菌素仍大量以包涵體形式存在于沉淀中；當細菌素在E.coil（ΔtrxB＋Δgor＋ahpCM）中誘導表達時，可以明顯觀察到上清液中目的蛋白的表達量增多，由此說明構建的基因工程菌E.coil（ΔtrxB＋Δgor＋ahpCM）有利于植物乳桿菌素LPL-1的正確折疊，促進了細菌素的可溶性表達，進一步以該菌株為表達宿主，對上清液中的植物乳桿菌素LPL-1進行純化與活性分析。

圖4 植物乳桿菌素LPL-1于E. coli BW25113（A）、E. coil（ΔtrxB）（B）、E. coil（Δgor）（C）和E. coil（ΔtrxB＋Δgor＋ahpCM）（D）中表達的Tricine-SDS-PAGE分析Fig.4 Tricine-SDS-PAGE analysis of the expression of plantaricin LPL-1 in E. coli BW25113 (A),E. coil (ΔtrxB) (B), E. coil (Δgor) (C) and E. coil (ΔtrxB +Δgor+ahpCM) (D)

2.4 重組植物乳桿菌素LPL-1的純化

如表2和圖5所示，細菌裂解上清液的比活力為193.26 AU/mg，重組植物乳桿菌素LPL-1帶有His標簽可以用Ni-NTA柱進行純化，經10 mmol/L咪唑洗脫雜蛋白，300 mmol/L咪唑洗脫目的蛋白，共出現兩個洗脫峰，利用Tricine-SDS-PAGE對峰1和峰2進行分析，重組蛋白的分子質量為5.2 kDa，在峰2大量出現且純度較高。收集峰2的目的蛋白進行抗菌活性驗證，其比活力為2542.35 AU/mg。超濾管對峰2目的蛋白脫鹽處理后的比活力為2690.62 AU/mg。雖然純化后的重組細菌素比活力不如天然植物乳桿菌素LPL-1（5541.66 AU/mg），但其回收率卻遠超天然細菌素（2.08%）和需要切除融合標簽的重組細菌素（5.75%）[19]，這可能是由于重組細菌素含有His標簽，一定程度影響細菌素的活性，但因避免了繁瑣的純化步驟，所以提高了回收率。

圖5 E. coli BW25113（ΔtrxB＋Δgor＋ahpCM）外源表達的植物乳桿菌素LPL-1 Ni-NTA柱純化（A）、純度（B）及對L. monocytogenes的抑菌活性（C）Fig.5 Purification (A),purity (B) and antibacterial activity (C) of plantaricin LPL-1 from E. coli BW25113 (ΔtrxB+Δgor +ahpCM) by Ni-NTA column

表2 植物乳桿菌素LPL-1的純化Table 2 Purification of plantaricin LPL-1

2.5 重組植物乳桿菌素LPL-1的抗菌譜分析

如表3所示，重組植物乳桿菌素對L.monocytogenes、金黃色葡萄球菌和糞腸球菌等革蘭氏陽性菌表現出明顯抑菌活性，與天然植物乳桿菌素[19]和其他植物乳桿菌中分離的IIa類細菌素[24]一致，重組細菌素不能抑制革蘭氏陰性菌和真菌的生長。以上結果說明用此方法表達的重組細菌素能夠很好地保留天然細菌素的抑菌特性。

表3 重組植物乳桿菌素LPL-1抑菌譜Table 3 Antimicrobial spectrum of recombinant plantaricin LPL-1

2.6 重組植物乳桿菌素LPL-1的生化特性分析

2.6.1 溫度對重組植物乳桿菌素LPL-1的影響

細菌素對溫度的敏感性強弱是衡量其在食品行業潛在應用價值的標準。由圖6A可知，外源表達的植物乳桿菌素LPL-1在60 ℃分別處理10 min與30 min后，其抗菌活性可以保持90%以上，經80 ℃分別處理10 min與30 min，抗菌活性可以保持80%以上，經100 ℃分別處理10 min與30 min，抗菌活性可以保持65%以上，與天然合成的植物乳桿菌素LPL-1[19]和植物乳桿菌素J23[25]相似，說明該重組細菌素具有很好的熱穩定性，在巴氏滅菌及需要高溫滅菌的食品中具有一定的應用潛力。

圖6 溫度（A）、pH值（B）和表面活性劑（C）對植物乳桿菌素LPL-1活性的影響Fig.6 Effects of temperature (A),pH (B) and surfactant (C) on the activity of plantaricin LPL-1

2.6.2 pH值對重組植物乳桿菌素LPL-1的影響

不同細菌素適用的pH值范圍不同，大多數乳酸菌細菌素在低pH值條件下抑菌活性最高，在pH 7以上時，抑菌活性減弱或喪失[26]。例如，Nisin在酸性條件下抑菌效果最好，但在中性或堿性條件下活性喪失[27]。而重組植物乳桿菌素LPL-1與天然合成的植物乳桿菌素LPL-1[19]和其他植物乳桿菌素[28]相似，在pH 2～7范圍內仍保持90%以上活力（圖6B），pH 8～10范圍內仍保持50%～70%的活力，說明該細菌素具有非常好的pH值穩定性，在酸性、中性及弱堿性食品中具有一定的應用潛力。

2.6.3 表面活性劑對重組植物乳桿菌素LPL-1的影響

表面活性劑常用作食品乳化劑應用于食品工業中[29]。由圖6C可以看出，尿素、EDTA、Tween-20和Tween-80對重組植物乳桿菌素LPL-1的抗菌活性影響很小，均可以保持90%以上的抗菌活性，與天然合成的植物乳桿菌素LPL-1和植物乳桿菌素K25[30]類似，由此說明重組細菌素在乳化食品中具有一定應用潛力。

3 結論

IIa類細菌素是乳酸菌細菌素中規模最大、研究最廣泛的一個類別[31]，由于其穩定的理化性質和對食源性致病菌的強抑菌活性，已成為生物防腐劑中最有希望的候選物[10]。天然IIa類細菌素產量低且不易于分離純化，以E.coli為宿主表達時，由于其二硫鍵的存在又極易形成包涵體。

本研究通過CRISPR/Cas9 基因編輯技術以E.coliBW25331為底盤菌株，構建了3 種不同基因型的表達宿主。植物乳桿菌素LPL-1在野生型E.coliBW25331中主要以包涵體形式出現；在E.coliBW25113（ΔtrxB）與E.coliBW25113（Δgor）中以可溶性形式痕量出現于上清液中，但多數仍以包涵體形式存在；當植物乳桿菌素在E.coliBW25113（ΔtrxB＋Δgor＋ahpCM）中表達時，在上清液中觀察到大量細菌素的出現，由此解決了植物乳桿菌素LPL-1的包涵體表達問題。將外源表達的植物乳桿菌素LPL-1經鎳柱純化后，得到的重組細菌素與天然細菌活性相似，在不同pH值（2～11）、溫度（60～100 ℃）及表面活性劑處理后仍保持較高的活性，并對多種食源性致病菌具有抑菌活性，說明外源表達的植物乳桿菌素LPL-1在食品領域具有非常廣泛的應用潛力。

本研究對IIa類細菌素異源表達的探索以及理化特性分析可為細菌素的工業化生產及其在食品安全領域應用提供一定數據支持。