紫蘇多糖硒酸改性及理化結構特性分析

趙亞娜，郭江濤，周田田，李孟昊，李會珍

（1.中北大學化學與化工學院，山西 太原 030051；2.中北大學晉中產業技術創新研究院，山西 晉中 030600；3.齊魯工業大學（山東省科學院）菏澤分院，山東 菏澤 274000）

紫蘇（Perilla frutescensL.）是唇形科一年生草本植物，為亞洲特有植物資源，在我國已有2000多年栽培歷史，是衛生部首批頒布的60 種藥食同源類作物之一。作為傳統中草藥，紫蘇具有散寒解暑、潤肺止咳、健胃鎮靜和治療感冒頭痛等功效，蘇梗、蘇葉、蘇籽均可入藥[1-2]。現代醫學研究表明，紫蘇還具有抗氧化、抗病毒、抗炎、抑菌和免疫調節等功效[3-5]。紫蘇多糖（Perilla frutescenspolysaccharides，PFPS）是一類復雜的可溶性生物活性大分子，眾多研究表明PFPS具有潛在的生物功效。如Li Huizhen等[6]通過DEAE-cellulose-52和Sephadex G-100分離純化獲得了4 種紫蘇葉多糖單一組分，都顯示了不同程度的體外抗氧化活性。PFPS還具有較強的細胞溶酶體酶活性和巨噬細胞吞噬能力，體外能誘導一氧化氮和腫瘤壞死因子產生，體內能刺激小鼠免疫因子產生，可作為一種免疫增強劑被開發利用[7]。紫蘇餅粕多糖是具有β-糖苷鍵的中等分子質量多糖，主要由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖組成，具有良好的抗氧化活性[8]。

硒是人體必需的微量元素，人體許多疾病的發生與硒缺乏有關，如克山病、心腦血管疾病、癌癥和糖尿病等。由于硒無法在人體內合成而必須從食物中攝取，因此人體中硒的缺乏非常普遍[9]。研究表明，有機硒具有比無機硒更高的安全性、更低的毒性和更好的生物利用度。天然多糖的硒酸化修飾是將無機硒轉化為有機硒，并同時實現硒與多糖功能強化的一種修飾方法[10]。Surhio等[11]采用HNO3-Na2SeO3法對粒毛盤菌（Lachnumsp.）胞外多糖硒化改性，其中硒以—Se(O)OH基團結合到多糖C6的O6位置，修飾后胞外多糖的降脂能力和肝臟保護作用優于未修飾多糖。也有研究分別在產胞外多糖陰溝腸桿菌、灰樹花和平菇培養基中添加適宜濃度的Na2SeO3，硒含量分別達12.962、8.37 μg/g和3.21 μg/g，且顯示了有效的抗氧化和免疫調節活性[12-14]。

本研究以紫蘇葉為原料，分別經水提醇沉法、Sevag法和膜透析法制備分離粗PFPS。采用HNO3-Na2SeO3法對PFPS進行硒酸改性修飾，獲得硒化-紫蘇多糖（Se-PFPS）分別采用傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，FTIR）、高效凝膠滲透色譜法（high performance gel permeation chromatography，HPGPC）、掃描電子顯微鏡（scanning electron microscopy，SEM）、X射線衍射分析（X-ray diffraction，XRD）和熱重分析儀（thermal gravimetric analyzer，TGA）對PFPS和Se-PFPS的結構特征進行表征鑒定，旨在為開發新型富硒食品及擴大紫蘇在食品工業中的應用提供科學的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫蘇來源于山西太原中北大學試驗田。紫蘇葉于9月采收，采收后室溫陰干約1 周備用。

亞硒酸鈉 成都艾科達化學試劑有限公司；葡萄糖吳江市鑫茂精細化工有限公司；氯化鋇 天津市蘇莊化學試劑廠；苯酚 天津盛通泰化工有限公司；氯仿、正丁醇 天津市光復科技發展有限公司；濃硫酸、濃硝酸北京華亞兄弟商貿有限公司；抗壞血酸 天津市永大化學試劑有限公司；無水乙醇 天津市科密歐化學試劑有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

DS-T250高速多功能粉碎機 上海頂帥工貿有限公司；SB-100D數控超聲波清洗器 寧波市新芝生物科技股份有限公司；THZ-82氣浴恒溫振蕩器 江蘇金壇市醫療器械廠；L535-1低速（冷凍）離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；KQ-100DE旋轉蒸發器 昆山市超聲儀器有限公司；Tensor-11 FTIR儀 德國布魯克公司；紫外-可見分光光度計 上海美譜達儀器有限公司；MIRA LMS SEM 捷克泰思肯公司；SC7620濺射鍍膜儀英國Quorum公司；Nano ZS90納米粒度儀 英國馬爾文公司；1200型高效液相色譜儀 安捷倫科技（中國）有限公司；Empyrean XRD儀 荷蘭帕納科公司；STA2500 TGA 耐馳科學儀器商貿（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 PFPS提取

參考Wang Chao等[15]方法采用水提醇沉法提取PFPS。陰干的紫蘇葉經粉碎過篩后（80 目）稱取100 g，按液料比20∶1（mL/g）加入蒸餾水并在80 ℃水浴鍋中攪拌提取3 h。4000 r/min離心15 min獲得上清液后，沉淀物繼續浸提3 h，合并2 次上清液并蒸發濃縮。濃縮液中加入4 倍體積95%乙醇溶液，過夜沉淀后離心獲得沉淀物即為PFPS。PFPS經進一步溶解后采用Sevag法除蛋白。向多糖溶液中加入1/5體積的Sevag試劑（正丁醇∶氯仿=1∶4（V∶V）），多次振蕩混勻后除去中層蛋白層并回收上清液。上清液經自來水和蒸餾水分別透析48 h（mw：3500 Da）后，冷凍干燥即得到PFPS固體粉末。以葡萄糖為標準建立標準曲線（y=0.0588x＋0.0846，R2=0.9945），采用苯酚-硫酸法測定多糖純度[16]。多糖得率計算如式（1）所示：

式中：W為多糖得率/%；m1為凍干后PFPS質量/g；m0為紫蘇葉質量/g。

1.3.2 硒化-紫蘇多糖（Se-PFPS）制備

采用HNO3-Na2SeO3法[17]對PFPS進行硒酸化修飾。精確稱取質量比為1∶1（g/g）的PFPS和亞硒酸鈉于50 mL體積分數0.5%硝酸溶液，加入0.7 g氯化鋇，在反應溫度60 ℃水浴反應8 h。反應結束后加入適量的飽和硫酸鈉溶液去除氯化鋇，4000 r/min離心15 min獲得上清液后，加入碳酸鈉溶液調pH值至中性，之后加入4 倍體積95%乙醇過夜沉淀，離心得到沉淀物即為Se-PFPS。沉淀物經復溶后用透析袋（mw：3500 Da）透析，每8 h換一次水，直至滴加抗壞血酸后不變紅色，冷凍干燥后得到Se-PFPS固體粉末，采用苯酚-硫酸法測定多糖純度[16]。

1.3.3 硒含量測定

參考HJ 680—2013《土壤和沉積物 汞、砷、硒、鉍、銻的測定》[18]，分別移取0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL硒標準液（100.0 μg/L）于50 mL容量瓶中，分別加入10 mL鹽酸，室溫放置30 min，蒸餾水定容混勻后，測定熒光強度并繪制硒標準曲線（y=164.319x-22.498，R2=0.9998）。準確稱取0.1 g樣品于消解管中，之后緩慢加入6 mL鹽酸和2 mL硝酸，充分混勻。將消解罐裝入消解罐支架后放入微波消解儀爐腔內，按表1升溫程序進行微波消解。將消解后的樣品稀釋至合適濃度置于原子熒光光度計中進行測定，并按式（2）計算Se-PFPS中的硒含量：

表1 微波消解升溫程序Table 1 Microwave digestion heating program

式中：W為樣品中硒含量/（μg/g）；ρ為由標準曲線測定樣品中硒元素質量濃度/（μg/L）；ρ0為空白溶液硒元素質量濃度/（μg/L）；V0為微波消解后試液定容體積/mL；V1為分取試液的體積/mL；V2為分取后測定試液的定容體積/mL；m為稱取Se-PFPS質量/g。

1.3.4 紫外光譜分析

稱取一定量PFPS和Se-PFPS，用蒸餾水溶解并稀釋至1 mg/mL后，以蒸餾水為空白對照，200～900 nm范圍內作全波長掃描。

1.3.5 FTIR分析

分別稱取10 mg PFPS和Se-PFPS粉末于真空干燥箱中干燥到恒質量。用等量遞增法逐步加入100 mg無水KBr，利用瑪瑙研缽研磨均勻，對其壓片并置于紅外光譜儀。對無水KBr單獨壓片，作空白基線調零，在波長范圍4000～500 cm-1之間進行掃描。

1.3.6 SEM觀察

將2 種多糖樣品均勻撒在導電膠上，并使用濺射鍍膜儀噴金45 s，在加速電壓10～15 kV條件下通過掃描電鏡觀察樣品表面形態特征。

1.3.7 粒徑分析

用蒸餾水分別配制0.5 mg/mL的PFPS和Se-PFPS溶液，通過納米粒度儀在室溫測定2 種多糖的粒度分布和聚合物分散性指數（polymer dispersity index，PDI）。

1.3.8 HPGPC分析

參考Ren Yuanyuan等[19]方法，采用HPGPC法測定多糖分子質量分布。分別精確稱取PFPS和Se-PFPS 2.00 mg，用1.0 mL超純水溶解后，過0.22 μm水膜，用高效液相色譜儀對2 種多糖的分子質量分布進行測定。色譜條件：TSK-GEL G4000PWxl色譜柱；示差檢測器；流動相：超純水；流速：0.6 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測器溫度：35 ℃；進樣量：20 μL。

1.3.9 XRD分析

采用XRD儀測定2 種多糖樣品的晶體結構。XRD條件：CuKα輻射，35 kV管壓力，100 mA管電流，10°～70°，0.02°梯度。

1.3.10 TGA

采用TGA測定2 種多糖樣品熱穩定性。以20.0 mL/min的速度將氣體轉換為氮氣，并以10 ℃/min速率將樣品從30 ℃加熱至800 ℃。

1.4 數據處理

采用Origin 8.0軟件進行數據處理。

2 結果與分析

2.1 硒含量分析

由表2可知，經水提醇沉、Sevag法脫蛋白和透析處理后，PFPS得率為3.57%，純度為（53.22±1.69）%。在此基礎上，對紫蘇粗多糖進行硒酸改性修飾。在PFPS與亞硒酸鈉質量比0.5∶0.5（g/g）、硝酸質量分數0.5%、反應溫度60 ℃、反應時間8 h條件下，所得Se-PFPS中硒含量可達（1004.33±48.60）μg/g，硒取代度為0.1%，多糖純度為（60.92±1.21）%。根據前期研究，紫蘇粗多糖主要由3 種單一組分組成，其質量占比分別為18.04%、29.39%和23.33%。在單糖組成方面，紫蘇粗多糖由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖組成，其質量比為3.196∶43.901∶21.956∶4.244∶4.706∶21.997[8]。大量研究顯示，采用HNO3-Na2SeO3法對多糖進行稀酸改性，其中硒主要以—Se(O)OH基團結合到多糖C6的O6位置（圖1），從而實現硒與多糖的功能強化[11,20]。因此，Na2SeO3與PFPS中單糖發生了硒酸酯化反應。

圖1 天然多糖硒酸化修飾機制Fig.1 Selenization modification mechanism of natural polysaccharide

表2 PFPS和Se-PFPS化學組成分析Table 2 Chemical composition of PFPS and Se-PFPS

2.2 紫外及紅外光譜分析

如圖2a所示，2 種多糖在280 nm波長處均存在特殊吸收峰，表明仍有部分蛋白未脫除，分析其可能為結合蛋白[21]。圖2b顯示，2 種多糖在3379.38 cm-1和3386.77 cm-1處的強吸收峰歸屬于—OH伸縮振動，2931.97 cm-1和2931.58 cm-1處的吸收峰歸屬于CH3、CH2、CH等C—H伸縮振動[22]。1606.51 cm-1和1601.31 cm-1處的吸收峰歸屬于N—H（—CONH—）振動，表明PFPS中存在結合蛋白[23]；1415.17 cm-1和1418.02 cm-1處的吸收峰與C—H彎曲振動有關[24]，1028.50 cm-1和1025.92 cm-1處的強峰歸屬于C—O—C糖苷鍵，837.38 cm-1和837.37 cm-1為吡喃葡萄糖的特征吸收峰[25]。亞硒酸鈉在743 cm-1處存在特征吸收峰，而PFPS與Se-PFPS在此范圍內無特征吸收峰，表明PFPS與亞硒酸鈉發生了化學反應而不是物理吸附。此外，在895.42 cm-1處為Se-PFPS比PFPS多出的特征吸收峰，因此可判斷PFPS發生了硒化反應，且硒以亞硒酸酯的形式存在[26-27]。

圖2 PFPS和Se-PFPS的紫外光譜圖（a）和FTIR圖（b）Fig.2 UV (a) and FTIR (b) spectra of PFPS and Se-PFPS

2.3 形態學觀察

如圖3所示，PFPS表面光滑，呈片狀結構，許多不規則的交聯球在PFPS表面形成網絡結構，以產生強大的分子間作用力。Se-PFPS多呈現不規則的斷裂碎片，相對分散，表面粗糙，有許多不規則孔洞。形態學觀察表明硒酸改性對PFPS結構影響很大，不僅削弱了多糖分子之間交聯程度，還改變了它們的形態[28]。

圖3 PFPS和Se-PFPS的SEM圖Fig.3 SEM photographs of PFPS and Se-PFPS

2.4 粒徑及分子質量分析

PDI越小，表明水溶液中多糖顆粒分布越窄，均一性越好。當PDI值小于1時，表明該物質分子質量均一性良好；當PDI值大于1時，表明該物質分子質量均一性差[29]。從圖4a和表3可得，硒化修飾后PFPS的PDI從0.71±0.06降至0.60±0.02，可以認為2 種多糖是一種單分散的同質多糖。另外，與PFPS相比，Se-PFPS平均粒徑顯著減小，表明硒的結合導致糖鏈結合或纏繞，減小了顆粒尺寸[30]。圖4b顯示了PFPS與Se-PFPS的主要單糖組分分子質量。結果表明，Se-PFPS各組分出峰時間都早于PFPS，表明Se-PFPS分子質量大于PFPS，這一結果與Lee等[31]研究結果一致，在不同條件下硒化修飾的榆果果膠多糖（6.080×1012～6.557×1012Da）具有比未修飾果膠多糖（4.903×1012Da）更大的分子質量，其可能是由于C6上的—OH被—HSeO3所代替。

圖4 PFPS和Se-PFPS的粒徑分布圖（a）和高效液相色譜圖（b）Fig.4 Particle size distribution (a) and HPLC chromatograms (b) of PFPS and Se-PFPS

表3 PFPS和Se-PFPS的粒徑、PDI和主要組分出峰時間Table 3 Particle sizes,PDIs and peak times of PFPS and Se-PFPS

2.5 XRD分析

如圖5所示，PFPS在衍射角19.92°觀察到明顯分散峰，而Se-PFPS分別在22.68°和28.69°處存在少量分散吸收峰，表明PFPS比Se-PFPS更容易形成單晶形態，這可能是由于Se-PFPS形成了具有不同緊密性含硒的新聚合物[32]。此外，2 種多糖弱的衍射吸收峰表明它們不能形成大量單晶，多以多晶和非晶形式存在。

圖5 PFPS和Se-PFPS的XRD分析Fig.5 XRD analysis of PFPS and Se-PFPS

2.6 熱穩定性分析

圖6顯示PFPS與Se-PFPS的失重曲線和失重率曲線。PFPS與Se-PFPS分別有3 個分解階段，第1個階段為30～150 ℃，歸屬于水分蒸發；第2個階段為150～300 ℃，歸屬于多糖側鏈降解；第3個階段為300～800 ℃，歸屬于多糖主鏈降解，且500～800 ℃，2 種多糖質量基本穩定[33]。但相比之下，PFPS質量高于Se-PFPS，表明PFPS更穩定。

圖6 PFPS和Se-PFPS的熱穩定性分析Fig.6 TGA analysis of PFPS and Se-PFPS

3 結論

本實驗從紫蘇葉中提取PFPS，并采用HNO3-Na2SeO3法獲得硒化-紫蘇雜多糖。通過FTIR、HPGPC、SEM，XRD和TGA等分析對PFPS和Se-PFPS進行理化性質和結構比較。結果表明硒以硒酯的形式取代了PFPS中C6位羥基，實現了無機硒向有機硒的轉變。同時，硒酸改性減小了多糖顆粒尺寸，增加了多糖分子質量，改變了多糖形態特征和晶體狀態。